微藻誘變育種研究進(jìn)展?

梁 英， 閆譯允， 賴秋璇， 田傳遠(yuǎn)， 胡乃霞， 王 玥

(海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國海洋大學(xué))，山東 青島 266003)

微藻種類繁多、光合作用效率高、生長周期短、富含油脂、蛋白、多糖、色素、維生素等多種活性物質(zhì)[1-3]，近年來在農(nóng)業(yè)、生態(tài)環(huán)境保護(hù)、生物能源開發(fā)及食品藥品等領(lǐng)域備受青睞[4-7]。隨著微藻規(guī)?；B(yǎng)殖的不斷擴(kuò)大，提高養(yǎng)殖產(chǎn)量和質(zhì)量的關(guān)鍵問題是如何獲得具有高產(chǎn)、高活性物質(zhì)含量、抗污染能力強(qiáng)、抗逆境脅迫等優(yōu)良性狀的微藻種質(zhì)。因此，必須加強(qiáng)不同微藻藻種的育種技術(shù)研究，提高育種效率，從而獲得性狀優(yōu)良的微藻種質(zhì)，以實(shí)現(xiàn)微藻規(guī)?；a(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

微藻誘變育種是指采用各種物理以及化學(xué)誘變的方法引起藻種遺傳性狀產(chǎn)生變異，再通過定向篩選、培育以獲得所需要的優(yōu)良突變藻株的育種技術(shù)[8]。與傳統(tǒng)的選擇育種方法相比，誘變育種周期短、突變率高，在提高產(chǎn)量、增強(qiáng)抗性、改善微藻品質(zhì)等方面潛力巨大[9-10]。誘變育種技術(shù)已廣泛應(yīng)用于富含生物活性成分的微藻、生物能源微藻等經(jīng)濟(jì)微藻中，成為提高育種效率、獲得優(yōu)良微藻種質(zhì)的主要手段。國內(nèi)外已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，運(yùn)用誘變育種技術(shù)已成功獲得高活性物質(zhì)含量、高油脂產(chǎn)量及耐低溫、高溫等優(yōu)良性狀的藻種[11-14]。但目前可實(shí)現(xiàn)規(guī)?；B(yǎng)殖的微藻種類十分有限，且表型性狀的不穩(wěn)定性也會對微藻生產(chǎn)造成影響，因此，必須不斷地對微藻誘變育種技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)和創(chuàng)新。本文綜述了物理誘變、化學(xué)誘變、復(fù)合誘變技術(shù)的誘變機(jī)理及其在微藻育種中的應(yīng)用現(xiàn)狀，并對微藻誘變育種中存在的問題進(jìn)行了總結(jié)及展望，以期為微藻種質(zhì)資源開發(fā)利用以及推動微藻誘變育種研究提供參考。

1 物理誘變育種

物理誘變主要通過各種輻射誘變劑對微藻進(jìn)行輻照處理，誘發(fā)染色體異位、缺失、重組或斷裂等，從而引起后代性狀產(chǎn)生變異[15-16]。目前使用較廣泛的輻射源有：紫外線、射線、重離子束等。隨著誘變技術(shù)的不斷發(fā)展，許多有效的誘變源如激光、超聲波、太空誘變等也被應(yīng)用于微藻的育種中[17-19]。此外，常壓室溫等離子體(Atmospheric and room temperature plasma，ARTP)作為一種新型的誘變育種手段，也已成功應(yīng)用于微藻誘變育種的研究中[20]。

1.1 紫外線誘變

紫外(Ultraviolet，UV)誘變育種是目前使用最久、應(yīng)用最廣的一種物理誘變方法[21]。紫外線可穿透藻細(xì)胞直接作用于DNA，當(dāng)DNA分子吸收紫外光后，易導(dǎo)致單鏈相鄰或雙鏈相對應(yīng)的兩個(gè)胸腺嘧啶形成二聚體，DNA在進(jìn)行解旋、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄時(shí)，由于嘧啶二聚體不能進(jìn)行分離，從而阻礙堿基的正常配對，使基因發(fā)生突變[22-24]。紫外誘變因操作簡單、低成本、高突變率、高安全性等特點(diǎn)，在微藻誘變育種研究中得到廣泛應(yīng)用[25-26]。國內(nèi)外已有大量研究報(bào)道，利用紫外線對不同微藻進(jìn)行誘變并獲得了大量性狀優(yōu)良的突變藻株。如三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)、魏氏真眼點(diǎn)藻(Eustigmatosvischeri)、小球藻(Chlorellasp.)、柵藻(Scenedesmussp.)、四爿藻(Tetraselmissuecica)、集胞藻PCC 6803(Synechocystissp. PCC 6803)等，均已利用紫外誘變育種技術(shù)成功獲得了具有高生物量、高油脂產(chǎn)量、高EPA及高精氨酸含量的優(yōu)良突變株，具體研究成果見表1。

表1 紫外線誘變在微藻育種中的研究成果Table 1 Research achievements of UV mutagenesis in microalgae breeding

1.2 射線誘變

射線是一種能量高、穿透力強(qiáng)的電離輻射源，常見的有X射線、γ射線等[35-36]。利用射線輻射微藻細(xì)胞，可直接或間接引起遺傳物質(zhì)發(fā)生改變。一方面，電離輻射可直接破壞堿基、糖-磷酸、脫氧核糖等化學(xué)鍵，導(dǎo)致染色體發(fā)生斷裂、重復(fù)、缺失等突變，此外，輻射可使藻細(xì)胞內(nèi)的水、有機(jī)分子等組分發(fā)生電離產(chǎn)生具有極強(qiáng)還原或氧化特性的自由基，從而間接引起染色體畸變[37]。與紫外誘變相比，高能量、強(qiáng)穿透力的射線輻射更易造成DNA序列的改變，因此在微藻誘變育種中具有更高的突變效率。γ射線輻射因其重演性較好、輻照條件易于控制等優(yōu)點(diǎn)成為微藻育種中最常用的誘變源之一，尤其是60Co-γ射線在寇氏隱甲藻(Crypthecodi-niumcohnii)、柵藻、微擬球藻(Nannochloropsisoculata)、雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)等富含活性物質(zhì)的微藻誘變育種研究中成效顯著，已培育出許多高油脂、高DHA、高蝦青素含量及高耐受CO2等性狀優(yōu)良的株系，具體見表2。

表2 60Co-γ射線誘變在微藻育種中的研究成果Table 2 Research achievements of 60Co-γ ray mutagenesis in microalgae breeding

1.3 重離子束誘變

重離子束是一種具有高傳能線密度(Linear energy transfer，LET)的人工粒子輻射源，應(yīng)用于育種研究的重離子主要通過加速器將原子的核外電子部分或全部剝離掉再加速而成，常見的有碳、氮、鐵等重離子束[43]。重離子束的LET值遠(yuǎn)高于X、γ等傳統(tǒng)射線，能夠造成細(xì)胞核內(nèi)DNA分子更致密的損傷，且多為DNA雙鏈的平頭末端斷裂、大片段缺失、DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)等難以重組修復(fù)的團(tuán)簇?fù)p傷[44-47]。因此，重離子束輻射誘變能夠在具有較高存活率的情況下獲得更高的突變效率。隨著核物理學(xué)的不斷發(fā)展，重離子束輻照在高等植物誘變育種方面取得了很大的進(jìn)展[48-50]。近年來，在微藻育種研究中也逐漸開展了重離子輻射誘變技術(shù)，并已成功應(yīng)用于微擬球藻、柵藻、羊角月牙藻(Selenastrumcapricornutum)、三角褐指藻等的育種研究中，獲得的突變株的生物量、油脂產(chǎn)量、巖藻黃質(zhì)含量、光合效率等均顯著提高，表3概述了該技術(shù)在以上微藻育種中的具體研究成果。

表3 重離子束輻射誘變在微藻育種中的研究成果Table 3 Research achievements of heavy-ion irradiation mutagenesis in microalgae breeding

1.4 常壓室溫等離子體誘變

常壓室溫等離子體誘變(Atmospheric and room temperature plasma，ARTP)是一種安全高效、環(huán)境友好的新型誘變育種手段。ARTP產(chǎn)生的放電均勻、穩(wěn)定的高濃度活性粒子，可直接穿透細(xì)胞造成DNA分子損傷，引起突變，還可以通過破壞整個(gè)細(xì)胞以啟動細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)等多種修復(fù)機(jī)制，這些不精確的修復(fù)會觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的調(diào)控系統(tǒng)，從而引起基因表達(dá)方式及代謝途徑的改變[57-58]。因此，利用ARTP誘變技術(shù)較易獲得具有良好遺傳穩(wěn)定性的突變株。此外，ARTP誘變育種突變率高，且對DNA造成最大損傷的情況下細(xì)胞仍能保持活性，從而為育種工作提供了更多的突變資源[59]。目前，ARTP誘變技術(shù)已成功應(yīng)用于微藻的突變，在小球藻、雨生紅球藻、螺旋藻(Spirulinasp.)、湛江等鞭金藻(Isochrysiszhanjiangensis)、寇氏隱甲藻等的育種研究中均取得了顯著成效，獲得了具有高生物量、高油脂產(chǎn)量及高多糖、高氨基酸、高蝦青素含量等多種優(yōu)良性狀的突變藻種，應(yīng)用前景十分廣闊。該技術(shù)在以上微藻育種研究中取得的具體成果見表4。

1.5 激光誘變

激光具有單色性好、方向性好、高光亮性和高相干性等優(yōu)點(diǎn)，將激光作為輻射源應(yīng)用于微藻育種，其主要通過對藻細(xì)胞產(chǎn)生光、光壓、熱及電磁場等綜合理化效應(yīng)使DNA和RNA結(jié)構(gòu)發(fā)生突變，從而導(dǎo)致性狀改變以達(dá)到育種目的。一定頻率的激光輻射微藻后，在上述各效應(yīng)的疊加作用下，藻細(xì)胞DNA分子產(chǎn)生斷裂、交聯(lián)、聚合等一系列突變，RNA分子結(jié)構(gòu)也隨之產(chǎn)生變化，引起酶的抑制或激活，導(dǎo)致基因表達(dá)和藻細(xì)胞代謝途徑改變，最終產(chǎn)生突變株。近年來，隨著激光誘變育種設(shè)備的不斷研制與廣泛應(yīng)用，使得激光誘變育種效率大大提高，且操作更加簡便，如CO2、He-Ne、Nd: YAG等激光器在微擬球藻、雨生紅球藻、小球藻、紫球藻(Porphyridiumcruentum)等的育種中已取得了顯著的成效，突變藻株的油脂、蝦青素、胞外多糖含量等均顯著提高，具體研究成果見表5。

表4 ARTP誘變在微藻育種中的研究成果Table 4 Research achievements of ARTP mutagenesis in microalgae breeding

1.6 超聲波誘變

超聲波是一種頻率高、功率大、穿透力強(qiáng)的機(jī)械波，在傳播過程中可與介質(zhì)發(fā)生作用產(chǎn)生熱、機(jī)械和空化等理化效應(yīng)。將超聲波應(yīng)用于微藻誘變育種，其主要通過空化效應(yīng)作用于微藻細(xì)胞，即超聲波在傳播時(shí)由于聲壓發(fā)生劇烈變化從而產(chǎn)生空化氣泡，這些空化氣泡在瞬間爆破的過程中，釋放出巨大能量，導(dǎo)致局部產(chǎn)生瞬時(shí)極端高溫、高壓、放電現(xiàn)象，并產(chǎn)生大量自由基[71]。這一系列繼發(fā)效應(yīng)可導(dǎo)致藻細(xì)胞遺傳物質(zhì)、酶活性及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變，從而使基因表達(dá)過程、胞內(nèi)外物質(zhì)交換及信息傳遞、代謝途徑等改變。已有研究表明，超聲波對微藻生長、光合作用、油脂合成及轉(zhuǎn)化均有顯著影響[71-73]，隨著超聲波特性和誘變機(jī)理研究的不斷深入，超聲波微藻誘變育種取得了一定成效。朱甲妮[74]在頻率18 kHz、功率20 W和時(shí)間10 min的超聲條件下誘變柵藻，誘變株的油脂產(chǎn)量與出發(fā)株相比提高了26%；肖若楠[75]用頻率20 kHz、功率20 W的超聲波處理柵藻30 min，誘變株的細(xì)胞干重和油脂含量分別比出發(fā)株提高了33.3%和37.2%。韓飛[18]將處于對數(shù)生長末期的四尾柵藻進(jìn)行頻率40 kHz、功率200 W和時(shí)間20 min的超聲處理，突變株的油脂含量比原始株提高了57.5%。實(shí)踐表明，超聲頻率、處理時(shí)間不同隨之產(chǎn)生的效應(yīng)程度也不同，且不同微藻種類的耐受性也各不相同，因此，選擇合適的超聲參數(shù)和劑量是育種成功的關(guān)鍵。

表5 激光誘變在微藻育種中的研究成果Table 5 Research achievements of laser mutagenesis in microalgae breeding

1.7 太空誘變

微藻太空誘變育種是指通過返回式航天器如衛(wèi)星、飛船等將藻種搭載到宇宙空間，利用強(qiáng)輻射、微重力等空間條件實(shí)現(xiàn)微藻的有益突變。宇宙射線種類多且穿透力強(qiáng)，當(dāng)高能射線輻射微藻細(xì)胞后極易導(dǎo)致DNA分子損傷，而空間微重力在DNA損傷的情況下阻礙了DNA修復(fù)系統(tǒng)的啟動與運(yùn)轉(zhuǎn)，最終使基因產(chǎn)生變異[76]。劉波等[19]通過太空搭載小球藻，獲得了一株油脂和脂肪酸含量分別比出發(fā)株增加6.5%和3.76%的優(yōu)良突變株。譚麗等[77]經(jīng)過太空搭載鈍頂螺旋藻成功選育出優(yōu)良突變株H11，與原始株相比，H11的生物量、總多糖產(chǎn)率分別提高了15.39%和176.50%。太空誘變技術(shù)作為一種有效的育種手段，具有突變頻率高、變異穩(wěn)定性好、多數(shù)性狀可穩(wěn)定遺傳等優(yōu)點(diǎn)，但由于空間條件難得且難以模擬，從而限制了太空誘變在微藻育種中的應(yīng)用。

2 化學(xué)誘變育種

化學(xué)誘變是一種利用化學(xué)誘變劑處理微藻以獲得突變藻株的育種方法，具有突變范圍廣、易操作、成本低等特點(diǎn)[20]。目前廣泛應(yīng)用于微藻育種的化學(xué)誘變劑主要是一些烷化劑，如甲基磺酸乙酯(Ethyl methane sulfonate，EMS)、亞硝基胍(N-methyl-N’-Nitro-nitrosoguanidine，NTG或MNNG)等。這些烷化劑通常具有一個(gè)或多個(gè)高活性的烷化基團(tuán)，在誘變過程中通過取代DNA分子中的氫原子以造成堿基的錯(cuò)配、置換等，從而引起突變[78]。另外，烷化基團(tuán)還可與DNA結(jié)構(gòu)中的氧原子發(fā)生烷化反應(yīng)，形成極易水解的磷酸酯從而造成DNA鏈的斷裂[79]。與物理誘變相比，化學(xué)誘變多為基因的點(diǎn)突變，對微藻的基因組損傷較小，且突變位點(diǎn)具有特異性。近年來，柵藻、小球藻、微擬球藻、波氏真眼點(diǎn)藻(Eustigmatospolyphem)、三角褐指藻、小新月菱形藻(Nitzschiaclosteriumf.minutissima)、節(jié)旋藻(Arthrospirasp.)、纖細(xì)裸藻(Euglenagracilis)等均已利用化學(xué)誘變技術(shù)成功獲得了耐高溫、低溫及高產(chǎn)蝦青素、油脂、EPA、類胡蘿卜素、蛋白質(zhì)等的優(yōu)良突變株，詳見表6。

表6 化學(xué)誘變在微藻育種中的研究成果Table 6 Research achievements of chemical mutagenesis in microalgae breeding

3 復(fù)合誘變育種

復(fù)合誘變是指采用兩種或兩種以上的誘變方法對微藻進(jìn)行育種，可以是兩種及以上物理誘變方法或化學(xué)誘變方法，也可以物理誘變與化學(xué)誘變等方法相結(jié)合。單一誘變育種產(chǎn)生的基因突變往往比較單一，運(yùn)用復(fù)合誘變方法有利于打破突變局限性，獲得更多的正突變藻株。目前應(yīng)用在微藻育種中的復(fù)合誘變方法主要有兩種，一種是使用多種方法依次誘變處理出發(fā)藻株，最后篩選優(yōu)良藻株。另外一種復(fù)合誘變方法是每次誘變處理后都進(jìn)行篩選，即第一種方法誘變處理后篩選出優(yōu)良藻株，然后對篩選出的優(yōu)良藻株進(jìn)行第二種方法誘變處理，再次進(jìn)行篩選。許多研究表明，與單一誘變相比，復(fù)合誘變可以增加基因突變類型，拓展突變譜，且誘變方法順序不同獲得的基因突變類型也往往不同，因此，復(fù)合誘變更有利于篩選獲得性狀優(yōu)良的突變藻株[92-93]。目前，復(fù)合誘變主要應(yīng)用于原殼小球藻(Chlorellaprotothecoides)、埃氏小球藻(Chlorellaemersonii)等富含油脂藻種的育種研究中，獲得的突變株其油脂含量顯著提高，表7概述了復(fù)合誘變育種在以上微藻中的具體成果。

表7 復(fù)合誘變在微藻育種中的研究成果Table 7 Research achievements of combined mutagenesis in microalgae breeding

4 不同誘變育種方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較

在微藻育種中應(yīng)用物理誘變方法，具有簡單易操作、且安全性高的優(yōu)點(diǎn)，但ARTP、射線、太空誘變等物理誘變方法，存在設(shè)備昂貴、維護(hù)成本高、條件難得、難以推廣的弊端；紫外誘變成本雖低，但存在突變單一且不穩(wěn)定的缺點(diǎn)。化學(xué)誘變方法成本低，但有利突變少，且大多數(shù)誘變劑具有強(qiáng)烈致癌毒性，對環(huán)境及研究人員傷害較大。復(fù)合誘變方法可以增加基因突變類型，拓展突變譜，且變異穩(wěn)定性好，但操作復(fù)雜，耗時(shí)費(fèi)力。因此，微藻誘變育種技術(shù)還需不斷改進(jìn)和創(chuàng)新。表8總結(jié)了不同誘變育種方法的優(yōu)缺點(diǎn)。

表8 不同誘變育種方法的優(yōu)缺點(diǎn)Table 8 Advantages and disadvantages of different mutation breeding methods

5 問題與展望

近年來，微藻誘變育種研究已經(jīng)取得了較大進(jìn)展，不同的誘變育種方法在提高突變效率、創(chuàng)造微藻新種質(zhì)方面均發(fā)揮了重要作用，但目前仍存在許多問題制約著微藻種質(zhì)資源開發(fā)利用，阻礙了微藻誘變育種研究進(jìn)程。①不確定性：突變方向不確定，具有隨機(jī)性，無法定向獲得所需要的目的性狀，且有意義的突變較少。②不可重復(fù)性：不論是物理誘變還是化學(xué)誘變，不同劑量、不同批次、不同時(shí)間所產(chǎn)生的突變率和突變方向各有不同，難以重復(fù)。③矛盾性：突變株品質(zhì)的提高往往伴隨著產(chǎn)量的下降，即品質(zhì)和產(chǎn)量相互矛盾。④盲目性：對大部分誘變方法作用機(jī)理的研究比較淺顯，育種工作存在一定的盲目性。⑤篩選困難：利用傳統(tǒng)方法在產(chǎn)生的大量突變藻株中篩選出目的藻株存在工作量大、耗資、耗力、耗時(shí)等缺點(diǎn)，急需建立高效、準(zhǔn)確的高通量篩選方法。因此，如何進(jìn)行高效、定向誘變育種，提高有利突變，準(zhǔn)確快速篩選出目的藻株是今后研究的重點(diǎn)與難點(diǎn)。

解決微藻誘變育種過程中存在的問題，一方面需要研究人員在實(shí)際的育種工作中結(jié)合不同微藻的特性來選擇適合的誘變方法，綜合運(yùn)用多種有效的誘變技術(shù)，取長補(bǔ)短，以實(shí)現(xiàn)選育效率的最優(yōu)化。另一方面，應(yīng)將微藻誘變育種與當(dāng)前先進(jìn)的生物技術(shù)相結(jié)合，如可以通過基因組重測序技術(shù)、轉(zhuǎn)錄組測序、蛋白質(zhì)組分析等技術(shù)從DNA、蛋白水平上揭示表型與基因型之間的聯(lián)系，掌握誘變作用機(jī)理，從而實(shí)現(xiàn)高效、定向誘變育種。此外，光學(xué)傳感器檢測技術(shù)，如紅外光譜分析(Infrared spectra analysis)[96-97]、核磁共振(Nuclear magnetic resource，NMR)[98]、拉曼光譜[99-101]等在微藻表型檢測方面已進(jìn)行了較多的研究，以及近年來出現(xiàn)的分子標(biāo)記技術(shù)，這些技術(shù)的發(fā)展為建立目的突變藻株的高效、定向篩選奠定了基礎(chǔ)。相信在科學(xué)快速發(fā)展的推動下，微藻誘變育種研究將進(jìn)入高速發(fā)展階段。