UPLC與HPLC測定注射用生長抑素含量的方法學研究

付建興 彭利洪 王燕玲

摘要：比較UPLC與HPLC測定注射用生長抑素含量的差異。UPLC色譜條件為：Waters C18柱（2.1×50 mm，1.7μm）、流速0.2 mL·min-1、進樣體積2 μL;HPLC色譜條件為：Welch AQ-C18柱（250×4.6mm，5 μm）、流速1.5 mL·min-1、進樣體積20 μL。兩者流動相和檢測波長均為1.1%磷酸溶液（pH2.3）-乙腈（75：25）和215nm。UPLC和HPLC定量限分別為0.123 ng和126.8 ng，說明UPLC靈敏度更高，運行時間縮短至HPLC的1/3，提高檢驗效率、節(jié)約檢驗試劑、減少廢液產(chǎn)生。線性試驗證明溶液濃度在0.05～0.15mg·mL-1范圍，主峰面積能夠與進樣濃度呈良好的線性關(guān)系。準確度試驗UPLC與HPLC測定的含量平均值分別為99.83%和100.43%，RSD為0.25%和0.36%，符合規(guī)定要求。重復性試驗UPLC與HPLC測定的主峰面積RSD均為0.2%，說明系統(tǒng)重復性良好。因此UPLC測定注射用生長抑素含量可靠、高效，符合相關(guān)要求。

關(guān)鍵詞：超高效液相色譜（UPLC）;高效液相色譜（HPLC）;注射用生長抑素;含量

生長抑素最早由Krulich等在大鼠下丘腦發(fā)現(xiàn)，其化學組成為Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH，是一種環(huán)狀的神經(jīng)調(diào)節(jié)肽[1-5]。注射用生長抑素（somatostatin for injection）主要用于嚴重急性食道靜脈曲張出血，嚴重急性胃或十二指腸潰瘍出血，或并發(fā)性急性糜爛性胃炎或出血性胃炎;胰腺外科手術(shù)后并發(fā)癥的預防和治療;胰、膽和腸瘺的輔助治療;糖尿病酮癥酸中毒的輔助治療[2]。高效液相色譜儀（HPLC）因其柱效高、分析速度快、靈敏度高等特點，在現(xiàn)階段的醫(yī)藥、食品、化工等領(lǐng)域的檢測中起著重要作用，但隨著人們對藥品質(zhì)量要求的標準不斷提高，藥品UPLC的檢驗方式很快被人們所接受，藥品質(zhì)量的控制覆蓋了藥品研發(fā)設(shè)計、生產(chǎn)（中間體）、出廠（成品）、市場流通等全部環(huán)節(jié)，快速獲得檢測結(jié)果至關(guān)重要[3]。相對HPLC，超高效液相色譜儀（UPLC）具有更高的分離度、更快的流速和更高的靈敏度，即UPLC法在提高檢出能力的條件下，檢測時間更短，尤其在多肽類大分子藥物的檢測以及臨床測定血藥濃度的過程中優(yōu)勢更為明顯[4]，對于生產(chǎn)企業(yè)減少檢驗等待時間，在保證半成品質(zhì)量的前提下，能夠大幅度節(jié)約企業(yè)綜合能耗、節(jié)約成本，同時減少流動相使用量，降低環(huán)保壓力。本研究針對注射用生長抑素含量測定分別用UPLC與HPLC法進行對比研究，從而確認UPLC法在注射用生長抑素含量檢測中優(yōu)勢。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料及試劑

生長抑素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：140711-201705），注射用生長抑素（海南中和藥業(yè)股份有限公司，批號：20180501），磷酸（分析純），乙腈（色譜級），三乙胺（色譜級），超純水。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

Acquity UPLC H-Class型超高效液相色譜儀，美國沃特世公司;Alliance e2695型高效液相色譜儀，美國沃特世公司;CP225D型電子分析天平，德國賽多利斯集團;PB-21型酸度計，德國賽多利斯集團。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液制備

取生長抑素對照品約10 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，即得0.1 mg·mL-1溶液作為對照品溶液，并于2～8℃條件下保存;取注射用生長抑素適量，加水制成每1 mL中約含生長抑素0.1 mg的溶液，搖勻，作為供試品溶液，備用。

1.2.2 色譜條件

UPLC法色譜條件：Waters C18色譜柱（2.1×50 mm，1.7 μm），流速0.2 mL·min-1，進樣體積2 μL;HPLC法色譜條件：Welch AQ-C18色譜柱（250×4.6 mm，5 ?m），流速1.5 mL·min-1，進樣體積20 μL。

以上兩種色譜系統(tǒng)的流動相均為1.1%磷酸溶液（取磷酸11 mL，加水800 mL，用三乙胺調(diào)節(jié)pH值至2.3，用水稀釋至1000 mL）-乙腈（V磷酸溶液：V乙腈= 75：25），檢測波長均為215 nm。

1.2.3 方法研究[5]

1.2.3.1專屬性

取溶劑-水、對照品溶液和供試品溶液，按1.2.2色譜條件，分別進行UPLC、HPLC分析，記錄色譜圖。

1.2.3.2精密度（進樣精密度、中間精密度）

取對照品溶液，按1.2.2色譜條件，分別進行UPLC、HPLC分析，連續(xù)進樣6針，記錄色譜圖，計算UPLC、HPLC主峰面積RSD%。在不同日期、不同分析人員，按1.2.1項下重新配制對照品溶液1份，分別采用UPLC、HPLC按1.2.2色譜條件，連續(xù)進樣6針，記錄色譜圖，計算UPLC、HPLC主峰面積RSD%。

1.2.3.3線性與范圍、定量限（LOQ）

UPLC不同濃度供試品溶液：取生長抑素對照品18.75 mg，置5 mL量瓶中，加水溶解稀釋至刻度，搖勻，精密量取0.33、0.50、0.65、0.83、1.00 mL，分別置25 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，制成0.05、0.075、0.10、0.125、0.15 mg·mL-1供試品溶液，備用。

HPLC不同濃度供試品溶液：取生長抑素對照品20 mg，置10 mL量瓶中，加水溶解稀釋至刻度，搖勻，精密量取0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL，分別置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，制成0.04、0.08、0.12、0.16、0.20mg·mL-1供試品溶液，備用。

按1.2.2色譜條件，采用UPLC和HPLC法，精密量取以上供試品溶液，注入色譜儀，記錄色譜圖，以主峰面積與濃度進行線性回歸分析。

取線性最低濃度的對照品溶液逐倍稀釋，按信噪比（S/N）約為10：1時相應(yīng)的濃度和注入色譜儀的體積，計算定量限。

1.2.3.4 準確度

精密稱取生長抑素對照品約16、20、24 mg各三份，分別置于200 mL量瓶中，相應(yīng)加入0.7、0.8、1.0 mL的20%甘露醇注射液，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即配制標示濃度（0.1 mg·mL-1）的80%、100%、120%供試品溶液（0.08、0.10、0.12 mg·mL-1）。另精密稱取生長抑素對照品10 mg，置100 mL量瓶中，加水溶解并至刻度，搖勻，制備每1 mL中約含0.1 mg的溶液，作為對照品溶液。取以上供試品溶液和對照品溶液，采用UPLC和HPLC法分析，記錄色譜圖，計算回收率。

1.2.3.5耐用性

耐用性試驗是考察在色譜條件有微小改變、儀器波動的情況下，測定主成分含量受到的影響程度，從而證明檢測方法的耐用性強弱。一般色譜條件調(diào)整的項目為不同色譜柱、流速±10%、柱溫±5℃等。UPLC法色譜條件的改變包括色譜柱批號（EA904和EB539）、流速（0.15、0.20、0.25 mL·min -1）及柱溫（25、30、35 ℃）;HPLC法色譜條件的改變包括色譜柱品牌（Welch AQ，CAPCELL PAK）、流速（1.3、1.5、1.7 mL·min -1）、柱溫（25、30、35 ℃）。在UPLC和HPLC色譜條件下，改變以上單因素色譜條件，取對照品溶液、供試品溶液，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算注射用生長抑素含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 專屬性

從圖1-圖3可以看出，在UPLC和HPLC色譜條件下，溶劑峰分別在1.0、3.0 min之前出峰（圖1），對照品溶液主峰保留時間為3.696、12.627 min（圖2）以及供試品溶液主峰保留時間為3.687、12.526 min（圖3）。專屬性證明溶劑峰對主峰無干擾，供試品溶液與對照品溶液主峰保留時間一致，專屬性好，可用專屬鑒別試驗。與HPLC法比較，UPLC理論板數(shù)為HPLC兩倍，運行時間縮短至HPLC分析時間1/3。與張承軍等文獻[2]比較，運行時間基本一致。

2.2 精密度（進樣精密度、中間精密度）

從表1可以看出，進樣精密度UPLC、HPLC法測定的主峰面積RSD%均為0.2%小于2.0%。中間精密度UPLC、HPLC法的主峰面積RSD%分別為0.1%和0.9%，均小于2.0%。證明UPLC和HPLC系統(tǒng)精密度均良好。

2.3 線性與范圍、定量限（LOQ）

從表2可以看出，UPLC和HPLC法的檢測范圍分別為0.05～0.15 mg·mL-1和0.04～0.20 mg·mL-1，主峰面積與供試品溶液濃度呈良好的線性關(guān)系（圖4），其相關(guān)系數(shù)均大于0.999;而定量限分別為0.123ng和126.8ng，說明UPLC的靈敏度明顯高于HPLC。李岑等文獻[3]表明UPLC的高靈敏度在臨床試驗過程中檢測血藥濃度具有很大優(yōu)勢，HPLC無法準確測定低濃度藥物含量。

2.4 準確度

從表3可以看出，UPLC和HPLC測定注射用生長抑素含量，其平均值分別為99.83%和100.43%，均在規(guī)定的98.0%～102.0%范圍內(nèi);兩種方法測定含量結(jié)果的RSD%分別為0.25%和0.36%均小于2.0%，說明兩種測定方法的準確度均較好。與張承軍等文獻[2]比較，平均值99.1%，與本文一致，但RSD為1.7%接近2.0%，則說明測定本品含量波動較大。

2.5 耐用性

測得含量均在90.0%～110.0%，且每個色譜體系不同色譜條件微調(diào)后檢測結(jié)果的RSD%分別為0.48%和0.65%均小于2.0%，具體詳見表4.。

3.結(jié)論

UPLC法測定注射用生長抑素含量具有專屬性好、結(jié)果準確、操作簡單等優(yōu)點，并且大大縮短了檢測時間。該法既保障了藥品質(zhì)量，又降低了生產(chǎn)成本，是一個可靠、準確、可重復的檢測方法，更適用于注射用生長抑素的質(zhì)量控制。

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