西番蓮PeERG基因克隆及其表達(dá)模式分析

樊航 冉娜 李安定 張洪亮 胥猛

摘 要： ERA（Eecherichia coli Ras-like protein）蛋白是與已知異三聚體G蛋白和小分子G蛋白不同的一種新的GTP結(jié)合蛋白。為了在木本植物中開(kāi)展其同源基因ERG（ERA-like GTPase）克隆和功能驗(yàn)證的相關(guān)研究，該文首次在西番蓮新品種‘平塘1號(hào)中采用cDNA末端快速克?。≧ACE）技術(shù)克隆鑒定1個(gè)ERG基因。結(jié)果表明：西番蓮PeERG基因cDNA全長(zhǎng)為1 518 bp，包括1 260 bp的開(kāi)放閱讀框、38 bp的5′-端非翻譯區(qū)和220 bp的3′-端非翻譯區(qū)，該基因編碼蛋白由420個(gè)氨基酸殘基組成，其二級(jí)結(jié)構(gòu)含有豐富的α-螺旋和延伸鏈。PeERG蛋白不含跨膜區(qū)域，也不存在信號(hào)肽酶切位點(diǎn)，既在其N(xiāo)端有典型的GTPase保守結(jié)構(gòu)域（GTPase domain）又在其C端有獨(dú)特的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（KH domain）。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，西番蓮PeERG蛋白和水稻OsERG1、擬南芥AtERG1、大腸桿菌ERA位于同一進(jìn)化分枝。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)揭示PeERG基因在西番蓮根、莖、葉、花、果中均有表達(dá)，葉中表達(dá)最高;同時(shí)該基因響應(yīng)低溫脅迫信號(hào)，其表達(dá)呈動(dòng)態(tài)變化模式。該研究首次鑒定和描述了木本植物西番蓮的ERG基因，為深入挖掘西番蓮特異基因資源提供參考，也有助于進(jìn)一步探究ERG基因在植物中的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制。

關(guān)鍵詞： ERA蛋白， 西番蓮， RACE， 表達(dá)模式， G蛋白， 低溫脅迫

中圖分類(lèi)號(hào)： Q943 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

文章編號(hào)： 1000-3142（2020）04-0509-09

Abstract： Different from the known trimetical G protein and small GTPase， ERA （Eocherichia coli Ras-like protein） is a new GTP-binding protein. In order to study cloning and functional verification of ERG （ERA-like GTPase） homologous gene in woody plants， one ERG gene was firstly isolated from a cold-tolerant variety of Passiflora edulis （‘Pingtang 1） through the rapid amplification of cDNA ends （RACE）. The resutls were as follows： The full-length sequence of PeERG cDNA was 1 518 nucleotides， including a 1 260 bp open reading frame （ORF）， flanked by a 38 bp 5′-untranslated region （UTR） and a 220 bp 3′-UTR. PeERG may encode a protein of 420 amino acids， and its secondary structure was rich in alpha helix and extended strand. PeERG protein did not contain both transmembrane region and signal peptidase cleavage site， and had two conserved domains： a GTPase domain and a KH domain. Phylogenetic tree revealed that PeERG was clustered into the same clade as OsERG1， AtERG1 and ERA. （4） Using real-time RT-PCR， the transcripts of PeERG were detectable in various tissues （roots， stems， leaves， flowers and fruits）， and its dynamic expression pattern under low temperature stress was analyzed. Altogether， one ERG gene was isolated from woody plants for the first time. These results will be valuable for further study of the biological function of ERG in plants and enrich the excellent genetic resources of Passiflora edulis.

Key words： Eecherichia coli Ras-like protein， Passiflora edulis， RACE， expression pattern， G protein， low temperature stress

西番蓮（Passiflora edulia）屬于西番蓮科西番蓮屬草質(zhì)或半木質(zhì)常綠藤本植物，花朵鮮艷優(yōu)美，果汁風(fēng)味獨(dú)特、芳香怡人，俗稱(chēng)百香果、激情果、番石榴、巴西果等，原產(chǎn)南美洲巴西至阿根廷一帶。目前作為國(guó)內(nèi)水果市場(chǎng)的“新寵”，西番蓮在臺(tái)灣、福建、廣東、廣西、海南和云南等地栽培推廣（周玉娟等，2008），其商業(yè)化品種主要有紫果、黃果、黃果與紫果雜交品種等3大類(lèi)，其中紫果品種在我國(guó)栽培面積最大（鄭文武等，2008）。西番蓮具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用效果，其果實(shí)含有多種人體必需的氨基酸、蛋白質(zhì)、還原糖、維生素等（黃葦?shù)龋?003）;其果汁占鮮果重量的35%～38%，果皮占50%～55%，種子占5%～8%;干果皮中含果膠20%，粗纖維25%（張佳艷和任仙娥，2016）。西番蓮果汁具有芒果、石榴、檸檬等多種水果的濃郁香味，風(fēng)味獨(dú)特，具有“果汁之王”的美稱(chēng)（曾紹校等，2014）。以西番蓮為主要原材料，添加適量奶粉、胡蘿卜研制出的復(fù)合保健飲料，具有高維生素高優(yōu)質(zhì)蛋白的特點(diǎn)（殷建忠等，2005）。西番蓮果皮可提取色素和果膠，也可制作食用纖維和果脯;其種子含油率達(dá)21%～25%，用其壓榨出的食用油品質(zhì)高、人體吸收率可達(dá)90%以上，有著非常高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)前景（徐智和湯利，2012）。西番蓮葉片水提物具有抗炎作用（Montanher et al.， 2007），果肉和種子中的多酚成分具有良好的抗氧化特性（Lopez-Vargas et al.， 2013）;進(jìn)一步的研究表明低劑量西番蓮地上部分提取物有較好的抗焦慮作用，而高劑量提取物有較好的鎮(zhèn)定作用（Deng et al.， 2010; Li et al.， 2011）。此外，西番蓮還具有抗腫瘤、清熱降火、止咳化痰等功能（Chen & Guo，1999; Liu et al.， 2017）。

最早在大腸桿菌（Eecherichia coli）中發(fā)現(xiàn)的ERA蛋白（E. coli Ras-like protein）普遍存在于原核和真核生物（Abu et al.， 1999），它是一類(lèi)新的GTP結(jié)合蛋白亞家族，既在其N(xiāo)端有典型的GTPase保守結(jié)構(gòu)域（GTPase domain），又在其C端有獨(dú)特的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（KH domain），從而不同于異三聚體G蛋白和單體小分子G蛋白兩個(gè)亞族（Abu et al.， 1999;楊青青，2010）。植物中存在ERA的同源蛋白ERG（ERA-like GTPase），Ingram et al.（1998）首次報(bào)道了金魚(yú)草（Antirrhinum majus）的EGR蛋白及其編碼基因。擬南芥（Arabidopsis thaliana）基因組中存在兩個(gè)同源的ERG基因，AtERG1 和AtERG2（Suwastika et al.， 2014;Cheng et al.， 2018）。此外，在煙草（Nicotiana benthamiana）、擬南芥、水稻（Oryza sativa）等高等植物中也存在包含兩個(gè)串聯(lián)重復(fù)的GTP結(jié)合結(jié)構(gòu)域（GTP-binding domain）和一個(gè)CTD結(jié)構(gòu)域（C-terminal domain）的DER蛋白（Double Era-like GTPase）（Jeon et al.， 2013;Cheng et al.， 2018）。這些ERG基因在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

植物ERG蛋白定位于線粒體或葉綠體，它們?cè)谥参锏纳L(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中扮演重要角色（Ingram et al.， 1998;Suwastika et al.， 2014;Cheng et al.， 2018）。迄今，還沒(méi)有木本植物ERG基因克隆和功能驗(yàn)證的相關(guān)報(bào)道。西番蓮抗寒新品種‘平塘1號(hào)，經(jīng)受過(guò)2008年中國(guó)南方雪凝冰凍極端天氣的考驗(yàn)，是目前選育出的唯一能在貴州喀斯特山區(qū)不經(jīng)任何保暖防護(hù)措施而在零下溫度條件能順利越冬的西番蓮新種質(zhì)。課題組前期開(kāi)展了西番蓮抗寒性狀的分子調(diào)控模式研究（Liu et al.， 2017），差異基因表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，ERG基因參與調(diào)控西番蓮低溫應(yīng)答響應(yīng)。本研究以此為切入點(diǎn)，通過(guò)RACE技術(shù)克隆西番蓮ERG基因，開(kāi)展該基因編碼蛋白質(zhì)序列的同源性比對(duì)、保守結(jié)構(gòu)域及系統(tǒng)進(jìn)化分析，并利用實(shí)時(shí)定量PCR平臺(tái)檢測(cè)該轉(zhuǎn)錄本在低溫脅迫條件下的動(dòng)態(tài)變化模式，為深入揭示ERG基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境應(yīng)答響應(yīng)中的生物學(xué)功能提供新思路。

1 材料與方法

1.1 植物材料及低溫脅迫試驗(yàn)

西番蓮抗寒新品種‘平塘1號(hào)材料來(lái)自于貴州省平塘縣西番蓮種質(zhì)資源庫(kù)（106°48′45.44″ E、 25°44′24.77″ N，海拔884 m），其不同組織器官根、莖、葉、花、果（R、S、L、Fl、Fr）采集于2年生的大田扦插苗。盆栽的1年生扦插苗，用于4 ℃低溫脅迫及25 ℃常溫恢復(fù)試驗(yàn)，并在其低溫脅迫0 h（對(duì)照）、1 h（LST-1h）、4 h（LST-4h）、8 h（LST-8h）、24 h（LST-24h）、72 h（LST-72h）及其放置于常溫恢復(fù)1 h（NTR-1h）、4 h（NTR-4h）、8 h（NTR-8h）、24 h（NTR-24h）、72 h（NTR-72h）11個(gè)時(shí)間點(diǎn)取其葉片用于目的基因在低溫脅迫及常溫恢復(fù)過(guò)程中的表達(dá)譜分析。所用三個(gè)生物學(xué)重復(fù)的上述樣品經(jīng)液氮速凍后保存于-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.2 總RNA提取與cDNA合成

采用天根生物科技（北京）有限公司提供的RNAprep Pure Plant Kit（TIANGEN，北京）抽提純化植物總RNA，并用寶生物工程（大連）有限公司的PrimeScriptTMRT Master Mix（TaKaRa，大連）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA用于后續(xù)基因表達(dá)分析。

1.3 cDNA末端快速克隆（RACE）

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期研究獲得的候選基因unigene序列（Liu et al.， 2017），設(shè)計(jì)PCR引物（表1），以‘平塘1號(hào)葉片cDNA為模板，開(kāi)展候選基因片段的PCR擴(kuò)增和測(cè)序驗(yàn)證?；跍y(cè)序驗(yàn)證獲得的基因片段序列設(shè)計(jì)RACE特異引物 （表 1）， 按照SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit操作指南進(jìn)行3′-RACE和5′-RACE巢式PCR擴(kuò)增，并經(jīng)PCR產(chǎn)物回收、連接、轉(zhuǎn)化、測(cè)序和拼接，預(yù)測(cè)其開(kāi)放閱讀框（open reading frame， ORF）。最后設(shè)計(jì)ORF擴(kuò)增引物（表 1）， 完成ORF的PCR擴(kuò)增和測(cè)序驗(yàn)證。

1.4 生物信息分析

BioEdit軟件用于3′-RACE和5′-RACE序列比對(duì)拼接，ORF預(yù)測(cè)借助于FGENESH軟件。Expasy Protparma和ProtScale在線程序用于分析蛋白質(zhì)分子量、理論等電點(diǎn)、氨基酸組成以及疏水性。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、跨膜區(qū)、信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位分別采用SPOMA、SWISS-MODEL、TMHMM 、SignalP 和Cell-Ploc2.0工具進(jìn)行。序列多重比對(duì)使用Clustal X2軟件。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建采用MEGA7軟件中的鄰接（Neighbor Joining，NJ）法進(jìn)行構(gòu)建。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR

以來(lái)源于不同組織和不同時(shí)長(zhǎng)低溫脅迫材料的cDNA為模板，使用Power SYBR Green PCR Master Mix試劑（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)），在ViiA 7平臺(tái)上開(kāi)展目的基因?qū)崟r(shí)定量PCR檢測(cè)。每個(gè)樣品三次技術(shù)重復(fù)，以eIF-5A為內(nèi)參（表1），采用 2-ΔΔCt 法進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 西番蓮PeERG基因cDNA全長(zhǎng)序列分析

經(jīng)3′-RACE和5′-RACE巢式PCR擴(kuò)增、測(cè)序拼接及其ORF預(yù)測(cè)與測(cè)序驗(yàn)證，最終獲得目的基因全長(zhǎng)cDNA序列;經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST比對(duì)，該基因與其他植物ERG基因有較高同源性，故將其命名為PeERG。西番蓮PeERG基因cDNA全長(zhǎng)為1 518 bp，包括38 bp的5′-端非翻譯區(qū)（5′-UTR）和220 bp的3′-端非翻譯區(qū)（3′-UTR），其ORF長(zhǎng)度為1 260 bp （圖1）。PeERG基因在39～41位為起始密碼子ATG，下游存在同框終止密碼子TGA和polyA尾。

PeERG基因編碼420個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其編碼蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量（MW）為 47.57 kD，理論等電點(diǎn)（pI）是5.53;帶負(fù)電荷殘基總數(shù) （Asp+Glu） 為67個(gè)，帶正電荷殘基總數(shù)（Arg+Lys）為58個(gè);不穩(wěn)定指數(shù)（instability index） 為38.35，屬于穩(wěn)定蛋白;總平均親水性（grand average of hybropathicity， GRAVY）為-0.431，預(yù)測(cè)該蛋白是親水性蛋白。蛋白質(zhì)親疏水性序列譜見(jiàn)圖2：A，PeERG蛋白質(zhì)同時(shí)具有疏水性和親水性區(qū)域，且親水性氨基酸殘基明顯多于疏水性氨基酸殘基。親水區(qū)域最高值（Score=-3.500）出現(xiàn)在第86～第91個(gè)氨基酸殘基， 疏水區(qū)域的最高值 （Score =2.689） 出現(xiàn)在第 A. 親疏水性序列譜; B. 二級(jí)結(jié)構(gòu); C. 三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。

2.2 PeERG蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

蛋白質(zhì)跨膜區(qū)（TMHMM）和信號(hào)肽分析（SignalP）結(jié)果顯示，西番蓮PeERG基因編碼蛋白質(zhì)序列不具有跨膜區(qū)域，也不存在信號(hào)肽酶切位點(diǎn)，推測(cè)其為非分泌、親水性蛋白。通過(guò)Cell-PLoc2.0在線軟件預(yù)測(cè)其定位于葉綠體。西番蓮PeERG蛋白存在有20個(gè)Ser、12個(gè) Thr和8個(gè)Tyr 等可能的磷酸化位點(diǎn)（NetPhos）;其二級(jí)結(jié)構(gòu)有37.62%的α-螺旋（alpha helix）、20.24%的延伸鏈（extended strand）、4.52%的β-轉(zhuǎn)角（beta turn）和37.62%的無(wú)規(guī)則卷曲（random coil）（圖2：B）。以 Swiss-Model Workspace上編號(hào)為3iev.1的模型作為模板，西番蓮PeERG蛋白質(zhì)與其相似性較高的氨基酸位于120～414位（圖2：C）。

2.3 ERA蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析

經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，PeERG蛋白與其他物種的ERA蛋白具有較高的同源性，與擬南芥（Arabidopsis thaliana， AtDER、AtERG2、AtERG1）、大腸桿菌（Eecherichia coli， ERA、EcDER）和水稻（Oryza sativa， OsERG1）等ERA蛋白相似（圖3）。西番蓮PeERG蛋白N端有典型GTPase保守結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域由G1、G2、G3、G4、G5五個(gè)box組成，能夠和鳥(niǎo)苷酸結(jié)合并水解GTP;同時(shí)在其C端有其特異的KH domain結(jié)構(gòu)域，從而有別于異三聚體G蛋白和小分子G蛋白（small GTPase）兩個(gè)亞族。

2.4 ERA蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

為了探討ERA蛋白在細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物中的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，我們將西番蓮（PeERG）、金魚(yú)草（ERG）、擬南芥（AtERG1， AtERG2， AtDER）、番茄（Solanum lycopersicum，SlERG）、馬鈴薯（Solanum tuberosum，StERG）、煙草（NtERG）、黃瓜（Cucumis sativus，CsERG）、玉米（Zea mays，ZmDER）、水稻（OsERG1， OsERG2， OsDER）、斑馬魚(yú)（Danio rerio，DrERA）、小鼠（Mus musculus，MmERA）、人類(lèi)（Homo sapiens，ERAL1）、大腸桿菌（ERA， EcDER）13個(gè)物種的19個(gè)ERA（ERG）同源蛋白進(jìn)行多重序列比對(duì)后構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖4）。西番蓮PeERG蛋白和水稻OsERG1、擬南芥AtERG1、大腸桿菌ERA位于同一進(jìn)化分枝，PeERG與擬南芥AtERG1有更近的進(jìn)化關(guān)系。

2.5 低溫脅迫下PeERG基因的表達(dá)模式分析

通過(guò)熒光定量PCR進(jìn)行了西番蓮PeERG基因的組織表達(dá)差異分析，該基因在根、莖、花和果實(shí)中的表達(dá)量相當(dāng)，而在葉中表達(dá)量最高（圖5：A）。西番蓮不同品種差異基因表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)（Liu et al.， 2017），PeERA基因可能參與‘平塘1號(hào)抗寒性狀的分子調(diào)控。為了進(jìn)一步揭示該基因低溫脅迫應(yīng)答的表達(dá)模式，以盆栽的1年生‘平塘1號(hào)扦插苗為材料，開(kāi)展西番蓮低溫脅迫及常溫恢復(fù)試驗(yàn)，并在此過(guò)程中于11個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)取其葉片材料用于PeERG基因相對(duì)表達(dá)量分析。在低溫脅迫及常溫恢復(fù)條件，西番蓮PeERG基因的表達(dá)僅有小幅度的波動(dòng)，總體而言在0～24 h其表達(dá)先下降再上升，LST-4h是其低溫脅迫應(yīng)答最低表達(dá)，24～72 h有所下降;在恢復(fù)處理的1～72 h時(shí)，PeERG基因的表達(dá)整體上呈現(xiàn)先下降再上升的趨勢(shì)，在NTR-8h為最低表達(dá)峰值（圖5：B）。

3 討論與結(jié)論

G蛋白是一類(lèi)廣泛存在于真核細(xì)胞、具有內(nèi)源GTP酶活性的鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白，在動(dòng)植物細(xì)胞內(nèi)跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起著“分子開(kāi)關(guān)”的重要作用。ERA蛋白因其C末端存在與RNA或生物膜特異結(jié)合的KH domain結(jié)構(gòu)域，有別于異三聚體G蛋白及小分子G蛋白，屬于一類(lèi)新的GTP結(jié)合蛋白亞家族，不僅存在大腸桿菌、釀酒酵母，而且在高等動(dòng)植物以及人類(lèi)細(xì)胞中均含有其同源蛋白。在原核生物中，ERA蛋白在DNA復(fù)制、蛋白質(zhì)翻譯以及細(xì)胞周期調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用（Abu et al.， 1999;楊青青，2010）;而真核生物ERA基因起源于原核生物，兩者之間的蛋白序列具有較高相似性，動(dòng)物ERA蛋白參與細(xì)胞周期調(diào)控、可能與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)（楊青青，2010）。然而，有關(guān)高等植物ERG基因克隆和功能研究的相關(guān)報(bào)道尚少。

金魚(yú)草ERG蛋白定位于線粒體，可能通過(guò)影響線粒體的分裂參與調(diào)控植株受精作用后胚珠發(fā)育成種子的過(guò)程。金魚(yú)草ERG基因在各個(gè)組織器官中均有表達(dá)，其缺失突變體植株不能產(chǎn)生正常發(fā)育的種子（Ingram et al.， 1998;楊青青 2010）。擬南芥中存在AtERG1和AtERG2兩個(gè)ERA同源基因（楊青青，2011;Suwastika et al.， 2014），其編碼蛋白分別定位于葉綠體和線粒體。AtERG2基因主要在擬南芥葉脈、蓮座葉表皮毛、成熟花粉和胚珠，其編碼蛋白介導(dǎo)線粒體核糖體小亞基成熟及線粒體蛋白的翻譯而調(diào)控早期種子的形成和發(fā)育（Cheng et al.， 2018）。

溫度是決定植物地域分布的主要限制因素。西番蓮一般在熱帶及亞熱帶地區(qū)栽培，生長(zhǎng)要求年平均氣溫在18 ℃以上，在低溫脅迫條件下西番蓮會(huì)遭到不同程度的傷害，而喀斯特山區(qū)適生品種‘平塘1號(hào)能在零下溫度條件可順利越冬。為什么‘平塘1號(hào)的抗寒性如此出眾？經(jīng)過(guò)前期研究發(fā)現(xiàn)，ERG基因在不同西番蓮品種間顯著差異表達(dá)（Liu et al.， 2017）。以此為切入點(diǎn)，本研究首次從木本植物西番蓮中克隆和鑒定了ERG同源基因，研究發(fā)現(xiàn)PeERG基因在西番蓮抗寒新品種‘平塘1號(hào)的根、莖、葉、花、果中均有表達(dá)，葉中表達(dá)最高;在低溫脅迫及常溫恢復(fù)條件下該基因局限于低表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化;其編碼蛋白預(yù)測(cè)定位于葉綠體，具有類(lèi)似大腸桿菌ERA蛋白、金魚(yú)草ERG蛋白、擬南芥AtERG1和AtERG2蛋白的四個(gè)保守G box和KH domain。PeERG基因在抗寒品種‘平塘1號(hào)低溫脅迫條件下，其轉(zhuǎn)錄表達(dá)并未被低溫誘導(dǎo)而顯著性上升或下降;推測(cè)該基因分別在抗寒品種和不耐寒品種內(nèi)均為組成性表達(dá)模式，品種間的差異表達(dá)顯著，然而有關(guān)該基因具體的表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚待深入研究。本研究首次在木本植物西番蓮中鑒定和描述了ERG基因序列特征和表達(dá)模式，不僅有助于進(jìn)一步揭示其生物學(xué)功能和作用機(jī)制，也將為深入挖掘西番蓮特異種質(zhì)資源提供理論基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 何永艷）