培養(yǎng)條件對西洋參不定根誘導(dǎo)的影響

李潤田 劉志琨 鄒丹 張宗申

摘 要： 為了提高西洋參不定根的誘導(dǎo)率和生長速度，該研究以西洋參鮮根為外植體，在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上優(yōu)化IBA、碳源、氮源和磷源等營養(yǎng)成分。結(jié)果表明：西洋參不定根誘導(dǎo)過程可以明顯分為外植體脫分化（愈傷化）、再分化（根形成）和根伸長等三個階段;MS基本培養(yǎng)基更有利于西洋參不定根的誘導(dǎo)，可能與MS培養(yǎng)基中礦質(zhì)元素含量高有關(guān);當(dāng)培養(yǎng)基中IBA濃度達(dá)到2 mg·L-1時，外植體表面上不定根分布密度大，誘導(dǎo)率達(dá)到（96±3.5）%;培養(yǎng)基中添加蔗糖到30 g·L-1時，不定根的誘導(dǎo)效果最好，但繼續(xù)提高濃度后不定根變短、直徑變粗;培養(yǎng)基中NO3-∶NH4+和 PO43- 濃度分別為20∶ 10（總氮量30 mmol·L-1）和25.0 mmol·L-1時，西洋參不定根誘導(dǎo)率達(dá)到最大。結(jié)果提示優(yōu)化培養(yǎng)條件可以顯著改善西洋參不定根的誘導(dǎo)和生長，為后續(xù)西洋參不定根規(guī)?；囵B(yǎng)提供理論支持。

關(guān)鍵詞： 西洋參， 不定根， 培養(yǎng)基優(yōu)化， 誘導(dǎo)， IBA

中圖分類號： Q945 ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

文章編號： 1000-3142（2020）04-0557-10

Abstract： This study reported the improved induction rate and growth speed of Panax quinquefolium adventitious roots cultured on the basal media supplemented with varying IBA， sucrose， NO3-∶NH4+ ratio and PO43-， etc. The results were as follows： In the whole process of adventitious root induction， three main phases could be distinguished including dedifferentiation （callus formation）， redifferentiation （initiation of adventitious root）， and elongation of roots. And it achieved the best induction of adventitious roots from explants cultured on the MS containing high concentration of mineral elements， which probably fulfilling the requirement for nutrients at stage of callus formation. Amid experiments of IBA， at a concentration of 2 mg·L-1 was the most effective in inducing adventitious roots with （96±3.5）% of induction rate， at which dense distribution of adventitious roots on the surface of callus could be observed. Additionally， 30 g·L-1 sucrose was proved to be the optimal concentration， however， it would grow into stubbly roots upon the increase of sucrose concentration. Furthermore， the effect of NO3-∶NH4+ ratio and PO43- concentration on adventitious root induction was also evaluated. The maximum induction rate was obtained in 20∶10 ratio of NO3- to NH4+ （total N source of 30 mmol·L-1） and 25.0 mmol·L-1 PO43-， respectively. The present data suggest that modification of media ingredients can significantly enhance the induction and growth of P. quinquefolium adventitious roots， which would provide theoretical support for following large-scale culture of P. quinquefolium adventitious roots.

Key words： Panax quinquefolium， adventitious roots， optimization of media， induction， IBA

西洋參（Panax quinquefolium）是五加科人參屬（Panax L.）的多年生草本藥用植物，其宿根一直是該屬天然藥物的重要來源（Yang et al.， 2014）。西洋參除了具有清熱解毒、滋陰補腎和口齒生津的功效外，還具有降血糖、促進血液循環(huán)的作用，有助于人體抗衰老、提高免疫力和保護心血管系統(tǒng)等（李珊珊和孫印石， 2017; Huang et al.， 2019）。鑒于我國將西洋參列入新食品原料目錄管理，隨著其在食品領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，它的市場需求量將會急劇增加。

種植的西洋參受生長環(huán)境、氣候、土壤及栽培技術(shù)等因素的影響很大，也存在著“重、毒、副”殘留與基本農(nóng)田爭地和管理成本高等突出問題，而且一般還要經(jīng)過4到5年的生長周期才能收獲入藥（Li et al.， 1996; 陳洪海和張志華， 2014）。因為西洋參以根入藥， 通過不定根離體培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)西洋參培養(yǎng)物，可以作為替代大田栽培資源提取天然產(chǎn)物的原料（Murthy et al.， 2018）。不定根離體培養(yǎng)的工藝流程包括不定根誘導(dǎo)、固體增殖擴繁和懸浮級聯(lián)放大培養(yǎng)等技術(shù)環(huán)節(jié)，其中高效誘導(dǎo)是實現(xiàn)不定根規(guī)模化生產(chǎn)的前提（Jeong et al.， 2009; Zhang et al.， 2017）。對于西洋參等多年生藥用植物，一般采用其宿根作為不定根誘導(dǎo)的外植體，但是普遍存在著細(xì)胞脫分化難、次生代謝物質(zhì)抑制生長、對外源激素敏感性低甚至易發(fā)生褐變致死等問題，直接導(dǎo)致外植體上不定根誘導(dǎo)率較低（Zhao et al.， 2013）。目前，雖然開展了西洋參不定根離體培養(yǎng)的研究，但僅限于不定根懸浮培養(yǎng)的生長和總皂苷積累等方面，主要集中在誘導(dǎo)子應(yīng)用、培養(yǎng)形式和不定根增殖等問題上（李慧娟等， 2011; Yu et al.， 2016）。目前，對于影響西洋參不定根誘導(dǎo)發(fā)生的因素及解決手段等方面的研究還未見文獻(xiàn)報告，而對該問題的研究有利于建立穩(wěn)定的西洋參不定根誘導(dǎo)工藝。

為了提高西洋參不定根的誘導(dǎo)率，本文以新鮮的西洋參根為外植體，篩選適合西洋參不定根誘導(dǎo)的基本培養(yǎng)基和優(yōu)化主要成分的添加濃度。研究結(jié)果對后續(xù)西洋參不定根培養(yǎng)的商業(yè)化應(yīng)用提供基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)，同時也為其他珍稀瀕危藥用植物資源可持續(xù)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

吉林長白山三年生的新鮮西洋參根。先將西洋參根經(jīng)自來水沖洗、濾紙吸干、消毒等處理，然后將其剪為1～2 cm的切段，作為誘導(dǎo)不定根的外植體，待用。

1.2 方法

1.2.1 基本培養(yǎng)基的選擇 將外植體切段分別接種在含有1/2 B5、B5、MS、1/2 MS的固體培養(yǎng)基上（pH6.0），輔以2%蔗糖+0.5%瓊脂粉+3 mg·L-1 IBA。在25 ℃條件下暗培養(yǎng)，以誘導(dǎo)率為指標(biāo)確定最適培養(yǎng)基。

1.2.2 吲哚丁酸（IBA）濃度對西洋參不定根誘導(dǎo)效果的影響 以MS為基本培養(yǎng)基，添加2%蔗糖+0.5%瓊脂粉，分別添加不同濃度的IBA（0.05、0.10、0.20、1.00、2.00、4.00 mg·L-1），pH值6.0，將處理的外植體切段接入，其余同1.2.1。

1.2.3 碳源濃度對西洋參不定根誘導(dǎo)的影響 以MS+2 mg·L-1IBA+0.5%瓊脂粉為培養(yǎng)基配方，添加不同濃度的蔗糖（15、25、30、40 g·L-1），pH值 6.0，接種后培養(yǎng)，其余同1.2.1。

1.2.4 氮源對西洋參不定根誘導(dǎo)的影響 以MS+30 g·L-1蔗糖+2 mg·L-1 IBA +0.5%瓊脂粉等作為基本培養(yǎng)基配方，按照表1添加不同比例的NO3- ∶NH4+，培養(yǎng)基中總氮量固定為30 mmol·L-1，培養(yǎng)基pH6.0，外植體接種后培養(yǎng)，其余同1.2.1。

1.2.5 PO43-對西洋參不定根誘導(dǎo)的影響 以MS（NO3-∶NH4+為20∶10）+30 g·L-1蔗糖+2 mg·L-1 IBA+0.5%瓊脂粉為培養(yǎng)基組成配方，添加不同濃度的PO43-（5、10、15、20、25、30 mmol·L-1），培養(yǎng)基pH6.0，外植體接種后培養(yǎng)，其余同1.2.1。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 上述所有試驗均隨機分組，設(shè)置3組重復(fù)，每組總接種數(shù)量為50個外植體;從接種第4天開始，每天觀察外植體變化及不定根發(fā)生情況，并以培養(yǎng)28 d的不定根誘導(dǎo)結(jié)果計算誘導(dǎo)率，實驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010和Origin 2017進行分析，P<0.05差異顯著。不定根誘導(dǎo)率=（發(fā)生不定根的外植體數(shù)/外植體總數(shù)）×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 基本培養(yǎng)基的選擇

通過觀察不定根發(fā)生情況確定適合西洋參不定根誘導(dǎo)的基本培養(yǎng)基類型，結(jié)果如圖版Ⅰ所示。在接種培養(yǎng)7 d后，外植體的切口端（傷口）出現(xiàn)膨脹等愈傷化現(xiàn)象;隨著時間延長，愈傷組織表面逐漸呈現(xiàn)顆粒狀;在培養(yǎng)20 d后，愈傷組織表面陸續(xù)分化出不定根。從誘導(dǎo)培養(yǎng)28 d后的不定根誘導(dǎo)率統(tǒng)計結(jié)果（圖1）可以看出，MS更適合不定根誘導(dǎo)，B5的效果較差。這可能與不定根發(fā)生過程中涉及愈傷組織中細(xì)胞脫分化、分裂、生長等有關(guān)，因為這些細(xì)胞變化需要活躍的生物物質(zhì)代謝、能量代謝以及細(xì)胞的重構(gòu)等，必須提供充足的營養(yǎng)元素才能滿足上述細(xì)胞活動。MS培養(yǎng)基的最主要特點就是礦質(zhì)元素和其他營養(yǎng)成分含量高，與不定根誘導(dǎo)過程對營養(yǎng)成分的需求相一致，本結(jié)果也證明了這個推測。

2.2 吲哚丁酸（IBA）濃度對西洋參不定根的誘導(dǎo)效果

培養(yǎng)基中IBA濃度對西洋參不定根的誘導(dǎo)情況及誘導(dǎo)率統(tǒng)計結(jié)果分別如圖版Ⅱ和圖2所示。通過比較發(fā)現(xiàn)，當(dāng)濃度較低時，外植體上發(fā)生較多愈傷組織，表面上不定根數(shù)量少且短（圖版Ⅱ：A，B，C）;當(dāng)IBA濃度較高時，不定根誘導(dǎo)發(fā)生的效果較好，不定根分布密度大且不定根較長（圖版Ⅱ：D， E，F(xiàn)）;當(dāng)IBA濃度高于1 mg·L-1時，外植體上不定根誘導(dǎo)率達(dá)到（82±3）%以上，2 mg·L-1時不定根誘導(dǎo)率達(dá)到（96±3.5）%。綜合考慮誘導(dǎo)率和培養(yǎng)基成本，在后續(xù)的試驗中選擇2 mg·L-1 IBA作為添加濃度。

2.3 碳源濃度對西洋參不定根的誘導(dǎo)效果

在離體條件下，培養(yǎng)基中添加碳源除了為不定根誘導(dǎo)提供能量外，還對培養(yǎng)基滲透勢有很大影響，因此其添加濃度是非常重要的參數(shù)。根據(jù)前面結(jié)果，在MS+2 mg·L-1 IBA+0.5%瓊脂基本配方中添加不同濃度的蔗糖，28 d后觀察統(tǒng)計外植體上不定根的發(fā)生和誘導(dǎo)率（圖版Ⅲ和圖3）。結(jié)果表明，盡管在所有蔗糖濃度的培養(yǎng)基中，外植體上都能發(fā)生愈傷組織，但是不定根發(fā)生情況差異很大。當(dāng)糖量為30 g·L-1時，西洋參不定根誘導(dǎo)率較大;當(dāng)糖量較低時（15 g·L-1），西洋參不定根誘導(dǎo)率較低;當(dāng)蔗糖濃度達(dá)到40 g·L-1時，雖然不定根發(fā)生率相對較高，但不定根較短，說明高濃度蔗糖具有抑制生長的作用， 這可能與糖量過高引 A. 1/2 B5培養(yǎng)基，愈傷組織表面上不定根較少; B. B5培養(yǎng)基，不定根密度比1/2 B5培養(yǎng)基中的增加; C. 1/2 MS培養(yǎng)基，愈傷組織表面的不定根數(shù)量明顯增加; D. MS培養(yǎng)基，不定根密度和根長度最大。

2.4 NO3- ∶NH4+對西洋參不定根的誘導(dǎo)效果

在MS+30 g·L-1蔗糖+2 mg·L-1IBA+0.05 mg·L-1NAA+0.5%瓊脂基礎(chǔ)上，改變NO3- ∶NH4+配比，培養(yǎng)28 d后觀察、統(tǒng)計西洋參不定根發(fā)生情況如圖版Ⅳ和圖4所示。當(dāng)NO3-所占比例低時，外植體愈傷化較好，不定根發(fā)生率也較高，但不定根較短即生長速度漫;當(dāng)NO3-所占比例逐漸升高時，不定根密度增加，不定根越來越長即生長速度越來越快，NO3-所占比例過大（超過28∶2）時，盡管不定根較長，但分布密度降低，不定根衰老較明顯。上述結(jié)果提示，NO3- ∶NH4+影響不定根的發(fā)生、生長和生理狀態(tài)。A. 0.05 mg·L-1; B. 0.10 mg·L-1; C. 0.20 mg·L-1; D. 1.00 mg·L-1; E. 2.00 mg·L-1; F. 4.00 mg·L-1。

2.5 PO43-濃度對西洋參不定根的誘導(dǎo)效果

磷元素是植物細(xì)胞分裂、分化和生長發(fā)育必須的大量元素之一。MS培養(yǎng)基中磷元素以PO43-的形式存在，其濃度高低直接影響著外植體上不定根誘導(dǎo)發(fā)生。將西洋參外植體接種在含不同濃度PO43-的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)28 d后不定根發(fā)生情況如圖版Ⅴ和圖5所示。當(dāng)PO43-濃度較低時，不定根誘導(dǎo)率較低，生長速度慢;隨著濃度升高，不定根密度逐漸增加，到15 mmol·L-1時不定根生長明顯加快;當(dāng)PO43-濃度達(dá)到25 mmol·L-1時，不定根的生長速度和分布密度基本不再變化。A. 15 g·L-1; B. 25 g·L-1; C. 30 g·L-1; D. 40 g·L-1。

3 討論

本研究通過篩選基本培養(yǎng)基和優(yōu)化NO3-∶NH4+比以及IBA、蔗糖和PO43-等培養(yǎng)基成分，均顯著提高了西洋參外植體的不定根誘導(dǎo)率和生長速度，在優(yōu)化條件下不定根誘導(dǎo)率最高值達(dá)到（96+3.5）%。上述結(jié)果為西洋參不定根的固體增殖擴繁、縮短不定根種子制備周期等提供了依據(jù)，對于下階段建立西洋參不定根懸浮培養(yǎng)體系奠定了基礎(chǔ)。

添加外源IBA對不定根的誘導(dǎo)發(fā)生起關(guān)鍵作用。一些研究表明，IBA在植株水平上誘導(dǎo)根器官A. 0∶30; B. 4∶26; C. 8∶22; D. 12∶18; E. 15∶15; F. 20∶10; G. 24∶6; H. 28∶2; I. 30∶0。

形成的活力很強，如擬南芥和玉米的不定根發(fā)生以及側(cè)根形成等（Ludwig-Muller et al.， 2005; Strader et al.， 2011; Yadav et al.， 2013; Schlicht et al.， 2013）;其在離體條件下也起類似的生理作用，如促進東哥阿里和貫葉金絲桃不定根的形成（Cui et al.， 2010;Tao et al.， 2015）。對于IBA誘導(dǎo)不定根或側(cè)根發(fā)生的機理，一些研究發(fā)現(xiàn)IBA是IAA依賴性的，必須在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為IAA形式才具有生理活性（Zoman et al.， 2000）;也有結(jié)果證明IBA可能有獨立于IAA的作用機制，依靠自己的信號傳遞途徑激發(fā)下游的生理生化事件（Strader et al.， 2011）。本文結(jié)果顯示IBA不但具有較好的西洋參不定根誘導(dǎo)效果，而且還具有IBAA. 5 mmol·L-1; B. 10 mmol·L-1; C.15 mmol·L-1; D . 20 mmol·L-1; E. 25 mmol·L-1; F. 30 mmol·L-1。

濃度依賴性的特征。在離體條件下，不同外植體對外源IBA的敏感性，存在著種質(zhì)特性、生理狀態(tài)、組織幼嫩程度和環(huán)境條件等造成的差異性，這些差異影響著外植體對外源IBA的吸收效率、轉(zhuǎn)運速度和IAA轉(zhuǎn)化等（Woodward & Bartel， 2005）。因此，在進行外植體誘導(dǎo)不定根的試驗中，首先要根據(jù)外植體的具體情況優(yōu)化并確定IBA使用濃度，以提高不定根誘導(dǎo)效率和縮短不定根種子制備周期。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基及其他營養(yǎng)成分對不定根誘導(dǎo)具有很大影響。由于基本培養(yǎng)基的大量元素和微量元素的組成特點有所不同，其應(yīng)用范圍和使用目的也有差異（齊琳琳等，2017）。從外植體經(jīng)過愈傷組織途徑發(fā)生不定根，涉及到外植體細(xì)胞脫分化、再分化等過程，細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)和形態(tài)以及生理生化代謝能力和方式等都發(fā)生一系列變化（Benková et al.， 2003;Ma s'lanka & Bach， 2014; Li et al.， 2018）。而MS基本培養(yǎng)基具有無機鹽含量高的特點，符合不定根誘導(dǎo)及生長對營養(yǎng)元素的要求，本文結(jié)果也證明了MS培養(yǎng)基比較適合西洋參不定根誘導(dǎo)，與前人結(jié)論一致（ Lee & Paek， 2012）。同時，本文結(jié)果也說明了NO3-∶NH4+、糖和PO43-濃度等對西洋參不定根誘導(dǎo)率具有很重要的影響。一方面是因為從外植體組織到不定根轉(zhuǎn)化過程中涉及細(xì)胞重構(gòu)和生物大分子代謝等需要大量營養(yǎng)成分參與的過程，而且糖等物質(zhì)還有調(diào)節(jié)培養(yǎng)基滲透勢的作用，直接影響外植體細(xì)胞對營養(yǎng)成分的吸收利用;另一方面，NO3-∶NH4+對植株或離體根系的形態(tài)建成通過氮元素轉(zhuǎn)化效率、NO信號分子形成等發(fā)揮特殊作用（Pagnussat et al.， 2002; Zhao et al.， 2007; 楊雨迎等， 2018）。因此，本文在篩選基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上進一步優(yōu)化了NO3-∶NH4+比等營養(yǎng)成分，初步實現(xiàn)了西洋參不定根高效誘導(dǎo)，證明營養(yǎng)成分及其濃度對不定根發(fā)生具有重要作用，可以與IBA等一起發(fā)揮協(xié)同作用。

盡管利用不定根培養(yǎng)技術(shù)在少數(shù)種類的藥用植物中獲得突破，但是對于大多數(shù)藥用植物來說仍然存在限制性因素，主要包括不定根誘導(dǎo)率低、懸浮下生長慢、有效成分含量不穩(wěn)定等 （Murthy et al.， 2008; Lee & Paek， 2012; Murthy et al.， 2018）?；诖?，在本研究基礎(chǔ)上，下一步需要在基于生物反應(yīng)器規(guī)模化懸浮培養(yǎng)工藝方面深入研究，比如溶氧、供氧方式及養(yǎng)分代謝動力學(xué)等重要參數(shù)，實現(xiàn)西洋參不定根生物量和活性成分積累等關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)的突破，解決影響西洋參不定根規(guī)?；囵B(yǎng)過程中的核心問題。

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（責(zé)任編輯 周翠鳴）