分散固相萃取—超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)品中利福平殘留

朱思華，張玉昆，劉振先，錢寶聰，李 冰，繆小群

( 1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東 佛山 528000； 2. 廣東國康檢測(cè)技術(shù)有限公司，廣東 東莞 523000 )

利福平是一種人工半合成的強(qiáng)效抗生素，其主要作用機(jī)制為通過與菌體RNA聚合酶結(jié)合，干擾 DNA 和蛋白質(zhì)合成，屬全效殺菌藥，對(duì)細(xì)胞內(nèi)外結(jié)核菌均有殺滅作用，但它存在耐藥率高、易出現(xiàn)毒副作用等缺點(diǎn)，長期服用或與其他抗結(jié)核藥物聯(lián)合用藥在臨床病例中常出現(xiàn)肝毒性、胃腸道不適、過敏反應(yīng)以及產(chǎn)生耐藥等不良反應(yīng)[1-2]。

利福平未被批準(zhǔn)為動(dòng)物用藥，添加于動(dòng)物飼料和飲水中及用于預(yù)防、治療疾病等均屬非法。美國、加拿大禁止在動(dòng)物(包括食用動(dòng)物) 疾病防治中使用利福平等抗菌素[3-4]，而我國早在2005年發(fā)布的第560號(hào)農(nóng)業(yè)部公告就已將其列入獸藥廢止目錄[5]。但因該藥價(jià)格低廉，抗菌效果好，而且來源較廣泛，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中存在人為非法使用的可能[6]。據(jù)相關(guān)水產(chǎn)養(yǎng)殖致病菌的耐藥分析研究，發(fā)現(xiàn)多種菌株對(duì)利福平藥物呈現(xiàn)出30%～80%不同程度的耐藥率[7-9]。可見，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中可能存在個(gè)別非法添加使用的情況，誘導(dǎo)菌株產(chǎn)生抗性。如果藥物仍殘留于食用水產(chǎn)動(dòng)物機(jī)體中，通過食物鏈在人體內(nèi)蓄積，其耐藥性有轉(zhuǎn)移擴(kuò)散到人體的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)消費(fèi)者的生命健康存在很大的隱患。然而，我國尚未建立關(guān)于利福平在水產(chǎn)品或相關(guān)動(dòng)物性食品中的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[10]，從而無法對(duì)水產(chǎn)品中的利福平藥物殘留實(shí)施監(jiān)控。

筆者選用高分離能力、高選擇性、高靈敏度的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，并結(jié)合簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、有效、可靠和安全的分散固相萃取前處理技術(shù)，建立了一種測(cè)定魚蝦等水產(chǎn)品中利福平藥物殘留的方法，對(duì)嚴(yán)格監(jiān)控利福平藥物殘留，為消費(fèi)者提供安全質(zhì)量保證的水產(chǎn)品有重要現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品包括奧尼羅非魚(Oreochromiscoaureus×O.niloticus)、凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)、中華鱉(Trionyxsinensis)、口蝦蛄(Oratosquillaoratoria)、烏鱧(Ophiocephalusargus)、草魚(Ctenopharyngodonidellus)、羅氏沼蝦(Macyobrachiunrosebergii)等，均為市售樣品。

標(biāo)準(zhǔn)品：利福平[CAS號(hào)：13292-46-1，含量以利福平(C43H58N4O12)計(jì)，100%]、利福噴丁[CAS號(hào)：61379-65-5，含量以利福噴丁(C47H64N4O12)計(jì)，100%]均購自中國食品藥品檢定研究院。

試劑：乙二胺-N-丙基硅烷PSA(40～63 μm)、十八烷基硅烷鍵合硅膠C18吸附劑(上海安譜公司)；乙腈、二氯甲烷皆為色譜純(SccBayer)；甲酸、乙酸銨(色譜純，天津科密歐)、無水硫酸鈉(分析純，天津科密歐)。

1.2 儀器設(shè)備

API 4000超高效液相色譜—三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國AB Sciex公司)；高速冷凍離心機(jī)(安徽嘉文)；高速分散均質(zhì)機(jī)(上海本昂)；HSC水浴氮吹儀(天津恒奧科技)；渦旋混合器(德國IKA公司)；移液器(Eppendorf)。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取適量利福平和內(nèi)標(biāo)利福噴丁標(biāo)準(zhǔn)品，分別用乙腈逐級(jí)溶解配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液、10.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液以及利福平質(zhì)量濃度為100 ng/mL和利福噴丁為1.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作液，置-20 ℃保存待用。

1.3.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取5 g均質(zhì)樣品(精確至0.01 g)于50 mL具塞塑料離心管中，加入100 μL的利福噴丁內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)使用液，加入10 mL提取劑乙腈—二氯甲烷(6∶4，體積比)和5.0 g無水硫酸鈉，渦旋振蕩3 min，超聲提取10 min，8000 r/min離心5 min，取上清液移至干凈的20 mL試管中，5 mL提取劑重復(fù)提取1次，合并上清液，于40 ℃水浴氮吹至近干。

用初始流動(dòng)相定容至2 mL，渦旋混勻，使殘?jiān)浞秩芙夂?，? mL復(fù)溶液于裝有100 mg C18、100 mg PSA吸附劑的2 mL離心管中，充分漩渦振蕩2 min，4 ℃，10000 r/min離心5 min后，取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后上機(jī)測(cè)定。

1.3.3 色譜條件

采用色譜柱為InertSustainSwift C18(3 μm, 2.1 mm×100 mm)；流動(dòng)相：A為含0.05%甲酸的乙酸銨水溶液(3 mmol/L)，流動(dòng)相B為乙腈相；梯度洗脫程序：0～0.20 min，20% B；0.20～1.00 min，20%～80% B；1.00～5.00 min，80% B；5.01～8.00 min，20% B，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。

1.3.4 質(zhì)譜條件

采用電噴霧正離子模式(ESI+)；質(zhì)譜掃描模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式；氣簾氣(CUR)壓力為10 psi(1 psi=6.895 kPa)；碰撞氣(CAD)為4 psi；電噴霧電壓為5500 kV；離子源溫度為500 ℃；霧化器 (GS1)壓力為30 psi；輔助氣 (GS2)壓力為40 psi；其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 利福平及內(nèi)標(biāo)利福噴丁在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下的質(zhì)譜參數(shù)

注：*為定量離子. Note：* indicates quantitation ion.

2 結(jié)果與分析

2.1 基質(zhì)效應(yīng)的考察

利福平的質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)可能會(huì)受基質(zhì)效應(yīng)所影響。本研究中采用奧尼羅非魚、凡納濱對(duì)蝦、中華鱉空白基質(zhì)液稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液至含有利福平1、2、4、8、10、16、20 μg/kg系列含量的樣品標(biāo)準(zhǔn)溶液(均含20 μg/kg內(nèi)標(biāo)利福噴丁)，與同含量初始流動(dòng)相稀釋系列標(biāo)準(zhǔn)溶液同序列進(jìn)行液相色譜—質(zhì)譜/質(zhì)譜分析。通過計(jì)算初始流動(dòng)相稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線及空白基質(zhì)稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線的比值進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果空白奧尼羅非魚、凡納濱對(duì)蝦、中華鱉基質(zhì)中的利福平藥物的基質(zhì)效應(yīng)值為1.18～1.29(初始流動(dòng)相稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性回歸方程為y=0.2589x+0.0983，r=0.9971)，存在一定的基質(zhì)效應(yīng)。故在樣品前處理中，采用分散固相萃取凈化方法進(jìn)行優(yōu)化，并結(jié)合基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)法以及內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行校正，以最大限度消除基質(zhì)效應(yīng)對(duì)測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性的影響。

2.2 線性關(guān)系、方法檢出限與定量限

本試驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)曲線采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)法進(jìn)行，稱取相同質(zhì)量的空白樣品，然后按“1.3.2”節(jié)所述樣品前處理方法提取后，用初始流動(dòng)相定容，合并得到空白基質(zhì)溶液，分別移取適量的利福平與利福噴丁標(biāo)準(zhǔn)工作液，用空白基質(zhì)樣液稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液至含利福平1、2、4、8、10、16、20 μg/kg系列含量的樣品標(biāo)準(zhǔn)溶液，在“1.3.3、1.3.4”節(jié)所示的條件下上機(jī)測(cè)定，以待測(cè)物定量離子質(zhì)量色譜峰面積與對(duì)應(yīng)的內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)(y)，標(biāo)準(zhǔn)溶液含量為橫坐標(biāo)(x)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程, 利福平在1～20 μg/kg的系列基質(zhì)標(biāo)液含量范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r)為0.9986～0.9993。以信噪比(S/N)≥3確定化合物的方法檢出限，以信噪比(S/N)≥10確定化合物的方法定量限，結(jié)果見表2，利福平在不同基質(zhì)的方法檢出限為0.3 μg/kg，定量限為1.0 μg/kg，能滿足定量分析的技術(shù)要求[10]，方法具有較高的靈敏度。

表2 3種水產(chǎn)品基質(zhì)中利福平的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)r、檢出限與定量限

2.3 方法的回收率與精密度

試驗(yàn)中選取奧尼羅非魚、凡納濱對(duì)蝦與中華鱉3類水產(chǎn)品的肌肉組織進(jìn)行基質(zhì)加標(biāo)回收試驗(yàn)，驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確度和精密度。各種基質(zhì)空白樣品中添加1、5、10 μg/kg低、中、高3個(gè)含量水平，每個(gè)加標(biāo)含量設(shè)6個(gè)平行，按本試驗(yàn)方法進(jìn)行樣品處理和測(cè)定并采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析，結(jié)果見表3，該藥物的平均加標(biāo)回收率為90.17%～101.07%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.11%～7.66%，可見方法具有較好的回收率和重現(xiàn)性，能滿足殘留檢測(cè)的要求。奧尼羅非魚空白樣品的TIC及MRM圖見圖1，添加5 μg/kg利福平奧尼羅非魚樣品的TIC及MRM圖見圖2。

2.4 實(shí)際樣品的檢測(cè)

采用本研究所建立的方法，對(duì)市場(chǎng)上購買的奧尼羅非魚、草魚、中華鱉、烏鱧、凡納濱對(duì)蝦、口蝦蛄、羅氏沼蝦等20個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在1份烏鱧的樣品中檢出有利福平，含量為21.6 μg/kg。

3 討 論

3.1 樣品前處理方式的選擇與優(yōu)化

3.1.1 提取劑的選擇

利福平與利福噴丁均屬于利福霉素類抗生素，其具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，易溶于乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑，難溶于水。試驗(yàn)中以添加水平為10 μg/kg的奧尼羅非魚肌肉為試驗(yàn)對(duì)象，考察了純乙腈、含體積分?jǐn)?shù)1%甲酸的乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、乙腈—二氯甲烷(6∶4，體積比)、乙腈—二氯甲烷(4∶6，體積比)等多種提取劑對(duì)目標(biāo)化合物的提取效果。結(jié)果表明，以乙腈—二氯甲烷(6∶4，體積比)為提取劑的提取效果為較佳，平均回收率達(dá)96.7%，且能有效地沉淀樣品中的蛋白質(zhì)和脂肪。因此，本試驗(yàn)中選擇乙腈—二氯甲烷(6∶4，體積比)作為提取劑。

表3 樣品中利福平的平均回收率和精密度(n=6)

圖1 奧尼羅非魚空白樣品的TIC及MRM圖

圖2 添加5 μg/kg利福平奧尼羅非魚樣品的TIC及MRM圖

3.1.2 凈化條件的優(yōu)化

水產(chǎn)品樣品基質(zhì)中含有較多的蛋白質(zhì)、脂肪以及一些色素等干擾物質(zhì)，水產(chǎn)品中藥物殘留的方法研究中通常選用PSA與C18作為樣品前處理中的凈化吸附劑，C18具有較好的去脂能力，而PSA可去除樣品基質(zhì)中一些如脂肪酸、糖類、酚類和極性色素等物質(zhì)[11-15]。因此，本研究選取PSA和C18作為分散固相萃取凈化的吸附劑，并以不同質(zhì)量配比來比較凈化的效果，優(yōu)化了二者的劑量。當(dāng)使用100 mg PSA+100 mg C18凈化劑組合時(shí)獲得較好的凈化效果，且平均回收率達(dá)95%(圖3)，因此，本研究選擇以100 mg PSA+100 mg C18作為分散固相萃取凈化劑。

與李詩言等[6,16]所報(bào)道的采用Oasis PRiME HLB固相萃取柱凈化方式相比，本研究所用的凈化方法更具簡(jiǎn)便、耐用和低成本的優(yōu)勢(shì)，能應(yīng)用于大批量水產(chǎn)樣品的實(shí)際檢測(cè)中。

圖3 不同比例的PSA與C18對(duì)利福平回收率的影響

3.2 色譜、質(zhì)譜條件的優(yōu)化

液質(zhì)聯(lián)用儀的流動(dòng)相常使用甲醇—水體系和乙腈—水體系。試驗(yàn)選用甲醇和乙腈作為有機(jī)相；水，0.05%甲酸水溶液，0.1%甲酸水溶液，5 mmol/L乙酸銨水溶液，2、3、5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.05%甲酸)作為水相，進(jìn)行不同組合。結(jié)果表明，相同洗脫梯度下，以乙腈和3 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.05%甲酸)作為流動(dòng)相組成時(shí)，目標(biāo)化合物的響應(yīng)強(qiáng)度大，峰型尖銳，且目標(biāo)化合物周圍無明顯雜質(zhì)峰干擾。優(yōu)化后的高效液相色譜參數(shù)及梯度洗脫程序見“1.3.3”節(jié)。

質(zhì)譜條件的優(yōu)化試驗(yàn)中，采用注射泵進(jìn)樣的方式，分別將1 μg/mL利福平標(biāo)準(zhǔn)溶液和1 μg/mL內(nèi)標(biāo)利福噴丁標(biāo)準(zhǔn)溶液注入離子源中，在正離子模式下對(duì)利福平和利福噴丁進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描，得到分子離子，然后以分子離子作為母離子對(duì)其子離子進(jìn)行全掃描，以MRM模式進(jìn)行檢測(cè)。在此基礎(chǔ)上對(duì)碰撞能等離子源參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，使選定的母離子和子離子組成的特征離子的豐度比例最佳。最終確定“1.3.4”節(jié)所述的質(zhì)譜條件。

3.3 方法的實(shí)際應(yīng)用

采用本研究所建立的方法，在實(shí)際樣品中檢測(cè)出利福平藥物殘留，說明了在實(shí)際水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中依然存在著個(gè)別違規(guī)使用利福平藥物的情況，應(yīng)該引起相關(guān)部門的重視。

4 結(jié) 論

本研究通過將分散固相萃取法和超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法有效結(jié)合，建立了一種測(cè)定水產(chǎn)品中利福平藥物殘留的分析方法。通過優(yōu)化色譜、質(zhì)譜條件以及提取和凈化條件，并對(duì)水產(chǎn)品中奧尼羅非魚、凡納濱對(duì)蝦、中華鱉3種基質(zhì)進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)，利福平在1～20 μg/kg內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率為90.17%～101.07%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.11%～7.66%。該方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，適用于水產(chǎn)品中利福平殘留的確證和定量分析。