文蛤紅色選育系幼貝濾水率響應(yīng)面法分析

張志東，陳愛華，吳楊平，張 雨，陳素華，曹 奕，田 鎮(zhèn)，張帥中，李秋潔

( 1.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇 南通 226007； 2.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306； 3.中國(guó)海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003 )

濾水率是指單位時(shí)間內(nèi)貝類濾過水的體積，其不僅可以反映貝類的生長(zhǎng)情況，還可以反映貝類的水質(zhì)凈化能力，對(duì)貝類養(yǎng)殖及生態(tài)調(diào)控具有一定的指導(dǎo)意義[1]。目前已見縊蟶(Sinonovaculaconstricta)[2]、大竹蟶(Solengrandis)[3]、青蛤(Cyclinasinensis)[4]、長(zhǎng)牡蠣(Crassostreagigas)和海灣扇貝(Argopectenirradians)[5]等濾水率研究的相關(guān)報(bào)道。文蛤(Meretrixmeretrix)是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)貝類之一，與其他雙殼貝類相同，擁有強(qiáng)大的濾食能力。由于其獨(dú)特的攝食機(jī)制，常作為水質(zhì)凈化的模式生物[6]。目前，在文蛤?yàn)V水率研究方面僅見單一環(huán)境因素影響的研究[7-9]，有關(guān)環(huán)境因素的交互作用對(duì)其濾水性的影響尚未見報(bào)道。因此，研究文蛤的濾水率，是研究文蛤生長(zhǎng)和水質(zhì)凈化能力的基礎(chǔ)和前提。

響應(yīng)面法是一種解決多變量問題的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)分析方法，主要通過提供合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析、評(píng)價(jià)多種變量之間的交互作用而建立數(shù)學(xué)模型和三維立體響應(yīng)曲面圖形，并最終得出最優(yōu)參數(shù)組合的多元回歸方程[10]。目前響應(yīng)面法已經(jīng)廣泛地應(yīng)用到水產(chǎn)行業(yè)中，Jesus等[11]用響應(yīng)面法研究了溫鹽的交互作用對(duì)水環(huán)境及凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)幼體的生長(zhǎng)與存活影響，朱曉聞[12]利用響應(yīng)面法研究了溫度、鹽度、pH對(duì)馬氏珠母貝(Pinctadamartensii)稚貝生理學(xué)特征的聯(lián)合效應(yīng)，姜北等[13]研究了光照度、鹽度、pH對(duì)大竹蟶濾水率的聯(lián)合作用。筆者對(duì)文蛤紅殼色選育系與江蘇野生群體在不同單胞藻種類及密度、不同溫度和不同鹽度條件下的濾水率進(jìn)行比較，并通過響應(yīng)面法優(yōu)化濾水率最高時(shí)的養(yǎng)殖條件，旨在為文蛤人工養(yǎng)殖、良種選育和蝦—貝循環(huán)水養(yǎng)殖模式的建立提供基礎(chǔ)信息和理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用文蛤?yàn)橥仞B(yǎng)殖(中間用圍網(wǎng)隔開)的紅殼色文蛤選育系子四代(以下簡(jiǎn)稱紅文蛤)和江蘇野生群體(以下簡(jiǎn)稱黃文蛤)。以殼色為明顯性狀，定期同時(shí)測(cè)量?jī)煞N文蛤殼長(zhǎng)。紅、黃文蛤生物學(xué)數(shù)據(jù)見表1。試驗(yàn)所用藻類為球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)、亞心形扁藻(Platymonassubcordiformis)和綠色巴夫藻(Pavlovaviridis)。

表1 兩種殼色文蛤生物學(xué)數(shù)據(jù)

1.2 單因素試驗(yàn)

1.2.1 單胞藻種類及密度對(duì)文蛤幼貝濾水率影響試驗(yàn)

從養(yǎng)殖池中挑選規(guī)格相近的紅、黃兩種文蛤進(jìn)行濾水率試驗(yàn)。試驗(yàn)海水經(jīng)沙濾和煮沸處理，鹽度29，水溫21 ℃，pH 8.7，光照度約7000 lx。試驗(yàn)前用上述海水暫養(yǎng)1 d，然后將各450粒的紅、黃文蛤置于1000 mL燒杯中進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)燒杯中放10粒文蛤。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，將球等鞭金藻和綠色巴夫藻的密度梯度設(shè)為5×104、10×104、15×104、20×104、25×104個(gè)/mL，亞心形扁藻密度2×104、4×104、6×104、8×104、10×104個(gè)/mL，并設(shè)3組平行。在試驗(yàn)開始時(shí)和1 h后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)藻類密度，根據(jù)藻類密度變化計(jì)算文蛤的濾水率。

1.2.2 溫度對(duì)文蛤幼貝濾水率影響試驗(yàn)

設(shè)置5個(gè)溫度梯度：18、21、24、27、30 ℃，并設(shè)3組平行。室溫18 ℃，用加熱板水浴調(diào)控溫度，試驗(yàn)鹽度29，pH 8.7，各試驗(yàn)組投喂10×104個(gè)/mL球等鞭金藻，試驗(yàn)裝置及方法同1.2.1。

1.2.3 鹽度對(duì)文蛤幼貝濾水率影響試驗(yàn)

設(shè)5個(gè)鹽度梯度：13、17、21、25、29，并設(shè)3組平行。根據(jù)1.2.2試驗(yàn)結(jié)果，用加熱板水浴加熱，溫度調(diào)至27 ℃，每個(gè)試驗(yàn)組投喂10×104個(gè)/mL球等鞭金藻，試驗(yàn)裝置及方法同1.2.1。

1.3 多因素試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以文蛤?yàn)V水率為指標(biāo)，運(yùn)用Box-Behnken模型，選擇三因素三水平的中心組合方案，以水體鹽度、水體溫度和藻類密度(所用藻類為球等鞭金藻)為主要考察因素，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平編碼見表2，試驗(yàn)裝置及方法同1.2.1。

表2 因素水平

1.4 濾水率的測(cè)定

文蛤?yàn)V水率(RF)按下式計(jì)算[3]：

式中，C0為藻類的起始密度，Ct為試驗(yàn)結(jié)束時(shí)藻類的密度，t為試驗(yàn)時(shí)間，V為試驗(yàn)水的體積，N為試驗(yàn)文蛤的數(shù)量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

單因素試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均用SPSS 19.0和Excel 2016進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并用Origin 8.0作圖。多因素試驗(yàn)用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面法分析。試驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同藻種類及其密度對(duì)文蛤幼貝濾水率的影響

2015年，26歲的青年導(dǎo)演畢贛，憑借其編劇導(dǎo)演的電影《路邊野餐》，斬獲第52屆臺(tái)灣電影金馬獎(jiǎng)最佳新導(dǎo)演獎(jiǎng)、第68屆洛迦諾國(guó)際電影節(jié)當(dāng)代電影人單元最佳新導(dǎo)演獎(jiǎng)等獎(jiǎng)項(xiàng)。3年后，他攜新作《地球最后的夜晚》歸來。

文蛤幼貝對(duì)3種藻類的濾水率在一定密度范圍內(nèi)均呈先增后減的趨勢(shì)(圖1～圖3)。球等鞭金藻密度為10×104個(gè)/mL時(shí)，紅、黃兩種文蛤?yàn)V水率均達(dá)到最大，分別為(1.39±0.14) mL/(個(gè)·min)和(1.44±0.09) mL/(個(gè)·min)；綠色巴夫藻密度為10×104個(gè)/mL時(shí)，紅黃兩種文蛤?yàn)V水率達(dá)到最大，分別為(1.49±0.09) mL/(個(gè)·min)和(1.55±0.17) mL/(個(gè)·min)；亞心形扁藻密度為6×104個(gè)/mL時(shí)，紅、黃文蛤?yàn)V水率最大，分別為(1.31±0.25) mL/(個(gè)·min)和(1.41±0.33) mL/(個(gè)·min)。方差分析表明，在不同藻類密度下，文蛤?yàn)V水率差異顯著(P<0.05)，然而紅、黃兩種文蛤幼貝在相同藻類密度下濾水率均差異不顯著(P>0.05)。此外，文蛤幼貝對(duì)球等鞭金藻和綠色巴夫藻的濾水率顯著高于對(duì)亞心形扁藻的濾水率(P<0.05)。

2.1.2 不同溫度對(duì)文蛤幼貝濾水率的影響

不同溫度條件下，紅、黃兩種文蛤幼貝的濾水率見圖4。水溫為18～27 ℃時(shí)，文蛤的濾水率隨溫度的升高而升高；在27 ℃時(shí)，紅、黃兩種文蛤?yàn)V水率達(dá)到最高，均為(1.61±0.20) mL/(個(gè)·min)；超過27 ℃后，濾水率呈下降趨勢(shì)。方差分析表明，溫度對(duì)文蛤?yàn)V水率影響顯著(P<0.05)，紅、黃兩種文蛤在各溫度梯度下濾水率差異不顯著(P>0.05)。

圖1 不同球等鞭金藻密度對(duì)文蛤?yàn)V水率的影響

圖2 不同綠色巴夫藻密度對(duì)文蛤?yàn)V水率的影響

圖4 不同溫度對(duì)文蛤?yàn)V水率的影響

2.1.3 不同鹽度對(duì)文蛤幼貝濾水率的影響

在不同鹽度條件下，文蛤幼貝的濾水率隨鹽度的增大而增大，當(dāng)達(dá)到一定鹽度時(shí)，濾水率反而下降。紅、黃兩種文蛤在鹽度為21時(shí)濾水率達(dá)到峰值，均為(1.74±0.21) mL/(個(gè)·min)(圖5)。方差分析表明，鹽度對(duì)紅、黃文蛤?yàn)V水率的影響顯著(P<0.05)，但相同鹽度條件下，紅、黃文蛤?yàn)V水率差異不顯著(P>0.05)。

圖5 不同鹽度對(duì)文蛤?yàn)V水率的影響

2.2 多因素試驗(yàn)響應(yīng)面法分析

單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示，紅、黃文蛤?yàn)V水率在同等條件下有差異，但不顯著。結(jié)合紅文蛤生長(zhǎng)快于黃文蛤的結(jié)果(圖6)，為進(jìn)一步研究文蛤紅殼色選育系的生長(zhǎng)性能，選擇紅文蛤進(jìn)行多因素養(yǎng)殖條件優(yōu)化(表3)。利用Design-Expert 8.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)表3中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到文蛤稚貝濾水率的二次多項(xiàng)式回歸模型的各項(xiàng)系數(shù)，文蛤幼貝濾水率預(yù)測(cè)值(RF)對(duì)編碼自變量鹽度(A)、溫度(B)和藻類密度(C)的二次多項(xiàng)回歸方程為：

RF=1.85+2.955×10-3A-0.11B-0.032C+0.032AB+0.032AC-0.054BC-0.21A2-0.36B2-0.23C2。

文蛤幼貝濾水率預(yù)測(cè)值(RF)對(duì)實(shí)際值自變量鹽度(A)、溫度(B)和藻類密度(C)的二次多項(xiàng)回歸方程為：

RF=-32.07+0.48A+2.09B+0.24C+2.63×10-3AB+1.62×10-3AC-3.61×10-3BC-0.01A2-0.04B2-9.38×10-3C2。

圖6 兩種文蛤生長(zhǎng)數(shù)據(jù)

表3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

模型方差分析結(jié)果(表4)顯示，F(xiàn)=65.96，P<0.0001，模型的相關(guān)系數(shù)(r2)為0.9883，修正系數(shù)(Adj r2)的值為0.9734，表明該模型的擬合度較好，預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)值高度吻合。因此，可用該模型來分析和預(yù)測(cè)文蛤?yàn)V水率的大小。本試驗(yàn)的精確度為22.949%，說明本試驗(yàn)結(jié)果可信。另外,由表4可見，溫度對(duì)文蛤?yàn)V水率的線性效應(yīng)影響顯著(P<0.05)，而鹽度和藻類密度對(duì)文蛤?yàn)V水率的線性效應(yīng)影響不顯著(P>0.05)。鹽度、溫度以及藻類密度對(duì)文蛤?yàn)V水率的曲面效應(yīng)影響極顯著(P<0.01)，而各兩兩因素的交互效應(yīng)影響均不顯著(P>0.05)。因此需要將交互作用項(xiàng)剔除，對(duì)模型重新進(jìn)行回歸。方差分析結(jié)果見表5。此時(shí)編碼值方程為：RF=1.85+0.024A-0.11B-0.02C-0.21A2-0.38B2-0.24C2。實(shí)際值方程為：RF=-32.07+0.48A+2.09B+0.24C-0.01A2-0.04B2-9.38×10-3C2。根據(jù)修正后文蛤幼貝濾水率的二次多項(xiàng)式回歸方程繪制響應(yīng)面圖見圖7。由圖7可見，鹽度、溫度和藻類密度對(duì)文蛤?yàn)V水率的影響和單因素試驗(yàn)結(jié)果一致，均是隨著每個(gè)單因素的增大，呈現(xiàn)先增后減的變化規(guī)律。根據(jù)上述所建立的數(shù)學(xué)模型，得出文蛤?yàn)V水率最佳的條件為：鹽度21.82，溫度27.40 ℃，藻類密度9.96×104個(gè)/mL。此條件下文蛤?yàn)V水率的預(yù)測(cè)值為1.62 mL/(個(gè)·min)。

3 討 論

鹽度、溫度和藻種類及其密度是影響貝類濾水率的關(guān)鍵因素。鹽度對(duì)貝類滲透壓有重要影響，鹽度過高或者過低時(shí)，貝類會(huì)關(guān)閉進(jìn)出水管，緊閉雙殼，以保護(hù)機(jī)體免受侵害。這種情況下，貝類與外界的水流交換和攝食活動(dòng)停止，濾水率相應(yīng)下降，鹽度適宜時(shí)，貝類攝食活動(dòng)逐漸恢復(fù)正常，濾水率隨之增大[14]。本研究結(jié)果顯示，在鹽度13～29內(nèi)，文蛤?yàn)V水率呈先增后減的變化規(guī)律，在鹽度為21時(shí)，濾水率達(dá)到最大，與上述結(jié)論一致。另外，本試驗(yàn)結(jié)果表明，溫度的一次效應(yīng)對(duì)文蛤幼貝濾水率影響顯著(表4)，溫度為18～27 ℃，文蛤幼貝濾水率隨溫度升高而上升，超過27 ℃時(shí)，文蛤幼貝濾水率開始下降，27 ℃為文蛤幼貝的最適溫度，此時(shí)文蛤幼貝濾水率達(dá)到最大，為(1.61±0.20) mL/(個(gè)·min)。這與大竹蟶[3,13]、長(zhǎng)牡蠣[5]、馬氏珠母貝[12]等貝類濾水率隨溫度變化規(guī)律一致。Jorgensen等[15]認(rèn)為，濾食性貝類濾水率呈現(xiàn)上述變化規(guī)律有兩點(diǎn)原因，一是溫度和貝類鰓上側(cè)纖毛的擺動(dòng)頻率呈正相關(guān)，溫度升高可加快纖毛的擺動(dòng)頻率；二是溫度升高可以減小海水的黏滯性，從而增加濾水率。潘魯青等[2,5]認(rèn)為，在適宜的溫度范圍內(nèi)，溫度升高使貝類的代謝能力增強(qiáng)，濾水率上升；而當(dāng)水溫超過一定范圍時(shí)，貝類生理狀態(tài)不正常，導(dǎo)致濾水率下降。濾食性貝類對(duì)食物的粒徑大小有選擇性，對(duì)小粒徑食物的濾食效果要高于大粒徑食物[16]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，紅、黃文蛤在球等鞭金藻和綠色巴夫藻密度為10×104個(gè)/mL、亞心形扁藻密度為6×104個(gè)/mL時(shí)，濾水率達(dá)到最大。本試驗(yàn)所用球等鞭金藻和綠色巴夫藻的粒徑為6～7 μm，亞心形扁藻的粒徑為11～16 μm，在3種藻類密度均為10×104個(gè)/mL時(shí)，文蛤幼貝對(duì)球等鞭金藻、綠色巴夫藻的濾水率顯著高于對(duì)亞心形扁藻的濾水率，符合上述規(guī)律。另外，在相同藻類不同密度時(shí)，文蛤幼貝濾水率也有差異。這與紫貽貝(Mytilusgalloprovincialis)[17]和大西洋浪蛤(Spisulasolidissima)[18]濾水率隨藻類密度變化規(guī)律一致。產(chǎn)生上述現(xiàn)象的原因可能是：藻類密度過高時(shí)，會(huì)造成貝類的阻鰓現(xiàn)象，因而濾水率會(huì)降低；密度過低時(shí)，藻類不及貝類濾食，成為限制貝類濾水率的主要因素[19]。鹽度、溫度、藻類密度對(duì)文蛤幼貝濾水率的曲面效應(yīng)影響極顯著(P<0.01)，而各兩兩因素的交互效應(yīng)影響均不顯著(P>0.05)?？赡芘c鹽度、溫度、藻類密度對(duì)文蛤幼貝濾水率影響機(jī)制不同有關(guān)。因此，在實(shí)際生產(chǎn)過程中，投喂適量密度的餌料是文蛤高效養(yǎng)殖的關(guān)鍵點(diǎn)之一。

表4 回歸模型方差分析

注：r2=0.9883， Adj r2=0.9734，Adeq Precision=22.949%.

表5 修正后模型方差分析

注：r2=0.9796， Adj r2=0.9673，Adeq Precision=23.790%.

圖7 交互作用對(duì)文蛤?yàn)V水率影響的響應(yīng)面

濾水率不僅可以反映貝類的水質(zhì)凈化能力，還是反映濾食性貝類生長(zhǎng)的重要指標(biāo)之一。試驗(yàn)顯示，相同規(guī)格紅、黃文蛤在同等條件下濾水率無顯著差異，但是選育系紅文蛤生長(zhǎng)顯著高于黃文蛤。根據(jù)Carfoot[20]的能量收支基本模型：攝食能=糞便能+呼吸能+排泄能+生長(zhǎng)能，可知選育系紅文蛤在攝食能相同時(shí)，其生長(zhǎng)能高于野生群體，可推測(cè)選育系紅文蛤能量利用率高于黃文蛤。比較同等養(yǎng)殖條件下選育系紅殼色文蛤和野生群體的生長(zhǎng)情況，均得出相似結(jié)論[21-22]。

針對(duì)貝類濾水率的研究較少考察環(huán)境因素的聯(lián)合作用及曲面效應(yīng)。試驗(yàn)通過分析鹽度、溫度和藻類密度的交互作用對(duì)文蛤幼貝濾水率構(gòu)建的Box-Behnken模型擬合度很高，表明該模型能夠很好地解釋文蛤幼貝濾水率隨環(huán)境因素的變化。此外，研究文蛤幼貝濾水率的最佳條件時(shí)，還應(yīng)進(jìn)一步考慮水體pH、文蛤放養(yǎng)密度和規(guī)格、底質(zhì)條件、溶解氧水平等交互作用對(duì)濾水率的影響。利用 Design-Expert 8.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)影響文蛤?yàn)V水率的3個(gè)因素及其交互作用進(jìn)行了分析，得出文蛤的最佳濾水率條件：鹽度21.82，溫度27.40 ℃，藻類密度9.96×104個(gè)/mL。然而實(shí)際生產(chǎn)中，養(yǎng)殖條件無法做到如此精準(zhǔn)，故將養(yǎng)殖條件調(diào)整為：鹽度21，溫度27 ℃，藻類密度10×104個(gè)/mL。此養(yǎng)殖條件下實(shí)際濾水率(表3)與理論預(yù)測(cè)值相差不大，說明該模型可靠，可用于實(shí)際生產(chǎn)中。