褐牙鲆中miRNAs與甲狀腺激素受體TRβ的相互作用研究

劉素萍，付元帥，喻 杰，張俊玲，施志儀

( 上海海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室，上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，上海 201306 )

MicroRNAs(miRNAs)是一類內(nèi)源性非編碼的、大小在20～25 nt的單鏈RNA分子，它們具有分布廣泛的特點，從植物、線蟲到人類的細胞中均有存在[1]，microRNA的前體為pre-miRNA，長度約70～80 nt，其兩個臂可能分別產(chǎn)生兩種microRNA。命名規(guī)則為表達量較高的microRNA后面不加任何符號，而表達量較低的microRNA后接*號，例如mmu-miR-7和mmu-miR-7*。研究表明，miRNAs通過結(jié)合靶基因3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)的作用方式，而得以在基因的轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮其調(diào)控功能[2]。據(jù)推測miRNAs可能調(diào)控著動物基因組內(nèi)約1/3以上基因的表達，從而參與眾多生理活動的調(diào)控[3]。

褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)屬鰈形目，主要分布于中國、日本沿海，是目前我國重要的海水養(yǎng)殖魚類。在褐牙鲆胚后時期，有從仔魚向稚魚轉(zhuǎn)變的奇特現(xiàn)象，變態(tài)期間，眼睛逐漸遷移至身體同一側(cè)，魚體形態(tài)也由側(cè)臥轉(zhuǎn)變?yōu)槠脚P，生活方式也由浮游性轉(zhuǎn)變?yōu)榈讞浴Ｑ芯勘砻鳎盅丽业淖儜B(tài)發(fā)育受甲狀腺激素(TH)調(diào)控，而甲狀腺激素主要依賴于與其受體(TRs)結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用[4-5]。甲狀腺激素受體可分為不同亞型，包括TRαA、TRαB和TRβ，三者在褐牙鲆變態(tài)期間表達升高，而在變態(tài)結(jié)束后則恢復(fù)到較低的水平，且TRβ在變態(tài)高峰期較TRαA、TRαB有更豐富的表達[6]。因而，甲狀腺激素受體尤其是TRβ在褐牙鲆變態(tài)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

先前已建立了褐牙鲆變態(tài)不同時期的miRNAs和轉(zhuǎn)錄組文庫，篩選出66個在褐牙鲆變態(tài)發(fā)育的不同階段具有明顯差異性表達的miRNAs[7]。為進一步闡述miRNAs在褐牙鲆變態(tài)發(fā)育中的作用，筆者利用miRBase、RNAhybrid、PicTarWEB INTERFACE和TargetScanFish 6.2等多種生物信息學(xué)軟件預(yù)測上述差異miRNAs和褐牙鲆TRβ基因3′-UTR的結(jié)合情況，發(fā)現(xiàn)多個miRNAs分子可能作用于褐牙鲆甲狀腺激素受體TRβ基因，因而從中選取pol-miR-125a、pol-miR-214、pol-miR-460-5p、pol-miR-138和pol-miR-125a*共5個miRNAs作為研究對象，利用3′-RACE技術(shù)克隆褐牙鲆TRβ基因的3′-UTR序列，并構(gòu)建含TRβ 3′-UTR的雙熒光素酶重組報告載體，利用雙熒光素酶報告基因技術(shù)檢測上述5個miRNAs與褐牙鲆TRβ之間是否存在真實的靶向關(guān)系，為后續(xù)深入研究甲狀腺激素及相關(guān)miRNAs調(diào)控褐牙鲆變態(tài)發(fā)育的分子機制提供更多資料。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

褐牙鲆樣品的采集在中國水產(chǎn)科學(xué)研究院北戴河中心實驗站完成。取1齡半褐牙鲆成魚，解剖后取腦、肌肉等不同組織樣品，用DEPC水沖洗后，立即置于液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

Trizol Reagent(Invitrogen公司)；Reverse Transcription System(Promega公司)；3′-RACE試劑盒、Ex Taq DNA polymerase、pMD?19-T Vector、T4 DNALigase(TaKaRa公司)；SacⅠ、XbaⅠ(NEB公司)；DNA 凝膠回收試劑盒(天根生化科技有限公司)；質(zhì)粒小提取試劑盒(OMEGA公司)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑(翊圣生物科技有限公司)；293T細胞；miRNA mimics(吉瑪生物科技有限公司)，是針對miRNA的成熟體設(shè)計并合成的小片段雙鏈miRNA，以下簡稱為miRNA模擬物；胎牛血清、0.25% Trypsin-EDTA (1×) 胰蛋白酶、青霉素—鏈霉素溶液、成纖維生長因子、MEM 非必需氨基酸(GIBCO公司)；FuGENE?HD轉(zhuǎn)染試劑、pmirGLO載體(Promega公司)。

1.3 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

上述褐牙鲆組織樣品采用Trizol法提取總RNA，并將所提取的總RNA樣品在NanoDrop 2000c上測定OD260/OD280值，其比值為1.8～2.0，且1%瓊脂糖凝膠電泳顯示28S和18S條帶亮度清晰，說明提取的總RNA質(zhì)量良好，可滿足后續(xù)試驗要求。然后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照說明書的操作步驟將各總RNA樣品反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.4 TRβ 3′-UTR序列的克隆

根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心TRβ已有序列，設(shè)計3′-RACE-outer 引物、3′-RACE-inner 引物，然后按照3′-RACE試劑盒使用說明進行操作，將擴增得到的RACE PCR產(chǎn)物進行膠回收、連接、轉(zhuǎn)化和克隆測序后，得到褐牙鲆TRβ基因的3′-UTR cDNA序列。

1.5 靶向miRNAs預(yù)測

通過miRNA靶基因預(yù)測軟件 miRBase(http:∥www.mirbase.org/)，PicTarWEB INTERFACE(http:∥pictar.mdc-berlin.de/cgi-bin/PicTar_vertebrate.cgi)，TargetScanFish 6.2(http:∥www.targetscan.org/fish_62/)和 computer-based RNAhybrid(http:∥bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/submission. html)等預(yù)測與褐牙鲆TRβ基因3′-UTR相結(jié)合的miRNA分子。

1.6 重組報告載體的構(gòu)建

根據(jù)已克隆的褐牙鲆TRβ 3′-UTR cDNA序列設(shè)計構(gòu)建重組質(zhì)粒所需目的片段的PCR引物，同時加入SacⅠ和XbaⅠ酶切位點(下劃線部分)：

3′-TRβSacIF：5′-TCTAGTTGTTTAAACGAGC TCCCAATGGATTCAAGTGAATGC-3′， 3′-TRβXbaIR： 5′-TGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGCAGGCA AGGGGGGGGTT-3′。

利用上述cDNA為模板，3′-TRβSacIF和3′-TRβXbaIR為PCR引物，進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系包含1.0 μL cDNA、2.0 μL 10×Ex Taq Buffer、1.6 μL dNTP Mixture(2.5 mmol/L)、1.0 μL上游引物(10 μmol/L)、1.0 μL下游引物(10 μmol/L)、1.6 μL MgCl2(25 mmol/L)、0.2 μL ExTaq Ploymerase和11.6 μL ddH2O。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，35次循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃ 保持。將PCR產(chǎn)物進行膠回收、連接、轉(zhuǎn)化和克隆測序后，抽提質(zhì)粒DNA，并用NanoDrop 2000c檢測含量和純度。

用SacⅠ和XbaⅠ限制性內(nèi)切酶對含有目的片段3′-UTR序列的質(zhì)粒和pmirGLO雙熒光素酶報告基因載體進行雙酶切，將酶切反應(yīng)液進行瓊脂糖凝膠電泳分析，并將目的片段純化回收，經(jīng)含量和純度測定后用于后續(xù)試驗；用T4 DNA連接酶將上述酶切的目的片段和報告基因載體進行連接，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化后隨機挑取若干陽性克隆抽提重組質(zhì)粒，并進一步利用雙酶切和測序?qū)χ亟M質(zhì)粒進行鑒定。

1.7 細胞轉(zhuǎn)染試驗

將293T細胞置于DMEM高糖培養(yǎng)基內(nèi)在37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)；每隔1～2 d 更換一次培養(yǎng)基；當(dāng)細胞長滿時，用1×PBS清洗兩次，0.25%的胰蛋白酶消化90 s，待多數(shù)細胞變圓即將脫壁時吸除消化液，加入新鮮培養(yǎng)基，以一傳二模式進行傳代培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前將293T細胞接種于24孔板，每孔加入500 μL細胞，細胞匯合度達80%時進行轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染第一步為將細胞培養(yǎng)液換成50 μL不含抗生素的新鮮DMEM培養(yǎng)基。

用新鮮DMEM培養(yǎng)基將0.8 μg重組質(zhì)粒、24 pmol miRNA模擬物、0.6 μL平衡至室溫的FuGENE?HD分別稀釋至25 μL，F(xiàn)uGENE?HD混合液總數(shù)與重組質(zhì)粒、miRNA模擬物混合液總數(shù)相等，試驗重復(fù)3次。隨后將FuGENE?HD轉(zhuǎn)染試劑/重組質(zhì)粒/miRNA 模擬物混合液分別加入相應(yīng)細胞培養(yǎng)孔中，吹吸混勻，將細胞放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h，用新鮮培養(yǎng)基替換細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)18～39 h。

1.8 雙熒光素酶報告基因檢測

將雙熒光素酶報告檢測試劑盒中試劑按說明書要求進行配置；吸除細胞培養(yǎng)液，用1×PBS清洗細胞后加入PLB細胞裂解液(200 μL/孔，24孔板)，并于室溫下?lián)u晃裂解15 min，最終將細胞裂解液分別轉(zhuǎn)移至檢測管；在檢測儀上選擇相應(yīng)程序，向檢測離心管的細胞裂解液中加入 100 μL LAR Ⅱ吹吸混勻，置于發(fā)光檢測儀中檢測螢火蟲熒光素酶活性，記錄數(shù)值a；再向檢測離心管中加入100 μL Stop & Glo?試劑，立即吹吸混勻，置于發(fā)光檢測儀中檢測海腎螢光素酶活性，記錄數(shù)值b；計算a/b。用SigmaPlot 12.5 軟件作圖并通過單因素方差分析檢驗各組數(shù)據(jù)顯著性差異，當(dāng)P<0.05時表示有顯著差異，P<0.01時表示有極顯著差異。

2 結(jié) 果

2.1 TRβ 3′-UTR序列的克隆

采用3′-RACE技術(shù)從褐牙鲆成魚各組織混合總RNA中成功擴增出一段長為437 bp的特異性條帶(圖1)。將該片段純化回收后連接到pMD19-T克隆載體，挑選陽性克隆進行DNA測序，結(jié)果顯示，獲得的目的序列為褐牙鲆TRβ基因的3′-UTR cDNA序列。

圖1 褐牙鲆TRβ 3′-UTR的克隆

2.2 miRNAs結(jié)合位點的預(yù)測

pol-miR-125a、pol-miR-138、pol-miR-214、pol-miR-460-5p和pol-miR-125a*與褐牙鲆TRβ基因3′-UTR的潛在結(jié)合位點見表1，5個miRNAs的第2～8位種子序列分別與TRβ 3′-UTR完全互補結(jié)合，表明褐牙鲆TRβ基因很可能是5個miRNAs的潛在靶基因。

2.3 重組報告載體的構(gòu)建與鑒定

雙酶切驗證結(jié)果顯示，重組質(zhì)?？梢员幻盖谐膳c預(yù)期大小相符合的目的片段和pmirGLO報告載體片段(圖2)。此外，測序結(jié)果也表明上述構(gòu)建的雙熒光素酶報告基因重組質(zhì)粒是正確的，將其命名為pmirGLO-TRβ-3′-UTR。

表1 褐牙鲆miRNAs和TRβ 3′-UTR的結(jié)合位點

(續(xù)表1)

圖2 重組質(zhì)粒的雙酶切驗證

2.4 靶基因的驗證結(jié)果

雙熒光素酶檢測結(jié)果(圖3)顯示，轉(zhuǎn)染miR-125a模擬物后，熒光素酶活性明顯低于陰性對照組，二者具有極顯著差異(P<0.01)；同樣，與陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染pol-miR-138、pol-miR-214和pol-miR-460-5p模擬物后，其熒光素酶活性也都分別顯著降低(P<0.05)；但是轉(zhuǎn)染miR-125a*模擬物組的熒光素酶活性與陰性對照組相比，無顯著差異(P>0.05)(圖3)。這些結(jié)果表明，pol-miR-125a、pol-miR-138、pol-miR-214和pol-miR-460-5p能在細胞水平直接調(diào)節(jié)TRβ基因表達，而pol-miR-125a*則不能直接調(diào)節(jié)TRβ基因的表達。

3 討 論

本試驗通過3′-RACE技術(shù)克隆得到褐牙鲆TRβ基因的3′-UTR序列，同時在參考文獻[8]的方法后，通過采用PCR擴增技術(shù)將特異的限制性內(nèi)切酶位點以及基因重組技術(shù)引入，從而得以成功構(gòu)建褐牙鲆TRβ基因的雙熒光素酶報告重組載體，其可作為多個miRNAs的靶標(biāo)檢測工具；同時本試驗還在此基礎(chǔ)上通過細胞轉(zhuǎn)染操作技術(shù)以及雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析了5個miRNAs與潛在靶基因褐牙鲆TRβ基因間的作用關(guān)系，本試驗結(jié)果最終證實，褐牙鲆TRβ能夠在細胞水平對pol-miR-125a、pol-miR-138、pol-miR-214和pol-miR-460-5p進行直接調(diào)節(jié)，但并不能在細胞水平對pol-miR-125a*進行直接調(diào)節(jié)，表明褐牙鲆TRβ不是能夠?qū)ol-miR-125a*作用的真實靶基因。

3.1 報告基因載體的選擇

首先，pmir-GLO載體是一款目前在眾多關(guān)于靶基因的研究中使用較多的雙熒光素酶報告載體。其試驗原理為：利用熒光素作為底物來檢測螢火蟲熒光素酶的活性[9]，在淬滅熒光反應(yīng)后非常迅速地將腔腸素作為底物加入到試管中隨后放至儀器上快速檢測海腎熒光素酶的活性，將海腎熒光素作為內(nèi)參可以用來減少內(nèi)在因素的一些變化從而減少對試驗所造成的影響。其次，本研究采用的miRNA 模擬物，具有能模擬細胞中內(nèi)源性成熟的miRNA的高水平表達的功能，其直接優(yōu)點為增強內(nèi)源性miRNA的調(diào)控作用[10]。另外在操作方面，miRNA 模擬物由于只需用轉(zhuǎn)染試劑將其包裹便可較大概率轉(zhuǎn)染進入細胞，此操作由于不需要額外構(gòu)建載體，所以具有簡單、高效、靈敏、安全無毒等顯著優(yōu)勢。據(jù)此，本試驗利用以上兩種工具成功構(gòu)建了應(yīng)用于miRNA靶標(biāo)檢測的pmirGLO-TRβ-3′-UTR重組報告質(zhì)粒，并在細胞水平進行了靶基因驗證。

3.2 miRNA在魚類發(fā)育中的作用

通過已有的研究結(jié)果，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)眾多miRNAs在褐牙鲆變態(tài)期間呈現(xiàn)出非常明顯的差異性表達[7]。構(gòu)建斑馬魚(Daniorerio)不同發(fā)育階段的miRNA文庫后，鑒定出了與斑馬魚生長發(fā)育相關(guān)的217 個miRNAs[11]，其中有一部分的miRNAs功能已經(jīng)被成功注釋，如pol-miR-125b被發(fā)現(xiàn)與斑馬魚腦發(fā)育相關(guān)[12]以及pol-miR-126 和pol-miR-150 能夠協(xié)同調(diào)控紅細胞與巨噬細胞的發(fā)育狀況[13]，而pol-miR-143與斑馬魚心室的形成聯(lián)系緊密[14]，以及pol-miR-451能夠?qū)Π唏R魚紅細胞成熟程度進行相關(guān)調(diào)控[15]等。另外在青鳉(Oryziaslatipes)中，同樣有許多miRNAs能夠參與調(diào)控其生長發(fā)育，如pol-miR-202-5p與青鳉的生殖細胞特異相關(guān)，在青鳉的性別分化以及生殖細胞發(fā)育等方面發(fā)揮著非常重要的作用[16]。盧榮華等[17]綜述了9種魚類的miRNAs序列收錄情況，多種miRNAs參與了魚類的生長、發(fā)育及諸多生理過程。這些研究表明，miRNAs在魚類生長、發(fā)育和變態(tài)中可能發(fā)揮極其重要的作用。

圖3 轉(zhuǎn)染各miRNAs模擬物后重組質(zhì)粒熒光素酶的活性變化

3.3 miRNAs與TRβ基因的作用關(guān)系

以上信息表明，甲狀腺激素及其受體基因在褐牙鲆變態(tài)中的發(fā)揮極其重要的作用，因此，本研究首先利用生物信息學(xué)方法對作用于褐牙鲆TRβ基因的miRNAs進行預(yù)測，綜合考慮后從中挑選出了5個可能性最大的miRNAs，隨后利用雙熒光素酶報告基因技術(shù)分別檢測了這5個miRNAs在細胞水平對TRβ基因表達的作用結(jié)果。通過文獻查閱可知，這5個miRNAs在腫瘤發(fā)生、增殖和遷移中有較多的報道[18-20]，但目前在魚類中的研究較少。通過已有資料顯示，pol-miRNA-214能夠參與調(diào)控斑馬魚肌肉細胞的發(fā)育[21-22]；pol-miRNA-138在斑馬魚心臟發(fā)育過程中, 能控制心房的發(fā)育，在敲除pol-miR-138后，可使斑馬魚出現(xiàn)心房心室發(fā)育異常以及心臟功能異常等現(xiàn)象[23]。謝彩霞等[24]研究報道，pol-miR-125b在褐牙鲆變態(tài)發(fā)育過程中有顯著性表達，而pol-miR-125b與pol-miR-125a 高度同源，這一結(jié)果表明，pol-miR-125a 極有可能與褐牙鲆的變態(tài)發(fā)育存在某種聯(lián)系。并且，這5個miRNAs均為先前篩選鑒定出來的在褐牙鲆變態(tài)期間存在差異表達的miRNAs范圍之內(nèi)，這些研究結(jié)果綜合表明，以上5個miRNAs(pol-miR-125a、pol-miR-138、pol-miR-214、pol-miR-460-5p和pol-miR-125a*)在魚類發(fā)育以及褐牙鲆變態(tài)中極有可能發(fā)揮著重要的作用，對以上所有資料信息進行綜合考慮后，選擇這5個miRNAs作為研究對象，并最終在細胞水平上成功驗證了其與褐牙鲆TRβ基因之間的作用關(guān)系，為后續(xù)繼續(xù)深入研究這些miRNAs在褐牙鲆變態(tài)及發(fā)育中的功能及作用機制奠定了理論基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本試驗通過3′-RACE技術(shù)克隆得到褐牙鲆TRβ基因的3′-UTR序列，并利用PCR擴增、基因重組技術(shù)成功構(gòu)建了應(yīng)用于miRNAs靶標(biāo)檢測的pmirGLO-TRβ-3′-UTR重組報告載體；通過細胞轉(zhuǎn)染和雙熒光素酶報告基因技術(shù)分析了5個miRNAs與褐牙鲆TRβ基因間的作用關(guān)系，結(jié)果表明，褐牙鲆TRβ是pol-miR-125a、pol-miR-138、pol-miR-214和pol-miR-460-5p在細胞水平直接調(diào)節(jié)的靶基因，而不是pol-miR-125a*作用的真實靶基因。