miR-129-2靶向調(diào)節(jié)SOX4表達(dá)對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

廖鴻力，林 鵬，葉 瓊

(1.溫州市中心醫(yī)院病理科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，浙江 溫州 325000)

子宮內(nèi)膜癌為子宮內(nèi)膜的一組上皮性惡性腫瘤，近年來發(fā)病率逐年升高，對(duì)女性的身心健康產(chǎn)生了嚴(yán)重影響[1]。已有研究指出無孕激素抵抗的雌激素長(zhǎng)期刺激可誘發(fā)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生，但臨床中尚未明確其發(fā)病機(jī)制，也有研究表面子宮內(nèi)膜癌是原癌基因激活、抑癌基因失活、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)異常所致[2]。多數(shù)狀態(tài)下，癌癥是由異常全基因組的低甲基化和局部CpG島高甲基化所致，幾乎所有哺乳動(dòng)物中的DNA甲基化均發(fā)生在CpG島內(nèi)，該區(qū)域的甲基化與基因的轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)。臨床中抑制對(duì)某些抑癌基因和致癌基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控可影響細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡等。研究發(fā)現(xiàn)miRNA在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中均存在異常表達(dá)，miR-129-2低表達(dá)為常預(yù)示結(jié)腸癌患者的不良預(yù)后且在HER-2陽性的胃癌和乳腺癌患者體內(nèi)miR-129表達(dá)也出現(xiàn)下調(diào)[3]。SOX4基因定位于人類染色體6p.23上，可編碼一種分子量47kD含474個(gè)氨基酸的蛋白，位于N端的HMG結(jié)構(gòu)域和C端的TAD結(jié)構(gòu)域是SOX4發(fā)揮功能的主要區(qū)域。SOX基因的異常改變與多種腫瘤的發(fā)生和惡性生物學(xué)行為息息相關(guān)[4]。已有研究顯示，在多種實(shí)體腫瘤中有SOX4基因的過量表達(dá)，并與患者的不良預(yù)后有關(guān)[5]。為探索子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移分子機(jī)制，確立防治靶點(diǎn)，尋求新的治療策略，本研究以期通過實(shí)驗(yàn)探討miR-129-2靶向調(diào)節(jié)SOX4表達(dá)對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1資料與方法

1.1一般資料

子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株Ishikawa由中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫購入。購入60只雄性SPF級(jí)裸鼠，2月齡，體質(zhì)量為18～22g，平均(20.02±1.28)g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購入，合格證編號(hào)為：SYXK(桂)2019-1001，本研究遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)條例》。

人體組織標(biāo)本由本院病理實(shí)驗(yàn)室提供，來自本院近年接診的婦女患者術(shù)前診斷和術(shù)中病理所采集樣本，包括66例子宮內(nèi)膜癌組織，42例正常子宮內(nèi)膜組織。

1.2材料

TES裂解緩沖液：100mM NaCL，25mM EDTA(pH=8.0)，10mM Tris-HCl(pH=8.0)，1%SDS；RNaseA(10mg/mL)終濃度為0.05mg/mL；蛋白酶K(20mg/mL)終濃度為0.1mg/mL；氯仿；Tris-飽和酚；無水乙醇；乙酸鈉溶液(3M，pH=5.0)；1mM EDTA(pH=8.0)；TE溶液：10mM Tris-HCl(pH=8.0)。

PCR 2x HotStar Taq MasterMix；限制性內(nèi)切酶；瓊脂糖；高保真性PCR擴(kuò)增試劑盒；DNA marker；TAE電泳緩沖液：100mmol/L EDTA，2mol/L Tris堿，1mol/L冰乙酸；PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒。

DMEM低糖細(xì)胞培養(yǎng)基；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒；質(zhì)粒提取試劑盒；MTT；SOX4多克隆抗體；嘌呤霉素；鏈霉素和青霉素；載體miRNASelectTMpEGP-miR。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

使用含10%胎牛血清、100μg/mL鏈霉素和100U/mL青霉素DMEM低糖細(xì)胞培養(yǎng)基于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)行常規(guī)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Ishikawa細(xì)胞，以0.25%胰蛋白酶消化后支撐細(xì)胞懸液，接種在96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每組4個(gè)平行孔，每孔細(xì)胞密度為5 000個(gè)。在培養(yǎng)箱內(nèi)過夜，若細(xì)胞融合度達(dá)到70%，按照LipofectamineTM2000說明書步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后6h更換含有血清的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h以便進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組。

1.4 DNA提取

①取100mg液氮內(nèi)凍存的組織，置于液氮研缽內(nèi)，并裝入2mL鋼珠離心管內(nèi)，震蕩至粉末狀；②加180μL ALT裂解緩沖液，20μL蛋白酶K溶液，混勻置于37℃水浴消化過夜；③依據(jù)試劑盒提取DNA，-20℃保存待測(cè)。

使用6cm培養(yǎng)基培養(yǎng)，回合率為90%時(shí)收取細(xì)胞沉淀，按照試劑盒抽提法提取細(xì)胞系基因組DNA。

1.5甲基化檢測(cè)

①建立酶切反應(yīng)預(yù)混合液；②混合液混合后取等量于200μL PCR反應(yīng)管內(nèi)建立酶切反應(yīng)；③將反應(yīng)管置于普通PCR反應(yīng)儀內(nèi)，37℃下4～6h，95℃下10min，處理后樣本置于—20℃下保存待測(cè)；④在基因CpG島區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)引物，所擴(kuò)增DNA片段含有兩個(gè)HhaI酶切位點(diǎn)，并確保酶切效率。

1.6 MTT檢測(cè)

上述轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在終止前4h每孔內(nèi)加入5g/L MTT溶液20μL內(nèi)，孵育4h后棄上清液，加150μL二甲基亞砜后振蕩10min，結(jié)晶物完全溶解后，在熒光酶聯(lián)分析儀上測(cè)光吸收值，使用490nm波長(zhǎng)，重復(fù)三次。

1.7 Western Blot檢測(cè)

收集細(xì)胞用蛋白裂解液，處理并取上清液，取各組蛋白30μL于8%SDS-PAGE電泳電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，使用脫脂奶粉封閉1h，覆上1∶100的SOX4兔單抗過夜，使用TBST洗滌3次，10min/次。加入1∶200的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗，37℃下孵育1h，洗膜后使用含有化學(xué)發(fā)光劑的水溶液激發(fā)熒光，暗室內(nèi)壓片，顯影，定影，分析圖像。

1.8建立裸鼠模型

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞經(jīng)胰酶消化、離心、收集、計(jì)數(shù)，制備5×107個(gè)/mL細(xì)胞懸液注入裸鼠腋窩中部背側(cè)皮下，腋下接種0.2mL/只，1周后出現(xiàn)腫瘤，每3d測(cè)量一次裸鼠的體重和瘤體大小，計(jì)算腫瘤體積。30d后處死裸鼠取瘤組織稱重，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率=(1-處理組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重)×100%。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1 miR-129-2在子宮內(nèi)膜細(xì)胞中的甲基化狀態(tài)

Ishikawa細(xì)胞系中miR-129-2啟動(dòng)子區(qū)甲基化強(qiáng)度為74.47%。本研究中所選取的66例子宮內(nèi)膜癌組織中38例存在miR-129-2啟動(dòng)子區(qū)高甲基化(占57.58%)，且癌旁組織內(nèi)無甲基化。Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、轉(zhuǎn)染高表達(dá)組的子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中SOX4蛋白表達(dá)量分別為0.43±0.01、0.34±0.03、0.10±0.04，高表達(dá)組的SOX4蛋白表達(dá)量顯著低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(t值分別為2.436、3.786，均P<0.05)，陰性對(duì)照組則顯著低于空白對(duì)照組(t=2.897，P<0.05)，各組SOX4蛋白表達(dá)見圖1。

圖1各組SOX4蛋白表達(dá)

Figure 1 SOX4 protein expression in each group

2.2 miR-129-2在子宮內(nèi)膜癌及正常子宮內(nèi)膜組織樣本中的表達(dá)

將β-actin作為內(nèi)參基因，將miR-129-2與各組的β-actin差值作為樣本中目的基因的mRNA表達(dá)水平，比較66例子宮內(nèi)膜癌組織和42例正常子宮內(nèi)膜組織的miR-129-2表達(dá)，結(jié)果顯示其在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)為0.001±0.001，顯著低于正常子宮內(nèi)膜組織的0.003±0.002(t=6.020，P=0.000)。

2.3各組Ishikawa細(xì)胞不同時(shí)間增殖活性比較

3組Ishikawa細(xì)胞培養(yǎng)24h、48h、72h、96h和120h細(xì)胞增殖能力比較均有顯著性差異(均P<0.05)，其中miR-129-2高表達(dá)組細(xì)胞增殖能力最低。進(jìn)一步每?jī)山M之間比較顯示miR-129-2高表達(dá)組在48h、72h、96h、120h時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖能力均顯著低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(t值為2.356～10.987，均P<0.05)，而陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值為0.980～1.235，均P>0.05)，見表1。

2.4 miR-129-2對(duì)裸鼠體質(zhì)量及移植瘤重量的影響

3組裸鼠瘤體濕重、終體積、腫瘤相對(duì)體積比較均有顯著性差異(均P<0.05)，其中miR-129-2上述指標(biāo)最低。進(jìn)一步每?jī)山M之間比較顯示miR-129-2高表達(dá)組瘤體濕重、終體積、腫瘤相對(duì)體積均顯著低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(t值為3.124～19.446，均P<0.05)，而陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值為0.884～1.459，均P>0.05)，見表2。

表1 各組Ishikawa細(xì)胞不同時(shí)間增殖活性比較

表2 miR-129-2對(duì)裸鼠體質(zhì)量及移植瘤重的影響

2.5miR-129-2對(duì)子宮內(nèi)膜癌的診斷價(jià)值分析

進(jìn)一步探討miR-129-2對(duì)子宮內(nèi)膜癌預(yù)測(cè)診斷價(jià)值，以子宮內(nèi)膜癌組織為陽性樣本(n=66)，以正常子宮內(nèi)膜組織為陰性樣本(n=42)，建立ROC診斷分析模型。將miR-129-2的表達(dá)量分成7-10個(gè)組段。結(jié)果顯示該指標(biāo)對(duì)子宮內(nèi)膜癌具有較高的診斷價(jià)值，ROC-AUC為0.768。理論閾值點(diǎn)為0.002，對(duì)應(yīng)的敏感度和特異度分別為0.772、0.745，見圖2。

圖2 miR-129-2對(duì)子宮內(nèi)膜癌的診斷價(jià)值ROC曲線

3討論

3.1 miR-129與子宮內(nèi)膜癌的關(guān)系

近年來我國(guó)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生率逐年增長(zhǎng)，抑癌基因和癌基因異常變化均是促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的重要機(jī)制之一[6]。子宮內(nèi)膜癌的分期與臨床治療和預(yù)后均有密切相關(guān)性，中晚期或轉(zhuǎn)移子宮內(nèi)膜癌患者5年內(nèi)生存率不足30%[7]。盡管臨床中的經(jīng)陰道超聲檢查、經(jīng)腹超聲檢查、MRI、CT對(duì)子宮內(nèi)膜癌具有較佳的診斷性和敏感性，但結(jié)構(gòu)和形式的變化常滯于腫瘤功能障礙后。因此尋找與腫瘤生物學(xué)行為相近，且敏感性和特異性較高的分子標(biāo)志物，是提高子宮內(nèi)膜癌早期診斷和臨床預(yù)后的重要途徑[8]。

miR-129與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切相關(guān)性，可通過調(diào)控細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、免疫系統(tǒng)和腫瘤耐藥等途徑參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程。有研究指出食管鱗狀細(xì)胞癌中miR-129表達(dá)下調(diào)，可下調(diào)周期相關(guān)蛋白進(jìn)而抑制癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移[9]?？紤]SOX4基因主要在胚胎發(fā)育過程中表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心臟和胸腺，可穩(wěn)定干細(xì)胞，因此其突變、缺失、過量表達(dá)等均可能導(dǎo)致先天性疾病的發(fā)生，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。已有研究證實(shí)多種實(shí)體腫瘤中均存在SOX4基因過量表達(dá)，且常預(yù)示不良預(yù)后[10]。本研究由miR-129-2靶向調(diào)節(jié)SOX4表達(dá)入手進(jìn)行研究，觀察其對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，以期能為后期臨床診斷、治療提供參考。

通過通量甲基化檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，人們加深了對(duì)腫瘤發(fā)生前后各階段整體基因組甲基化模式變化的認(rèn)識(shí)。miR-129-2為miRNA家族之一，其異常表達(dá)與細(xì)胞周期的阻滯、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡和衰老相關(guān)。已有計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)miR-129-2的下游基因?yàn)镾OX4，其為某種原癌基因，在Wnt通路中有重要作用[11]。不同類型的腫瘤組織中miR-129-2均呈現(xiàn)低表達(dá)，包括胃癌、結(jié)腸癌、食管鱗癌、膀胱癌等，但目前臨床中尚未明確miR-129-2在子宮內(nèi)膜癌中的作用機(jī)制[12]。本研究結(jié)果顯示，Ishikawa細(xì)胞系中miR-129-2啟動(dòng)子區(qū)甲基化強(qiáng)度為74.47%。本研究中所選取的66例子宮內(nèi)膜癌組織中38例存在miR-129-2啟動(dòng)子區(qū)高甲基化(占57.58%)，且癌旁組織內(nèi)無甲基化。高表達(dá)組的Ishikawa細(xì)胞中SOX4蛋白表達(dá)量顯著低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.05)，陰性對(duì)照組則顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)。miR-129-2在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)顯著低于正常子宮內(nèi)膜組織(P=0.000)。

3.2miR-129在預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜癌中的價(jià)值

鑒于DNA甲基化為潛在的可逆表現(xiàn)遺傳變化，因此臨床中可考慮給予患者脫甲基作用抑制劑進(jìn)行抗癌治療。目前已有研究指出SOX4基因在肝癌患者體內(nèi)組織中過度表達(dá)，且與術(shù)后早期高危復(fù)發(fā)有密切相關(guān)性，但其表達(dá)水平與患者的年齡、性別、腫瘤直徑、Edmonson分級(jí)、乙肝表面抗原等無關(guān)，其高表達(dá)可作為臨床判斷肝癌預(yù)后的指標(biāo)之一[13]。Andersend等于2009年報(bào)道，SOX4高表達(dá)的結(jié)直腸癌腫瘤患者具有較高的復(fù)發(fā)率，總生存率較低。以上實(shí)驗(yàn)提示SOX4可作為癌基因參與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。本研究中子宮內(nèi)膜癌組織中miR-129-2的表達(dá)均低于癌旁組織，且miR-129-2能夠降低子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞的增殖能力，并隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)抑制作用增強(qiáng)。β-actin與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合啟動(dòng)Wnt信號(hào)通路，miR-120-2高表達(dá)組大鼠體內(nèi)SOX4的DNA結(jié)合部位與轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合部位相似度較高，Wnt信號(hào)通路激活，進(jìn)而抑制了子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞毒增殖能力[14]。沉默SOX4基因表達(dá)后可降低腫瘤細(xì)胞中核轉(zhuǎn)錄因子kB的表達(dá)，同時(shí)P53蛋白穩(wěn)定性增強(qiáng)，凋亡抑制因子Survivin表達(dá)丟失，腫瘤凋亡增加。本研究中高表達(dá)miR-129-2組的裸鼠瘤體濕重、終體積和腫瘤相對(duì)體積均低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.05)，提示miR-129-2可抑制子宮內(nèi)膜的發(fā)生和發(fā)展。此外，本研究進(jìn)一步分析的miR-129-2對(duì)子宮內(nèi)膜癌的預(yù)測(cè)價(jià)值，結(jié)果顯示其對(duì)子宮內(nèi)膜癌具有較高的診斷價(jià)值，AUC為0.768，理論閾值點(diǎn)為0.002，對(duì)應(yīng)的敏感度和特異度分別為0.772，0.745。

綜上所述，miR-129-2在子宮內(nèi)膜癌組織和細(xì)胞系內(nèi)均存在明顯甲基化，因基因啟動(dòng)子區(qū)miR-129-2在子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)降低，miR-129-2可抑制子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞的增殖，促進(jìn)凋亡，其作用可能與靶向下調(diào)SOX4基因表達(dá)相關(guān)。