黃連提取物對五種致病菌腹腔感染小鼠血清ＴＮＦ－α和ＩＬ－６含量的影響

張如　楊正騰　馬家寶　崔健

摘要：考察黃連（Coptis chinensis Franch）提取物灌胃對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、普通變形桿菌和肺炎克雷伯氏菌5種常見細菌所致體內(nèi)急性腹腔感染小鼠血清TNF-α和IL-6含量的影響。結(jié)果表明，黃連提取物高、中、低劑量組對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、普通變形桿菌、肺炎克雷伯氏菌所致的腹腔感染小鼠有保護作用，可使小鼠血清中TNF-α和IL-6含量顯著減少;黃連提取物有一定抗菌作用，其機制與TNF-α和IL-6有關(guān)。

關(guān)鍵詞：黃連（Coptis chinensis Franch.）提取物;TNF-α;IL-6;體內(nèi)抗菌;小鼠

中圖分類號：R285.5? ? ? ? ?文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）03-0115-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.03.024? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Effect of Coptis chinensis extract on TNF-α and IL-6 contents

in serum of mice infected with five pathogens

ZHANG Ru1，YANG Zheng-teng2，MA Jia-bao2，CUI Jian2

（1.Guangxi Women and Children's Health Hospital，Nanning 530003，China;

2.The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530023，China）

Abstract： The effects of oral administration of Coptis chinensis extract on the contents of serum TNF-α and IL-6 in mice with acute abdominal infection induced by 5 common bacteria， Staphylococcus aureus， Escherichia coli， Pseudomonas aeruginosa， Proteus vulgaris， and Klebsiella pneumonia， were investigated. The results show that the high， medium and low dose groups of Coptis chinensis extract have protective effects on mice with abdominal infection caused by S. aureus， E. coli， P. aeruginosa， P. vulgaris， and K. pneumoniae， can significantly reduce the content of TNF-α and IL-6 in mouse serum. Coptis chinensis extract has a certain antibacterial effect， and its mechanism is related to TNF-α and IL-6.

Key words： Coptis chinensis extract; TNF-α; IL-6; antibacterial in vivo; mice

黃連為毛茛科植物黃連（Coptis chinensis Franch.）、三角葉黃連（Coptis deltoidea C. Y. Cheng etHsiao）或云連（Coptis teeta Wall.）的干燥根莖，抗菌作用廣泛，涉及45種細菌菌種[1]，有“中藥抗生素”的美稱，含有多種異喹啉類生物堿，小檗堿含量高[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃連抑菌有效成分主要是小檗堿、黃連堿和藥根堿[3]。

黃連提取物體外對金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌等細菌有不同程度的抑制作用[4]，其抗菌抗炎研究鮮見報道。本研究以金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、普通變形桿菌、肺炎克雷伯氏菌5種常見致病菌為對象，建立細菌性腹腔感染模型，觀察小鼠血清中TNF-α和IL-6的表達情況，探討黃連水提取物對小鼠體內(nèi)急性腹腔感染的影響，初步評價黃連水提物的抗菌活性及機制。

1? 材料與方法

1.1? 儀器設(shè)備

主要儀器設(shè)備有紫外分光光度計（島津制作，UV-1800型）、酶標(biāo)儀（Tecan公司，Infinite M200 Pro型）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海醫(yī)療機械七廠，PYX-DHS600-BS-II型）、滅菌器（Hirayama公司，HVE-110型）、多功能恒溫箱（北京福意聯(lián)醫(yī)療設(shè)備有限公司，F(xiàn)YL -YS-150L型）、多功能冷凍離心機（Effendorf公司，Centrifuge 5430R型）。

1.2? 細菌和試劑

試驗細菌為金黃色葡萄球菌[Staphylococcus aureus，CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌[Escherichia coli，CMCC（B）10104]、大腸埃希菌[Pseudomonas aeruginosa，CMCC（B）44102]、肺炎克雷伯氏菌[Proteus vulgaris，CMCC（B）46117]、普通變形桿菌[Klebsiella pneumonia，CMCC（B）49027]，均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

主要試劑有試胰蛋白胨大豆?fàn)I養(yǎng)肉湯（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任司，批號180507、CM301）、胰蛋白胨大豆?fàn)I養(yǎng)瓊脂（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，批號180112，CM168）、TNF-α（南京建成生物工程研究所，批號2019/06）、IL-6（南京建成生物工程研究所，批號2019/08），其他試驗試劑均為分析純。

1.3? 中藥材黃連

黃連（批號181106632，產(chǎn)地四川）購于廣州康美藥業(yè)股份有限公司，經(jīng)鑒定為毛茛科植物黃連（Coptis chinensis Franch.）的干燥根莖。

1.4? 黃連水提取物的制備

制黃連藥材粗粉，取1.5 kg加10倍量的水浸泡0.5 h，加熱煮沸1.5 h，紗布過濾，收集濾液，藥渣再加8倍量水煮沸1.0 h，合并2次的濾液，將濾液濃縮成2 g/mL（折算粗粉），放置備用。

1.5? 試驗處理

選取小鼠隨機分6組，分別為模型組，空白組，頭孢地尼組（陽性組），黃連水提取物高、中、低劑量組。每組12只，雌雄各半，作好標(biāo)記。

在動物感染前連續(xù)灌胃7 d，1次/d。頭孢地尼組灌喂頭孢地尼0.25 g/kg，黃連水提取物高、中、低劑量組分別灌胃黃連提取液40、20、10 g/kg，空白組和模型組灌胃生理鹽水0.02 mL/g。第七天灌胃后0.5 h進行細菌懸液腹腔注射，0.5 mL/只，引發(fā)細菌急性感染，空白組腹腔注射等量生理鹽水。腹腔注射6 h后進行相應(yīng)灌胃1次，24 h后再灌胃1次，觀察3 d，記錄感染前后小鼠體重變化。

1.6? 檢測指標(biāo)

感染后第五天摘取眼球取血，4 ℃低溫離心機3 000 r/min離心10 min，取上層血清置于-80 ℃冰箱保存。采用ELISA法檢測血清中的TNF-α、IL-6濃度。嚴格按照試劑盒說明操作。

1.7? 數(shù)據(jù)處理方法

用SPSS 21.0軟件分析數(shù)據(jù)，t檢驗。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 感染細菌后的體征變化

腹腔注射細菌后6 h小鼠出現(xiàn)精神萎靡，眼睛濕潤，似流淚狀，眼睛恍惚，無精神，嗜睡不好動，無食欲，食量明顯減少，毛發(fā)凌亂，呼吸頻率加快，大便稀釋，毛發(fā)易脫落（除空白組外），解剖死亡鼠出現(xiàn)腹腔膜異常，多為淡棕黃色或白點狀，大腸病變積水壞死，腹腔積有腹水，肝異常，出現(xiàn)紅塊狀。腹腔注射細菌24 h后病鼠情況開始好轉(zhuǎn)，48 h后恢復(fù)正常。用藥后，感染小鼠的體重回升。

2.2? 金黃色葡萄球菌急性感染小鼠血清中的TNF-α、IL-6情況

金黃色葡萄球菌急性感染小鼠血清中TNF-α、IL-6測定結(jié)果見表1。差異顯著性分析表明，與模型組相比較，空白組、陽性組、黃連低劑量組、黃連中劑量組、黃連高劑量組的TNF-α、IL-6含量顯著下降。

2.3? 大腸埃希菌急性感染小鼠血清中的TNF-α、IL-6情況

大腸埃希菌急性感染小鼠血清中TNF-α、IL-6測定結(jié)果見表2。差異顯著性分析表明，與模型組相比較，空白組、陽性組、黃連低劑量組、黃連中劑量組、黃連高劑量組的TNF-α、IL-6含量顯著下降。

2.4? 銅綠假單胞菌急性感染小鼠血清中的TNF-α、IL-6情況

抗銅綠假單胞菌急性感染小鼠血清中TNF-α、IL-6測定結(jié)果見表3。差異顯著性分析表明，與模型組相比較，空白組、黃連低劑量組、黃連中劑量組、黃連高劑量組的TNF-α含量顯著下降，空白組、陽性組、黃連低劑量組、黃連中劑量組、黃連高劑量組的IL-6含量顯著下降;與陽性組相比較，黃連高劑量組的TNF-α和IL-6含量顯著下降;與低劑量組相比較，黃連高劑量組的TNF-α和IL-6含量較低;與中劑量組相比較，黃連高劑量組的TNF-α含量較低。

2.5? 普通變形桿菌急性感染小鼠血清中的TNF-α、IL-6情況

普通變形桿菌急性感染小鼠血清中TNF-α、IL-6測定結(jié)果見表4。差異顯著性分析表明，與模型組相比較，空白組、頭孢地尼組以及黃連水提取物低劑量組、中劑量組、高劑量組的TNF-α、IL-6含量顯著降低;與頭孢地尼組相比較，黃連水提取物高劑量組的TNF-α、IL-6含量顯著降低。

2.6? 肺炎克雷伯氏菌急性感染小鼠血清中的TNF-α、IL-6情況

抗肺炎克雷伯氏菌急性感染小鼠血清中TNF-α、IL-6測定結(jié)果見表5。差異顯著性分析表明，與模型組相比較，空白組、頭孢地尼組以及黃連水提取物低劑量組、中劑量組、高劑量組的TNF-α、IL-6含量顯著降低。

3? 小結(jié)與討論

金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、普通變形桿菌、肺炎克雷伯氏菌是常見的致病菌，可導(dǎo)致人類感染嚴重疾病，如肺炎[5，6]、中毒性休克[7]、菌血癥、心膜炎、乳腺炎等。隨著抗菌藥的廣泛應(yīng)用，這些細菌的耐藥性日趨嚴重[8，9]。

尋找有效抗菌藥物極其重要。中藥含多種化學(xué)成分，具有多靶點、多途徑特點，與抗菌藥聯(lián)用可能具有良好協(xié)同作用[10，11]。細菌感染是致病菌侵入人體生長繁殖，產(chǎn)生毒素和其他代謝產(chǎn)物所引起的炎癥反應(yīng)[12]。IL-6、TNF-α是細胞因子中比較重要的指標(biāo)，在細菌感染診斷中具有重要價值[13]，也是重要的炎癥介質(zhì)[14]。多數(shù)正常人血中 IL-6、TNF-α水平極低，當(dāng)細菌感染時，血液中TNF-α的濃度水平迅速升高[15，16]，臨床上常用IL-6、TNF-α作為細菌感染的重要指標(biāo)[17，18]。

在金黃色葡萄球菌、腸埃希菌、抗銅綠假單胞菌、普通變形桿菌、肺炎克雷伯氏菌感染試驗中，與模型組相比，黃連低、中、高劑量組的TNF-α、IL-6含量顯著下降，用藥后，感染小鼠的體重回升，說明黃連水提取物高、中、低劑量對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、普通變形桿菌和肺炎克雷伯氏菌引起的體內(nèi)急性腹腔感染有一定的保護作用。

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收稿日期：2019-10-20

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（81360524）;廣西高校中青年教師科研基礎(chǔ)能力提升項目（2019KY0341）

作者簡介：張? 如（1984-），女，廣東揭西人，主管中藥師，主要從事中藥飲片，中成藥處方調(diào)及中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究工作，（電話）13737078865 （電子信箱）284978283@qq.com;通信作者，崔? ?。?988-），女，主管藥師，碩士，主要從事藥劑學(xué)研究工作，（電子信箱）18776728630@qq.com。