基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)的養(yǎng)殖密度影響斑節(jié)對(duì)蝦品質(zhì)的分子機(jī)制

李玲 周偉 李璐 王洋 孫學(xué)亮 梁麗雅 馬儷珍

摘 要：采用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）

技術(shù)，在分子水平揭示養(yǎng)殖密度對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦肌肉品質(zhì)形成的影響機(jī)制。選取養(yǎng)殖密度100 尾/m2、300 尾/m2的斑節(jié)對(duì)蝦為實(shí)驗(yàn)材料，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和qRT-PCR驗(yàn)證。結(jié)果表明：所有樣本Q20和Q30的最小值均大于90%，測(cè)序數(shù)據(jù)均滿足生物信息學(xué)分析的要求;不同密度養(yǎng)殖條件下，斑節(jié)對(duì)蝦的差異表達(dá)基因?yàn)?78 個(gè);將差異基因序列與7 個(gè)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，得到不同密度養(yǎng)殖的斑節(jié)對(duì)蝦中與肌肉品質(zhì)相關(guān)的差異基因分布在膠原蛋白代謝、蛋白水解、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞蛋白代謝、細(xì)胞骨架組織、肌肉連接及葡萄糖代謝途徑;qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致。

關(guān)鍵詞：斑節(jié)對(duì)蝦;養(yǎng)殖密度;肌肉品質(zhì);轉(zhuǎn)錄組;分子機(jī)制

Transcriptomic Analysis of the Molecular Mechanism of the Effect of Stocking Density on the Quality of Penaeus monodon

LI Ling1， ZHOU Wei1， LI Lu1， WANG Yang2， SUN Xueliang2， LIANG Liya1， MA Lizhen1，*

（1.College of Food Science and Biological Engineering， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384， China;

2.College of Aquaculture， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384， China）

Abstract： The molecular mechanism of the effect of stocking density on the muscle quality of Penaeus monodon was elucidated by high-throughput transcriptome sequencing and quantitative real time polymerase chain reaction （qRT-PCR）. Two stocking densities of 100 and 300 tails/m2 were selected in this study. Among the 6 samples， the minimum values of Q20 and Q30 were more than 90%， and all sequencing data met the requirements of biological information analysis. A total of 778 differentially expressed genes were found between the stocking densities， and their sequences were aligned against seven databases. The differentially expressed genes related to shrimp muscle quality were mainly involved in collagen metabolism， proteolysis， protein transport， cell protein metabolism， cytoskeletal tissues， muscle connectivity， and glucose metabolism. The qRT-PCR results were consistent with transcriptome sequencing.

Keywords： Penaeus monodon; stocking density; muscle quality; transcriptome; molecular mechanism

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200924-233

中圖分類號(hào)：TS254.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2020）12-0001-06

引文格式：

李玲， 周偉， 李璐， 等. 基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)的養(yǎng)殖密度影響斑節(jié)對(duì)蝦品質(zhì)的分子機(jī)制[J]. 肉類研究， 2020， 34（12）： 1-6. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200924-233.? ? http：//www.rlyj.net.cn

LI Ling， ZHOU Wei， LI Lu， et al. Transcriptomic analysis of the molecular mechanism of the effect of stocking density on the quality of Penaeus monodon[J]. Meat Research， 2020， 34（12）： 1-6. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200924-233.

http：//www.rlyj.net.cn

斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）俗稱虎蝦，與中華對(duì)蝦和南美白對(duì)蝦并稱為世界三大水產(chǎn)養(yǎng)殖蝦[1]。斑節(jié)對(duì)蝦具有生長(zhǎng)快、抗病力和對(duì)環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、養(yǎng)殖成本低、肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富等特點(diǎn)，深受養(yǎng)殖戶和消費(fèi)者喜愛，是東南亞和我國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)物種[2]。在工廠化養(yǎng)殖過程中，密度會(huì)影響水生動(dòng)物的生存和生長(zhǎng)、福利和健康、生理代謝等。提高養(yǎng)殖密度有利于增加產(chǎn)量并降低生產(chǎn)成本，但是當(dāng)養(yǎng)殖密度過高時(shí)，水生動(dòng)物又會(huì)產(chǎn)生應(yīng)激生理反應(yīng)和種內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)，其生長(zhǎng)、生存和生理代謝會(huì)受到影響。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖工業(yè)化的快速發(fā)展，一些養(yǎng)殖者盲目提高養(yǎng)殖密度以追求高產(chǎn)量，結(jié)果會(huì)加劇種內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)、疾病惡化和水環(huán)境污染。因此，養(yǎng)殖密度是影響水產(chǎn)品質(zhì)量的重要因素之一，研究養(yǎng)殖密度對(duì)水產(chǎn)品肌肉品質(zhì)的影響具有重要意義。

養(yǎng)殖密度對(duì)水產(chǎn)品肉質(zhì)和風(fēng)味影響的報(bào)道較少，主要集中在對(duì)大菱鲆、鯧鲹魚、克氏原螯蝦、羅氏沼蝦等生理指標(biāo)方面的研究。目前利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)研究肉品質(zhì)的形成主要集中在金茅黑雞胸肌的品質(zhì)性狀[3]、南方黃牛肌肉嫩度相關(guān)信號(hào)通路及其關(guān)鍵基因[4]等方面，鮮見關(guān)于水產(chǎn)動(dòng)物肉品質(zhì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方面的研究。在分子層面上，決定肉質(zhì)性狀的大多數(shù)肌內(nèi)脂肪和肌纖維受基因調(diào)控[5]，具有穩(wěn)定的高度遺傳性[6]，已經(jīng)確定影響肉品質(zhì)的主要基因?yàn)镠alothane（Hal）和Rendement Napole（RN）基因[7]。目前通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)研究肉品質(zhì)形成的分子機(jī)制已有一些研究。張鳳[8]通過Illumina Solexa測(cè)序技術(shù)獲得與豬脂肪發(fā)育相關(guān)的基因是WISP2和KLF6。邢凱等[9]用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選到長(zhǎng)白豬、松遼黑豬中調(diào)控脂肪沉積的多個(gè)重要基因和通路。

Li Guoxi等[10]采用miRNA-seq研究不同日齡榮昌豬背部皮下脂肪中的差異miRNA。彭興[11]構(gòu)建不同發(fā)育時(shí)間點(diǎn)的豬骨骼肌miRNA文庫，并結(jié)合Solexa高通量測(cè)序初步確定影響肌肉增殖分化、參與骨骼肌生長(zhǎng)調(diào)控的miRNA及其靶基因。Hou Xinhua等[12]在通城豬背最長(zhǎng)肌混合RNA文庫中檢測(cè)出275 個(gè)miRNAs，確定miR-378與骨形成蛋白2和絲裂原活化蛋白激酶1有關(guān)。朱嘉宇[13]以豬不同類型肌肉組織為樣本，采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)研究肌肉發(fā)育和肌纖維類型的關(guān)系。湖羊的肌肉生長(zhǎng)發(fā)育及肉質(zhì)形成與MYL3、ACTG2基因及ACTG2基因5端非翻譯區(qū)（長(zhǎng)度83 bp）的剪接形式有關(guān)[14]。

目前應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)揭示水生動(dòng)物肉品質(zhì)形成的研究還很少。通過分析比較不同密度養(yǎng)殖的斑節(jié)對(duì)蝦的一系列品質(zhì)和風(fēng)味指標(biāo)，本團(tuán)隊(duì)已經(jīng)確定隨著養(yǎng)殖密度的增大，蝦肌肉水分和灰分含量升高，粗蛋白和總糖含量降低，持水力極顯著降低，感官和質(zhì)構(gòu)品質(zhì)降低[15]。

100 尾/m2密度養(yǎng)殖的斑節(jié)對(duì)蝦品質(zhì)和風(fēng)味更好[16]，但是具體機(jī)制尚不清楚。所以，本研究采用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）技術(shù)，在分子水平上揭示養(yǎng)殖密度對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦肌肉品質(zhì)的影響機(jī)理，以期為養(yǎng)殖戶選擇適宜的養(yǎng)殖密度、提高斑節(jié)對(duì)蝦的肌肉品質(zhì)、優(yōu)化養(yǎng)殖模式、降低養(yǎng)殖成本等方面提供數(shù)據(jù)支持和理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘南海1號(hào)斑節(jié)對(duì)蝦苗，長(zhǎng)度2 cm，購自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，在天津橫潛水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司進(jìn)行養(yǎng)殖。養(yǎng)殖密度為100 尾/m2（M1）和300 尾/m2（M3）。高位池養(yǎng)殖模式，養(yǎng)殖條件為溶解氧5 mg/L以上，透明度30～40 cm，水溫26～28 ℃，餌料人工喂養(yǎng)，每天投喂4～5 次，養(yǎng)殖周期84 d。整個(gè)養(yǎng)殖過程中蝦生長(zhǎng)、發(fā)育情況良好。每個(gè)養(yǎng)殖條件同時(shí)做3 次重復(fù)，蝦長(zhǎng)成后取樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

Green Real-time PCR Master Mix 日本Toyobo公司。

1.2 儀器與設(shè)備

NanoDrop微量紫外-可見分光光度計(jì) 美國Thermo Fisher科技公司;Qubit熒光定量?jī)x 美國ABI公司;Agilent 2100生物分析儀 美國安捷倫公司;CFX96 qRT-PCR儀 美國伯樂公司。

1.3 方法

1.3.1 RNA提取和高通量測(cè)序

用Trizol法提取斑節(jié)對(duì)蝦肌肉總RNA。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA是否發(fā)生降解和被污染。用微量紫外-可見分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的純度（OD260 nm/OD280 nm）。利用熒光定量?jī)x和生物分析儀分別對(duì)RNA濃度和完整性進(jìn)行精確定量，確保用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的RNA質(zhì)量。然后由諾禾致源基因研究中心完成測(cè)序文庫構(gòu)建和高通量測(cè)序（Illumina HiSeqTM）。數(shù)據(jù)處理和分析參考鄺良德[17]、Bemer[18]等的方法。依據(jù)測(cè)序結(jié)果中的基因功能（gene ontology，GO）注釋，并結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫分析差異顯著基因參與的代謝通路。

1.3.2 不同樣本中差異基因相對(duì)表達(dá)量分析

參照Brown等[19]的方法，通過qRT-PCR技術(shù)，分析轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中差異倍數(shù)較大的部分基因的相對(duì)表達(dá)量，所用引物如表1所示。

qRT-PCR擴(kuò)增體系：20 ng cDNA樣品中加入2.5 μL SYBR? Green Real-time PCR Master Mix、400 nmol/L特異性引物，用雙蒸水將體系體積補(bǔ)至25 μL。待測(cè)體系置于CFX96 qRT-PCR儀中，設(shè)定擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性1 min;95℃、15 s，60℃、15 s，72℃、45 s，以此條件擴(kuò)增40 個(gè)循環(huán);結(jié)束后在95～60 ℃（16 s）條件下繪制溶解曲線。以actin為內(nèi)參基因，以2-ΔΔCt計(jì)算待測(cè)基因相對(duì)表達(dá)量，ΔΔCt按下式計(jì)算。

ΔΔCt=（CtTarget-Ctactin）M3-（CtTarget-Ctactin）M1

式中：CtTarget為待測(cè)基因循環(huán)閾（cycle threshold，Ct）

值;Ctactin為內(nèi)參基因Ct值;M1代表100 尾/m2密度養(yǎng)殖的樣品;M3代表300 尾/m2密度養(yǎng)殖的樣品。

1.4 數(shù)據(jù)處理

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)用CASAVA Base Calling軟件、RSEM軟件分析，并與Nr（NCBI Non-Redundant Protein Sequences）、Nt（NCBI Nucleotide Sequences）、Pfam（Protein Family）、KOG（Eukaryotic Ortholog Groups）、Swiss-Prot（A Manually Annotated and Reviewed Protein Sequence Database）、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）、GO 7 個(gè)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)。最終的數(shù)據(jù)通過Origin 95軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 斑節(jié)對(duì)蝦轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估

將原始序列（Raw Reads）作為原始數(shù)據(jù)文件，通過CASAVA Base Calling軟件進(jìn)行分析。因?yàn)樵夹蛄邪宇^和低質(zhì)量的序列，為了確保測(cè)序結(jié)果分析的準(zhǔn)確性，必須對(duì)原始序列進(jìn)行過濾，獲得Clean Reads。隨后的生物信息學(xué)分析都基于Clean Reads。測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量如表2所示。

下同。

由表2可知，在6 組樣品中，Q20的最小值為96.33%，Q30的最小值為90.57%，Q20和Q30均超過90%，表明所有測(cè)序數(shù)據(jù)均符合生物信息學(xué)分析的要求。

2.2 斑節(jié)對(duì)蝦轉(zhuǎn)錄組測(cè)序Reads與參考序列的比對(duì)

通過Trinity拼接獲得用于轉(zhuǎn)錄組分析的參考序列（ref），并將每個(gè)樣品的Clean Reads與參考序列進(jìn)行比對(duì)。比對(duì)時(shí)采用RSEM軟件，Bowtie2設(shè)置為默認(rèn)參數(shù)mismatches 0。

由表3可知，Clean Reads與參考序列匹配率為61.10%～66.86%，說明測(cè)序結(jié)果對(duì)于無參轉(zhuǎn)錄組的分析是可靠的。

2.3 差異基因的篩選

以不同密度養(yǎng)殖的斑節(jié)對(duì)蝦中基因Reads數(shù)之比為差異倍數(shù)，繪制火山圖，可以直觀顯示Pval和log2（差異倍數(shù)）

之間的關(guān)系，縱坐標(biāo)為差異顯著性，-lg（Pval）越大，差異越顯著;P<0.05和|log2（差異倍數(shù)）|>1即為差異表達(dá)的基因。

Pval. 校正后的P值。

由圖1可知，不同密度養(yǎng)殖的斑節(jié)對(duì)蝦有778 個(gè)差異表達(dá)基因，其中365 個(gè)是上調(diào)基因，413 個(gè)是下調(diào)基因。

2.4 不同密度養(yǎng)殖的斑節(jié)對(duì)蝦肌肉中與品質(zhì)相關(guān)的差異基因

不同密度養(yǎng)殖的斑節(jié)對(duì)蝦的差異基因涉及蛋白質(zhì)代謝、肌肉發(fā)育和生長(zhǎng)、碳水化合物代謝途徑。由圖2可知，100 尾/m2和300 尾/m2密度養(yǎng)殖的斑節(jié)對(duì)蝦肌肉中存在4 個(gè)與膠原蛋白相關(guān)的差異基因，包括2 個(gè)上調(diào)基因和2 個(gè)下調(diào)基因。與蛋白水解作用相關(guān)的差異表達(dá)基因有3 個(gè)，包括2 個(gè)上調(diào)基因和1 個(gè)下調(diào)基因。6 個(gè)上調(diào)基因參與蛋白質(zhì)運(yùn)輸。6 個(gè)上調(diào)基因與細(xì)胞蛋白質(zhì)代謝調(diào)節(jié)相關(guān)。與細(xì)胞骨架組織有關(guān)的基因有12 個(gè)，包括2 個(gè)下調(diào)基因和10 個(gè)上調(diào)基因。2 個(gè)上調(diào)基因與骨骼系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)。2 個(gè)下調(diào)基因與肌肉連通性相關(guān)。與糖酵解或糖異生有關(guān)的上調(diào)基因是細(xì)胞色素氧化酶C亞基Ⅷ、丙酮酸脫氫酶（乙酰轉(zhuǎn)移蛋白）激酶、丙酮酸脫氫酶激酶2/3/4、保守的假設(shè)蛋白和假設(shè)蛋白CAPTEDRAFT_177854基因，下調(diào)基因是ADP特異的磷酸果糖激酶、細(xì)胞色素C氧化酶集合因子2和細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅱ基因。

2.5 與肌肉品質(zhì)相關(guān)的差異基因的相對(duì)表達(dá)量

選擇轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中具有顯著性差異和代表性的基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。以M1組基因的表達(dá)水平為基準(zhǔn)，確定M3組相應(yīng)基因的相對(duì)表達(dá)量。由表4可知，相比于100 尾/m2密度養(yǎng)殖，在300 尾/m2密度養(yǎng)殖的斑節(jié)對(duì)蝦中，神經(jīng)絲重多肽、細(xì)胞色素P450 4C1、細(xì)胞色素氧化酶C亞基Ⅷ、丙酮酸脫氫酶（乙酰轉(zhuǎn)移）激酶、泛素結(jié)合酶E2O、網(wǎng)格蛋白適配復(fù)合物、突觸融合蛋白-8、微管蛋白復(fù)合物和ADP-核糖基化因子家族的相對(duì)表達(dá)量下調(diào)，其中細(xì)胞色素氧化酶C亞基Ⅷ、泛素結(jié)合酶E2O和ADP-核糖基化因子家族的相對(duì)表達(dá)量分別為0.049 3、0.048 2和0.080 9。這些基因的下調(diào)表達(dá)導(dǎo)致斑節(jié)對(duì)蝦蛋白代謝、糖代謝、蛋白質(zhì)的泛素化修飾等途徑受到顯著抑制，對(duì)肉品質(zhì)造成負(fù)面影響。其余基因在300 尾/m2密度養(yǎng)殖的斑節(jié)對(duì)蝦中表達(dá)上調(diào)，緊密連接蛋白ZO-1在M3組的表達(dá)量是M1組的13.973 1 倍，細(xì)胞色素C氧化酶集合因子2基因在M3組的相對(duì)表達(dá)量為9.049 3。

3 討 論

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果揭示不同密度養(yǎng)殖的斑節(jié)對(duì)蝦的差異基因位于蛋白質(zhì)代謝、肌肉發(fā)育和生長(zhǎng)、碳水化合物代謝途徑。qRT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果。神經(jīng)絲重多肽是軸突的主要結(jié)構(gòu)蛋白，是成熟髓鞘結(jié)構(gòu)形成的重要標(biāo)志之一[20]。Wang等[21]證實(shí)，神經(jīng)絲重多肽是一種中間纖維成分，保護(hù)足狀突細(xì)胞免受損傷。細(xì)胞色素C氧化酶位于線粒體呼吸鏈末端，參與電子傳遞，并將質(zhì)子從線粒體膜內(nèi)側(cè)泵到線粒體膜外側(cè)[22]。丙酮酸脫氫酶系在糖代謝調(diào)控中起重要作用，催化丙酮酸不可逆氧化脫羧生成乙酰輔酶A，并將糖酵解途徑與檸檬酸循環(huán)連通[23-24]。丙酮酸脫氫酶激酶可以通過磷酸化調(diào)節(jié)丙酮酸脫氫酶系的活性[25]。泛素化是真核生物中一種常見的蛋白質(zhì)降解途徑，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、DNA修復(fù)、逆境脅迫和蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)定位等生物學(xué)過程[26]。泛素結(jié)合酶是泛素/蛋白酶體途徑的重要組成部分，在蛋白質(zhì)泛素化中有重要作用。網(wǎng)格蛋白適配器復(fù)合體在協(xié)調(diào)網(wǎng)格蛋白涂層的組裝中發(fā)揮了重要作用[27]。Renigunta等[28]研究發(fā)現(xiàn)，通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，以協(xié)同方式將未組裝的突觸融合蛋白-8和鉀通道內(nèi)化。ADP核糖基化因子在所有真核細(xì)胞中均有表達(dá)，并涉及囊泡運(yùn)輸、脂質(zhì)代謝、微管動(dòng)力學(xué)和細(xì)胞過程等方面[29]。300 尾/m2高密度養(yǎng)殖導(dǎo)致斑節(jié)對(duì)蝦額外的能量代謝增強(qiáng)，與倪嘉豪等[30]對(duì)銀鯧幼魚的研究一致，降低了斑節(jié)對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能，導(dǎo)致肉品質(zhì)遠(yuǎn)低于100 尾/m2低密度養(yǎng)殖組。