分散固相萃取結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)品中11 種四環(huán)素類藥物

黃鸞玉 吳祥慶 陳秀荔 趙永貞 龐燕飛

摘 要：采用分散固相萃取結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，建立水產(chǎn)品中11 種四環(huán)素類藥物殘留的分析方法。樣品經(jīng)Na2EDTA-McIIvaine緩沖溶液分散后，以體積分?jǐn)?shù)1%乙酸乙腈提取，提取液經(jīng)鹽析及脫水后取乙腈層，用C18凈化。目標(biāo)物用C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，3 ?m）分離，以甲醇和體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，利用電噴霧離子源多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明：11 種化合物在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.998;大多數(shù)化合物在定量限添加水平下的響應(yīng)良好，在2 倍和5 倍定量限添加水平下平均回收率普遍大于80%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2%～10.3%（n=6）;檢出限（RS/N=3）和定量限（RS/N=10）分別為2.9～6.1 ?g/kg和10～20 ?g/kg。該方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏，適用于水產(chǎn)品中11 種四環(huán)素殘留物的定性、定量分析。

關(guān)鍵詞：水產(chǎn)品;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;分散固相萃取;四環(huán)素類;獸藥殘留

Determination of 11 Tetracycline Residues in Aquatic Products Using Dispersive Solid Phase Extraction-High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

HUANG Luanyu， WU Xiangqing， CHEN Xiuli， ZHAO Yongzhen， PANG Yanfei

（Guangxi Academy of Fishery Sciences， Nanning 530021， China）

Abstract： An analytical method using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry coupled with a dispersive solid phase extraction （DSPE）procedure for sample preparation was developed to determine 11 tetracycline residues in aquatic products. The samples were dispersed in Na2EDTA-McIIvaine buffer solution and extracted with acetonitrile containing 1% （V/V） acetic acid. After that， the extract was salted out and dehydrated by adding anhydrous sodium sulfate， and the acetonitrile phase was harvested and purified using a C18 sorbent. The analytes were separated on a C18 column （100 mm × 2.1 mm， 3 ?m） with gradient elution using a mobile phase containing methanol and 0.1% （V/V） formic acid aqueous solution. Mass spectrometry was performed using an electrospray ionization source in the multiple reaction monitoring （MRM） mode. The correlation coefficients of the standard calibration curves for the 11 tetracyclines were all above 0.998. Most of the compounds showed good response at the limit of quantitation （LOQ） level. The average recoveries of most compounds were more than 80% at spiked concentrations two- and five-fold higher than the LOQ， with relative standard deviations of 3.2%–10.3% （n = 6）. The limits of detection （LODs， RS/N = 3） and LOQs （RS/N = 10） were

2.9–6.1 and 10–20 ?g/kg， respectively. The method is simple， rapid， sensitive， and suitable for the simultaneous determination of the 11 tetracycline residues in aquatic products.

Keywords： aquatic products; liquid chromatography tandem mass spectrometry; dispersive solid phase extraction; tetracyclines; veterinary drug residues

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20201123-274

中圖分類號(hào)：O657.7? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2020）12-0061-07

引文格式：

黃鸞玉， 吳祥慶， 陳秀荔， 等. 分散固相萃取結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)品中11 種四環(huán)素類藥物[J]. 肉類研究， 2020， 34（12）： 61-67. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20201123-274.? ? http：//www.rlyj.net.cn

HUANG Luanyu， WU Xiangqing， CHEN Xiuli， et al. Determination of 11 tetracycline residues in aquatic products using dispersive solid phase extraction-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Meat Research， 2020， 34（12）： 61-67. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20201123-274.? ? http：//www.rlyj.net.cn

四環(huán)素類（tetracyclines，TCs）藥物是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中常用的獸藥和飼料添加劑，起到預(yù)防和治療各類細(xì)菌性疾病的作用。綜合分析中國(guó)和歐美等主要水產(chǎn)品生產(chǎn)國(guó)的用藥情況可知，由于在養(yǎng)殖過(guò)程中長(zhǎng)期大量使用，不遵守休藥期，容易導(dǎo)致該類藥物在機(jī)體中殘留，危害人類身體健康，另一方面極易導(dǎo)致耐藥菌株逐年增加，不僅降低藥物療效，也限制了其他抗生素的使用[1-2]。因此，國(guó)內(nèi)外對(duì)TCs藥物的使用采取了嚴(yán)格的監(jiān)控，中國(guó)和歐美等多個(gè)國(guó)家已相繼制定肉制品中TCs藥物的最大殘留限量（maximum residue limit，MRL）為100 ?g/kg，國(guó)際食品法典委員會(huì)和日本規(guī)定MRL為200 ?g/kg[3]。受監(jiān)控的藥物多以土霉素（oxytetracycline，OTC）、四環(huán)素（tetracycline，TC）、金霉素（chlortetracycline，CTC）和多西環(huán)素（doxycycline，DC）為主，在實(shí)際應(yīng)用中，為避免耐藥性、提高療效和逃避監(jiān)管，使用地美環(huán)素（demeclocycline，DMC）、美他環(huán)素（methacycline，MTC）、米諾環(huán)素（minocycline，MNC）和甲氯環(huán)素（meclocycline，MCC）等新型TCs藥物替代被限量監(jiān)管的藥物用于水產(chǎn)、畜牧生產(chǎn)的潛在風(fēng)險(xiǎn)不斷加大。此外，TCs藥物不穩(wěn)定，容易轉(zhuǎn)變?yōu)樗幮O低、毒性更強(qiáng)的差向異構(gòu)體[4-5]。因此，對(duì)新型TCs藥物及代謝物

4-差向土霉素（4-epi oxytetracycline，EOTC）、4-差向四環(huán)素（4-epi tetracycline，ETC）和4-差向金霉素（4-epi chlortetracycline，ECTC）進(jìn)行檢測(cè)非常必要。

目前，TCs藥物殘留量的檢測(cè)方法主要有薄層色譜法[6-8]、酶聯(lián)免疫法[9-11]、微生物法[12-14]、電化學(xué)分析

法[15-16]、液相色譜法[17-19]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[20-22]等。薄層色譜法和酶聯(lián)免疫法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單、快捷和不需要復(fù)雜儀器等，缺點(diǎn)是分辨率和靈敏度均不高，易出現(xiàn)假陽(yáng)性，不可作為殘留確證方法;微生物法耗時(shí)較長(zhǎng)，易受其他抗生素干擾，專一性和精確度不高;液相色譜法是目前研究TCs藥物殘留最常用的檢測(cè)方法[23-25]，具有分析速度快和適用范圍廣等特點(diǎn)[26-28]，但前處理比較復(fù)雜，分析時(shí)間長(zhǎng)，易造成待檢藥物損失，上機(jī)分析易受基質(zhì)干擾的影響[29-30]。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法能有效減少基質(zhì)干擾，靈敏度更高，結(jié)果精確可靠[31]，是TCs藥物殘留檢測(cè)的首選方法。但到目前為止，同時(shí)檢測(cè)水產(chǎn)品中新型TCs藥物、常規(guī)TCs藥物及其代謝物的相關(guān)報(bào)道還很少。

本研究選擇水產(chǎn)品肌肉組織為分析對(duì)象，通過(guò)優(yōu)化色譜流動(dòng)相組成和洗脫程序，得到較好的色譜峰型;通過(guò)優(yōu)化提取和凈化條件，提高方法的適用性、回收率和檢測(cè)效率;建立靈敏度高、專屬性強(qiáng)的同時(shí)檢測(cè)TCs藥物及其代謝物的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水產(chǎn)品樣品由養(yǎng)殖場(chǎng)抽取，樣品數(shù)分別為對(duì)蝦10 個(gè)、大黃魚(yú)12 個(gè)、鯉魚(yú)10 個(gè)、鱸魚(yú)12 個(gè)、大菱鲆10 個(gè)、烏鱧10 個(gè)、梭子蟹10 個(gè)、扇貝10 個(gè);空白水產(chǎn)品樣品（質(zhì)控樣品）為未檢出目標(biāo)化合物的鯉魚(yú)樣品。

OTC（純度97%）、TC（純度95%）、CTC（純度96%）、DC（純度98%）、DMC（純度92.8%）和MTC（純度97.9%） 德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司;EOTC（純度95%）、ETC（純度93.8%）、ECTC（純度>90%）、MNC（純度97%）和MCC（純度97%） 加拿大TRC公司。

十八烷基硅烷（octadecyl silane，C18）、N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）、氨基吸附劑（amino adsorbent，NH2）、石墨化炭黑（graphitized carbon black，GCB） 美國(guó)Agilent公司;甲醇、乙腈（均為色譜純） 美國(guó)Tedia公司;NH4OAc（色譜純）、Na2EDTA·2H2O、NaCl、NaOAc、MgSO4、Na2SO4、Na2HPO4·12H2O、C6H8O7·H2O（均為分析純） 上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ Fortis三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（配UltiMate 3000液相色譜系統(tǒng)） 美國(guó)Thermo公司;ZWF-334往復(fù)式振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司;TDZ5-WS多管架自動(dòng)平衡離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司;EOFO-945066數(shù)顯型多管式漩渦混合器 美國(guó)Talboys公司;Syncore Polyvap平行蒸發(fā)儀 瑞士Buchi公司;H35循環(huán)水冷卻器 萊伯泰科有限公司;Synergy UV超純水系統(tǒng)、XS205DU電子天平 美國(guó)Mettler公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

分別稱取各標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度為100 ?g/mL的單標(biāo)儲(chǔ)備液，置于棕色螺口樣品瓶中，于-18 ℃冰箱中保存。分別取各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液400 ?L于同一容量瓶中，用甲醇定容至20 mL，配制成各化合物質(zhì)量濃度為2 000 ?g/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，臨用時(shí)分別移取適量工作溶液，用0.1%甲酸水溶液-甲醇（8∶2，V/V）配制成各化合物質(zhì)量濃度分別為2、5、10、25、50、100、200、400、800、1 200 ?g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

0.1 mol/L Na2EDTA-McIIvaine緩沖溶液：準(zhǔn)確稱取37.23 g Na2EDTA·2H2O、12.93 g C6H8O7·H2O和10.92 g Na2HPO4·12H2O溶解于0.9 L超純水，用HCl調(diào)節(jié)pH值至4.0，轉(zhuǎn)移至容量瓶，用超純水定容至1 L，混合均勻。

1.3.2 樣品處理

稱取（5.00±0.05） g均質(zhì)后的樣品于50 mL離心管中，加入2 mL 0.1 mol/L Na2EDTA-McIIvaine緩沖溶液，勻漿30 s，用15 mL體積分?jǐn)?shù)1%乙酸-乙腈清洗刀頭，洗液并入樣品離心管中，加入0.5 g NaCl，渦旋振蕩1 min，再加入10 g無(wú)水Na2SO4（用前于650 ℃烘烤4 h），混勻，振蕩提取10 min，4 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一干凈離心管中，向上清液中加入200 mg C18，振蕩凈化5 min，4 000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至平行蒸發(fā)管中，45 ℃平行蒸發(fā)至干。用2 mL 0.1%甲酸水溶液-甲醇（8∶2，V/V）充分溶解殘?jiān)^(guò)0.22 ?m微孔濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.3.3 色譜條件

Thermo Hypersil GOLD C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，3 ?m）;柱溫35 ℃;樣品室溫度21 ℃，進(jìn)樣量10 ?L;流速0.3 mL/min;流動(dòng)相A為水（含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸），流動(dòng)相B為甲醇;梯度洗脫程序：0～2 min，90%流動(dòng)相A;2～3 min，90%～78%流動(dòng)相A;3～10 min，78%流動(dòng)相A;10～11 min，78%～60%流動(dòng)相A;11～13 min，60%～30%流動(dòng)相A;13～15 min，30%流動(dòng)相A;15～15.1 min，30%～5%流動(dòng)相A;15.1～16 min，5%流動(dòng)相A;16～16.1 min，5%～90%流動(dòng)相A;16.1～18 min，90%流動(dòng)相A。

1.3.4 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧電離源（electrospray ionization，ESI），正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描;噴霧電壓3 500 V;離子傳輸管溫度350 ℃;蒸發(fā)溫度300 ℃;碰撞氣壓力1.5 mTorr（0.2 Pa）;鞘氣流速35 L/h;輔助氣流速10 L/h。11 種TCs獸藥的其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

1.3.5 結(jié)果計(jì)算

樣品中TCs藥物的含量按下式計(jì)算。

式中：X為樣品中TCs藥物含量/（?g/kg）;ρ為樣品溶液中TCs藥物質(zhì)量濃度/（?g/mL）;V為樣品溶液體積/mL;m為樣品質(zhì)量/kg。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Xcalibur軟件進(jìn)行色譜圖采集及數(shù)據(jù)處理，用Excel 2016軟件繪制柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相優(yōu)化

本研究分別以乙腈和甲醇作為有機(jī)相，考察在水相中添加體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸、5 mmol/L NH4OAc、5 mmol/L

NH4OAc（含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸）對(duì)色譜分離和質(zhì)譜靈敏度的影響。結(jié)果表明：添加NH4OAc時(shí)11 種TCs化合物的色譜峰拖尾嚴(yán)重（圖1），這是由于NH4OAc不能完全阻斷TCs化合物與色譜柱硅羥基的相互作用;僅添加甲酸，各化合物離子化效率更高，拖尾現(xiàn)象明顯改善，靈敏度普遍較好;OTC和EOTC、TC和ETC、CTC和ECTC，這3 組差向異構(gòu)體具有相同的準(zhǔn)分子離子，

m/z分別為461.2、445.2、479.2，要通過(guò)保留時(shí)間差異來(lái)區(qū)分，有機(jī)相選用乙腈和甲醇，都能將CTC和ECTC分離，但是，OTC和EOTC、TC和ETC 2 組差向異構(gòu)體在有機(jī)相為乙腈的條件下，色譜峰形展寬，無(wú)法實(shí)現(xiàn)基線分離，不能對(duì)其準(zhǔn)確定量，選用甲醇作為流動(dòng)相的有機(jī)相時(shí)，色譜峰形尖銳，分離度和重復(fù)性更好。因此，本研究最終采用0.1%甲酸水溶液-甲醇作為流動(dòng)相。ESI+模式下各化合物的選擇離子色譜圖見(jiàn)圖2

2.1.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

配制質(zhì)量濃度為1 ?g/mL的單標(biāo)溶液，以流動(dòng)注射的方式，在5 ?L/min流速下，用ESI源分別進(jìn)行正離子和負(fù)離子全掃描，所有TCs化合物響應(yīng)最佳的準(zhǔn)分子離子峰均在正離子模式下獲得，均為[M+H]+;將其作為母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，得到各化合物的碎片離子，根據(jù)歐盟決議有關(guān)質(zhì)譜分析方法不得少于4 分的規(guī)定，選取豐度較強(qiáng)、信噪比較高的2 對(duì)子離子為特征離子，其中豐度相對(duì)較強(qiáng)的為定量離子，其次為定性離子;進(jìn)一步優(yōu)化碰撞能量和透鏡電壓。

設(shè)置六通閥，使初始色譜柱流出液切換至廢液，從4 min開(kāi)始切換至質(zhì)譜采集數(shù)據(jù)，15 min后結(jié)束采集，切出質(zhì)譜儀，確保大部分極性較強(qiáng)和極性較弱的雜質(zhì)在4 min之前和15 min之后被洗脫在質(zhì)譜儀之外，減輕對(duì)質(zhì)譜儀的污染。

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1 提取劑的選擇

水產(chǎn)品樣品質(zhì)地黏稠，絞碎后不容易分散，采用勻漿機(jī)分散樣品，易出現(xiàn)部分樣品附著在勻漿機(jī)搗桿上，造成待測(cè)化合物損失。本研究涉及的11 種TCs化合物易與多價(jià)陽(yáng)離子形成不溶性螯合物。EDTA是一個(gè)具有六齒配體的良好配合劑，可競(jìng)爭(zhēng)配合基質(zhì)中存在的大多數(shù)多價(jià)陽(yáng)離子，使TCs化合物游離出來(lái)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，先加入Na2EDTA-McIIvaine緩沖溶液，既有利于分散樣品，增加有機(jī)提取劑與樣品的接觸面積，又能夠避免TCs化合物與多價(jià)陽(yáng)離子發(fā)生反應(yīng)。因此，在提取樣品時(shí)應(yīng)預(yù)先加入少量Na2EDTA-McIIvaine緩沖溶液，再加入適量有機(jī)提取劑。

水產(chǎn)品肌肉組織的主要基質(zhì)干擾物是脂肪、蛋白質(zhì)和少量色素。TCs化合物極性較強(qiáng)，選擇極性溶劑作為提取劑，既可以保證提取效率，同時(shí)又盡可能地去除了基質(zhì)中的干擾物。乙腈和甲醇均具有良好的沉淀蛋白質(zhì)及提取TCs化合物的能力，然而用甲醇提取會(huì)帶入更多的極性基質(zhì)干擾物，增加后續(xù)凈化難度，因此選擇乙腈作為提取溶劑。

TCs化合物具有共同的氫化駢四苯母核，是兩性物質(zhì)，在堿性溶液中易降解，在酸性溶液中較穩(wěn)定。乙腈中加入適量甲酸或乙酸，可維持TCs化合物的穩(wěn)定性，但是隨著pH值的不同會(huì)發(fā)生差向異構(gòu)化和降解等反應(yīng)，當(dāng)pH<2時(shí)易發(fā)生消去反應(yīng)生成脫水物，因此，本研究選擇酸性相對(duì)較弱的乙酸。進(jìn)一步對(duì)乙腈中乙酸的添加比例進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)體積分?jǐn)?shù)1%乙酸乙腈的平均回收率高于2%乙酸乙腈與0.5%乙酸乙腈;1%乙酸乙腈pH值約4.0，而0.5%乙酸乙腈pH值約4.6，2%乙酸乙腈pH值約3.5，pH值太高或太低都會(huì)影響回收率。

本研究還比較了Na2EDTA-McIIvaine緩沖溶液與1%乙酸乙腈體積比分別為1∶15、2∶15、3∶15和4∶15時(shí)的提取效率，發(fā)現(xiàn)體積比為1∶15時(shí)，樣品分散效果不好，且不能完全阻止TCs化合物發(fā)生螯合反應(yīng)，大多數(shù)化合物回收率不足80%，體積比為2∶15和3∶15時(shí)，樣品分散效果良好，CTC回收率分別為79.4%和77.1%，其余化合物回收率為80.5%～91.5%。隨著水相含量增加，后續(xù)脫水劑用量加大，體積比為4∶15時(shí)，無(wú)水Na2SO4用量將不少于20 g，回收率也明顯下降。因此，最終選擇2 mL Na2EDTA-McIIvaine緩沖溶液和15 mL 1%乙酸乙腈作為提取溶劑。不同體積比的提取溶劑對(duì)11 種TCs獸藥回收率的影響見(jiàn)圖3。

2.2.2 鹽析劑和脫水劑的選擇

乙腈與水互溶，蒸發(fā)濃縮難度大，因此在濃縮前應(yīng)加入適量鹽，誘導(dǎo)乙腈產(chǎn)生相分離，促使水相中的TCs化合物在相分離過(guò)程中被萃取到乙腈相。由于多價(jià)陽(yáng)離子與TCs化合物存在螯合反應(yīng)，本研究避開(kāi)多價(jià)陽(yáng)離子鹽，選擇NaCl與NaOAc 2 種鈉鹽作為鹽析劑，考察二者添加量分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g時(shí)的鹽析效果。結(jié)果表明，向提取溶劑中加入0.5 g鈉鹽即可誘導(dǎo)兩相分離;NaCl作為鹽析劑，TCs化合物的平均回收率為80%，NaOAc作為鹽析劑會(huì)不同程度地降低TCs化合物的回收率，平均回收率降低至69%，這可能與NaOAc溶解后會(huì)改變?nèi)芤旱膒H值有關(guān)。進(jìn)一步比較商用凈化包常用的脫水劑無(wú)水MgSO4和無(wú)水Na2SO4的影響，當(dāng)選用無(wú)水MgSO4作為脫水劑時(shí)，平均回收率僅為23%，可能與TCs化合物易與Mg2+形成螯合物，發(fā)生沉淀有關(guān);另一個(gè)原因是TCs化合物熱穩(wěn)定性較差，無(wú)水MgSO4吸水瞬間釋放大量熱量，使溶液溫度升高，導(dǎo)致化合物結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，無(wú)水Na2SO4則沒(méi)有放熱現(xiàn)象，平均回收率明顯大于無(wú)水MgSO4。因此，無(wú)水Na2SO4更適合用作TCs殘留檢測(cè)的脫水劑。對(duì)比無(wú)水Na2SO4添加量為3、5、8、10、13 g的脫水效果，由于水產(chǎn)品本身含水量較高，當(dāng)無(wú)水Na2SO4添加量小于8 g時(shí)，水層并未被完全吸收，添加量8 g基本將水層吸收，考慮到乙腈層中也含有少量水，添加10 g脫水劑，11 種TCs化合物的回收率良好。故本研究選用0.5 g NaCl作為鹽析劑，10 g無(wú)水Na2SO4作為脫水劑。

2.2.3 凈化吸附劑的選擇

樣品經(jīng)過(guò)提取，已經(jīng)去除了絕大部分干擾物，但仍可能存在少量脂肪和色素等雜質(zhì)，為了進(jìn)一步提高凈化效率，減少上機(jī)分析的基質(zhì)效應(yīng)，本研究采用分散固相萃取的凈化方式，比較C18、PSA、NH2和GCB 4 種吸附劑的凈化效果。前3 種均以硅膠為基質(zhì)，分別鍵合C18、PSA和氨丙基。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GCB脫色效果最好，同時(shí)也吸附待測(cè)化合物，導(dǎo)致TCs化合物基本無(wú)回收;NH2凈化樣品在最終復(fù)溶過(guò)微孔濾膜后依然渾濁，上機(jī)分析會(huì)堵塞管路，污染儀器;PSA和C18凈化效果良好，比較二者的回收率發(fā)現(xiàn)，使用PSA處理時(shí)的回收率僅為63%左右，使用C18處理時(shí)的回收率可提高到80%以上，原因是C18主要吸附油脂和弱極性、非極性物質(zhì)，對(duì)待測(cè)化合物無(wú)明顯吸附。故選擇C18作為吸附劑。進(jìn)一步比較C18用量為100、200、400、600 mg時(shí)對(duì)TCs化合物回收率的影響，結(jié)果表明，100 mg添加量的凈化效果不佳，過(guò)量使用會(huì)吸附部分待測(cè)化合物，導(dǎo)致回收率降低，當(dāng)C18用量為200 mg時(shí)，可獲得滿意的凈化效果和回收率，見(jiàn)圖4。

2.3 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.3.1 線性關(guān)系、檢出限與定量限

按1.3.1節(jié)的方法配制10 個(gè)質(zhì)量濃度水平的工作液進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制作。在選定的色譜條件和質(zhì)譜參數(shù)下進(jìn)行檢測(cè)，以目標(biāo)化合物定量離子的峰面積（y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（x，μg/L）為橫坐標(biāo)繪制工作曲線，得到線性回歸方程。

由表2可知，MNC、DMC、CTC和ECTC的線性范圍為10～800 ?g/L，其余化合物的線性范圍為

5～800 ?g/L，相關(guān)系數(shù)為0.998 6～0.999 7，表明各化合物在相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。以定量離子信噪比（RS/N）=3為樣品的檢出限（limits of detection，LOD），

RS/N=10為L(zhǎng)OQ，11 種獸藥的LOD為2.9～6.1 ?g/kg，LOQ為10～20 ?g/kg，能夠滿足中國(guó)、日本、歐盟的食品安全標(biāo)準(zhǔn)要求。

2.3.2 回收率與精密度

在水產(chǎn)品空白樣品中添加11 種獸藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備獸藥含量分別為1 倍、2 倍和5 倍LOQ水平的加標(biāo)樣品，按上述前處理方法及測(cè)定條件進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度水平做6 次平行測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。由表2可知，在LOQ添加水平下各化合物的響應(yīng)良好，在2 倍和5 倍LOQ添加水平下，平均回收率普遍大于80%，RSD為3.2%～10.3%，表明該方法有良好的重復(fù)性，符合多殘留分析的要求。

2.4 實(shí)際樣品測(cè)定

將本研究建立的方法應(yīng)用于檢測(cè)水產(chǎn)品中TCs藥物的殘留量。采集養(yǎng)殖場(chǎng)的對(duì)蝦、大黃魚(yú)、鯉魚(yú)、鱸魚(yú)、大菱鲆、烏鱧、梭子蟹、扇貝養(yǎng)殖品種共84 個(gè)進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)質(zhì)控樣品。檢測(cè)結(jié)果顯示，質(zhì)控樣品回收率滿足分析要求;實(shí)際樣品中，2 份樣品中檢出MTC，殘留量分別為3.73、1.89 ?g/kg，1 份樣品檢出MCC，殘留量為2.06 ?g/kg，其含量均低于方法定量限，其他樣品均未檢出TCs獸藥。

3 結(jié) 論

本研究解決了新型TCs藥物、常規(guī)TCs藥物及其代謝物由于結(jié)構(gòu)相似、易相互轉(zhuǎn)化導(dǎo)致的較難進(jìn)行色譜分離、較難同時(shí)定性定量分析的難題，建立了水產(chǎn)品中11 種TCs藥物的分散固相萃取凈化-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜定量分析方法。分別對(duì)提取溶劑、鹽析劑、脫水劑、吸附劑的選擇與用量等樣品前處理?xiàng)l件、液相色譜條件和質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，采用改進(jìn)的分散固相萃取方法處理樣品，發(fā)揮其快速、簡(jiǎn)便、高通量的優(yōu)勢(shì)，與國(guó)標(biāo)方法和現(xiàn)有文獻(xiàn)方法相比，該方法增加了待檢藥物的數(shù)量，縮短了檢測(cè)周期，節(jié)約了檢測(cè)成本。建立的方法操作簡(jiǎn)便、快速、凈化效果好，靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度均符合多殘留檢測(cè)技術(shù)的要求，為各食品檢測(cè)機(jī)構(gòu)提供了準(zhǔn)確的定性和定量分析方法，有助于食品檢測(cè)機(jī)構(gòu)應(yīng)對(duì)大批量的水產(chǎn)品樣品TCs獸藥殘留的日常監(jiān)控。

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