植物激素對(duì)草地早熟禾愈傷組織的誘導(dǎo)

張學(xué)通 張博學(xué) 林媛媛

摘 要：選取3種草地早熟禾（Poa pratensis L.）為試驗(yàn)材料，以成熟并且飽滿的種子為外植體，在MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基上添加不同種類和濃度植物激素，篩選適宜草地早熟禾愈傷組織的誘導(dǎo)方法，為建立其高效的再生體系奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明，“如意”最佳的初代和繼代愈傷培養(yǎng)基為MS加1.0mg/L2，4-D加0.1mg/L6-BA;“藍(lán)之夢(mèng)”最佳的初代和繼代愈傷培養(yǎng)基為MS加3.0mg/L2，4-D;“優(yōu)美”最佳的初代愈傷培養(yǎng)基為MS加3.0mg/L2，4-D，其最佳的繼代培養(yǎng)基為MS加2.0mg/L2，4-D。

關(guān)鍵詞：草地早熟禾;愈傷組織;組織培養(yǎng);植物激素

中圖分類號(hào)：S-3 ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20200430001

草地早熟禾（Poa pratensis L.）為禾本科早熟禾屬，是一種優(yōu)質(zhì)的冷季型草坪草，其優(yōu)點(diǎn)包括耐冷、綠期較長(zhǎng)、根系發(fā)達(dá)、葉色濃綠、抗性較好，在城市園林綠化、改善環(huán)境等方面被廣泛利用[1，2]。研究發(fā)現(xiàn)，草地早熟禾屬于多倍體植物，并且為無(wú)融合生殖方式，構(gòu)建成熟的再生體系是基因育種的重要手段之一[3]。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)于不同植物的愈傷組織誘導(dǎo)有較大差異，不同激素種類及激素濃度配比直接影響其再生體系的構(gòu)建。本研究選擇3種抗旱性較強(qiáng)的草地早熟禾品種，研究不同激素種類和濃度對(duì)于其愈傷組織誘導(dǎo)情況的差異，篩選適宜的初愈培養(yǎng)基及繼代培養(yǎng)基，為后續(xù)完整再生體系的構(gòu)建提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取的供試材料為3個(gè)草地早熟禾品種，分別是“如意”、“藍(lán)之夢(mèng)”、“優(yōu)美”，均購(gòu)于北京正道生態(tài)科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 外植體的消毒

本研究選擇成熟并且飽滿供試草地早熟禾種子，用自來(lái)水沖洗種子1h，用無(wú)菌水沖洗3次，浸泡于無(wú)菌水30min。在無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行消毒，消毒方式分為4種：75%乙醇消毒30s，再用1%NaClO消毒5min，無(wú)菌水沖洗5～6遍，之后將種子置于無(wú)菌濾紙;75%乙醇消毒30s，再用1%NaClO消毒10min，無(wú)菌水沖洗5～6遍，之后將種子置于無(wú)菌濾紙;75%乙醇消毒60s，再用1%NaClO消毒5min，無(wú)菌水沖洗5～6遍，之后將種子置于無(wú)菌濾紙;75%乙醇消毒60s，再用1%NaClO消毒10min，無(wú)菌水沖洗5～6遍，之后將種子置于無(wú)菌濾紙。統(tǒng)計(jì)7d的污染率，21d的褐化率。

1.2.2 草地早熟禾種子愈傷組織的誘導(dǎo)

將消毒后的種子接種于基本MS培養(yǎng)基，培養(yǎng)基瓊脂濃度為10g/L，蔗糖濃度為30g/L，不同激素組合方式見(jiàn)表1。每個(gè)培養(yǎng)瓶接種10～20粒種子，每個(gè)處理接種20瓶。將培養(yǎng)瓶置于25℃黑暗培養(yǎng)，每7d記錄各處理的出愈率及生長(zhǎng)狀態(tài)，28d之后統(tǒng)計(jì)愈傷組織的誘導(dǎo)率。將生長(zhǎng)良好的愈傷組織接種到新配置的繼代培養(yǎng)基中，42d之后觀察并統(tǒng)計(jì)愈傷組織繼代培養(yǎng)的情況。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

利用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS22.0對(duì)誘導(dǎo)率相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析;采用Graphpad prism 8.0進(jìn)行圖形的制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒方式對(duì)外植體染菌率和褐化率的影響

由圖1可知，乙醇、NaClO溶液消毒時(shí)間對(duì)草地早熟禾種子的污染率和褐化率均有影響。消毒方式4（75%乙醇60s加1%NaClO 10min）的污染率最低，其次是消毒方式2（75%乙醇30s加1% NaClO 10min）（見(jiàn)圖1-A）。綜合4種消毒方式的污染率，發(fā)現(xiàn)隨著NaClO消毒時(shí)間的減少，污染率明顯提升。4種消毒方式對(duì)愈傷組織褐化率的影響排序?yàn)?<2<3<4，結(jié)果發(fā)現(xiàn)消毒時(shí)間越長(zhǎng)，褐化率越高。

2.2 不同激素對(duì)草地早熟禾初代愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由圖2可以看出，草地早熟禾因品種不同，其2，4-D與6-BA激素組合誘導(dǎo)的出愈率也存在一定差異。在N-5（MS加1.0mg/L 2，4-D加0.1mg/L6-BA）培養(yǎng)基中，草地早熟禾“如意”的出愈率最高，其次是N-3（MS加3.0mg/L2，4-D）的誘導(dǎo)培養(yǎng)率較高。這與“藍(lán)之夢(mèng)”的誘導(dǎo)結(jié)果差異較大，“藍(lán)之夢(mèng)”在N-2（MS加2.0mg/L2，4-D）和N-3培養(yǎng)基中出愈率最高，而其它組培養(yǎng)的出愈率較低。草地早熟禾“優(yōu)美”僅在N-3培養(yǎng)基中出愈率最高，其它組出愈率較低。綜合N1、N2、N3、N4的數(shù)據(jù)，研究發(fā)現(xiàn)3種草地早熟禾種子的出愈率均隨著2，4-D濃度的增加逐漸增多，但2，4-D增加為4mg/L時(shí)，出愈率被顯著抑制。綜合N5、N6、N7、N8的數(shù)據(jù)，僅“如意”在N5培養(yǎng)基誘導(dǎo)下出愈率較高，“藍(lán)之夢(mèng)”、“優(yōu)美”的4種培養(yǎng)基的出愈率均較低。對(duì)比N1～N8的數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，2.0～3.0mg/L2，4-D誘導(dǎo)的出愈率較高，而2，4-D與6-BA混合培養(yǎng)基大部分抑制了愈傷組織的出愈率。

2.3 不同激素對(duì)草地早熟禾繼代愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將初代培養(yǎng)基誘導(dǎo)得到的愈傷組織，接種到對(duì)應(yīng)的繼代培養(yǎng)基中（見(jiàn)表2）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，“如意”在2種不同的繼代培養(yǎng)基中，增值倍數(shù)均超過(guò)2.32，其中MS加1.0mg/L2，4-D加0.1mg/L6-BA的增值得到的愈傷組織的質(zhì)量更好，呈淡黃色，多數(shù)愈傷呈顆粒感?！八{(lán)之夢(mèng)”在MS加3.0mg/L2，4-D的培養(yǎng)中增值狀況最好，增值率高，且愈傷質(zhì)量良好。“優(yōu)美”在MS加2.0mg/L2，4-D繼代培養(yǎng)中不僅增值倍數(shù)較高，而且生長(zhǎng)狀態(tài)良好，呈現(xiàn)淡黃色的顆粒感。綜上結(jié)果，“如意”最佳的繼代培養(yǎng)基為MS加1.0mg/L2，4-D加0.1mg/L6-BA，“藍(lán)之夢(mèng)”的最佳繼代培養(yǎng)基為MS加3.0mg/L2，4-D，“優(yōu)美”的最佳繼代培養(yǎng)基為MS加2.0mg/L2，4-D。