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    垂盆草苷對幼齡肝內(nèi)膽汁淤積大鼠的作用機制

    2020-05-12 15:42:54向華夏
    中國藥科大學學報 2020年1期
    關(guān)鍵詞:勻漿膽汁酸淤積

    向華夏,康 權(quán)*

    (1重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院肝膽外科,重慶400014;2重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院兒科研究所干細胞實驗室,兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室,國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學研究中心,兒童發(fā)育重大疾病國家國際科技合作基地,兒科學重慶市重點實驗室,重慶400014)

    膽汁淤積是指膽汁形成、分泌和攝取中某一環(huán)節(jié)發(fā)生障礙導致膽汁流通不暢而引起的臨床癥狀[1]。臨床表現(xiàn)主要有黃疸、皮膚瘙癢、大便顏色變淺、尿色深等。按發(fā)生部位可分為肝內(nèi)膽汁淤積和肝外膽汁淤積,其中,肝內(nèi)膽汁淤積在肝臟疾病中十分普遍,可見于急性和慢性肝病、藥物性肝炎、妊娠性肝炎以及自身免疫性肝病等[2]。新生兒肝內(nèi)膽汁淤積癥[3]就是新生兒發(fā)病率較高的肝臟疾病,表現(xiàn)為結(jié)合性高膽紅素血癥伴黑尿,其發(fā)病率在1∶500到1∶5 000之間。據(jù)報道,垂盆草對于各種肝病都有一定的治療效果[4-5],這給膽汁淤積的治療提供了一定的參考和啟示。

    研究發(fā)現(xiàn)垂盆草粗提物對于膽汁淤積模型大鼠具有一定的治療效果[6],其主要活性成分是垂盆草苷[7](sarmentosin,SA),其主要的生物活性為保肝降酶作用。但是關(guān)于SA抗肝內(nèi)膽汁淤積的報道過少且不全面。因此,本研究基于SA抗肝內(nèi)膽汁淤積的作用研究,通過觀察SA對幼齡大鼠的膽汁流量及代謝酶的影響,膽汁酸轉(zhuǎn)運蛋白及合成蛋白的表達來評價SA的作用機制,為其臨床用藥提供可靠的實驗依據(jù)。

    1 材 料

    1.1 試 劑

    羧甲基纖維素鈉(CMC-Na),垂盆草苷(SA,純度為97%,上海赫彭生物科技有限公司);熊去氧膽酸(UDCA,成都普思生物有限公司);α-萘異硫氰酸酯(ANIT,美國Sigma公司);丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)的活性和總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、總膽汁酸(TBA)試劑盒(山東博科生物有限公司)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、γ-干擾素(INF-γ)、白細胞介素 1β(IL-1β)檢測試劑盒(南京建成生物有限公司);DMEM培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清、RIPA細胞裂解液、蛋白質(zhì)上樣緩沖液、PBS緩沖液、TBST緩沖液;PVDF膜、電泳緩沖液、轉(zhuǎn)膜緩沖液、EPS300電泳液(北京索萊寶科技有限公司公司);BCA蛋白濃度測定試劑盒、FXR(farnesoid X receptor)抗體、SHP-1(small heterodimer partner-1)抗體、SHP-2抗體、CYP7A1抗體、CYP27A1抗體、MRP2(multidrug resistance-associated protein-2)抗體、BSEP(bile salt export pump)抗體、NTCP(sodium taurocholate cotransporting polypeptide)抗體、β-actin抗體購自于(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);其他試劑均為市售分析純。

    1.2 儀 器

    BK-200分立式全自動生化分析儀(山東博科生物有限公司);AD200l-P高速分散勻漿機(上海平軒科學儀器有限公司);Tecan Infinite F50酶標儀(瑞士Tecan公司);Ti-S型倒置熒光顯微鏡(日本尼康公司);TGL-20M型臺式高速冷凍離心機(廈門森態(tài)儀器儀表有限公司);Tanon5200化學發(fā)光成像系統(tǒng)、VE180微型垂直電泳槽、VE186轉(zhuǎn)移電泳槽(上海天能科技有限公司)。

    1.3 動 物

    SPF級SD雄性大鼠(3周齡,100±20 g)由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供,合格證號:SYXK(渝)2017-0012。大鼠飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院動物中心清潔級動物房。之后相關(guān)動物實驗均在動物中心操作間進行。所有動物實驗均符合動物倫理委員會標準。

    2 方 法

    2.1 動物分組

    48只幼齡雄性SD大鼠,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,使其充分熟悉環(huán)境,然后隨機分為6組,每組8只,具體為:正常組 (Control),模型組 (Model,ANIT 80 mg/kg),陽性對照組(UDCA,100 mg/kg),垂盆草苷低劑量組(SA-L,20 mg/kg)、中劑量組(SAM,40 mg/kg)和高劑量組(SA-H,80 mg/kg)。

    2.2 大鼠膽汁淤積模型構(gòu)建

    除正常組和模型組大鼠灌胃等量溶劑CMC-Na溶液外,其余各組大鼠均各自按照相應(yīng)的給藥劑量連續(xù)灌胃1周。在第5日除正常組外的其余各組大鼠均一次性灌胃80 mg/kg ANIT造模,正常組大鼠一次性灌胃等量溶劑橄欖油。在整個給藥周期中,觀察各組大鼠的一般狀況、皮毛變化、有無死亡情況等。造模后48 h開始收集實驗樣本并處理。

    2.3 膽汁收集

    用20%烏拉坦溶液麻醉大鼠,然后固定于大鼠固定板上,進行膽管膽汁引流手術(shù)。剪開大鼠腹腔,用注射針頭輕輕在膽總管上戳開一道小口,用PE-10插管插入膽總管后固定,有黃色膽汁流出即開始計時,用EP管收集0~45 min內(nèi)的膽汁流量(μL)。

    2.4 血清生化指標檢測

    對大鼠進行眼眶采血,常溫靜置1 h,5 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 min,取上層血清放置于4℃溫度下保存,然后取血清采用全自動生化分析儀檢測大鼠血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)的活性和總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、總膽汁酸(TBA)的活性水平。

    2.5 肝組織病理學檢查

    處死大鼠,取大鼠肝臟用多聚甲醛固定,經(jīng)乙醇常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅(HE)染色、封片、光學顯微鏡下觀察肝臟組織的病理學變化。

    2.6 肝組織中 MDA、SOD、GSH-Px檢測

    取一部分肝組織用生理鹽水制成10%的組織勻漿溶液,在4℃下10 000 r/min離心10 min,取上清液,按照丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒說明書測定肝臟相應(yīng)氧化應(yīng)激水平的含量。

    2.7 血液中 TNF-α、IFN-γ、IL-1β檢測

    取一部分血清依照腫瘤壞死因子(TNF-α)、γ干擾素(IFN-γ)和白介素1β(IL-1β)試劑盒說明書測定 TNF-α、IFN-γ和 IL-1β的表達。

    2.8 Western blot法分析膽汁酸轉(zhuǎn)運蛋白和合成蛋白的表達

    取大鼠肝組織約50 mg,用PBS溶液清洗3遍,然后剪碎,加入RIPA蛋白質(zhì)裂解緩沖液1 mL,冰上充分勻漿30 min,于4℃以10 000 r/min離心10 min,取上清液用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定其蛋白質(zhì)濃度。安置電泳裝置后,在10%SDSPAGE凝膠上電泳分離,調(diào)整蛋白上樣量為30μg,80 V電壓電泳至跑完濃縮膠,約30 min,然后將電壓調(diào)至120 V,跑完分離膠,約60 min,然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜在5%BSA中封閉1 h,用TBST洗滌3次,每次5 min,然后將PVDF膜放入相應(yīng)的FXR、SHP-1、SHP-2、CYP7A1、CYP27A1、MREP2、BSEP、NTCP、β-actin一抗中,在 4℃下孵育過夜,第2天將一抗封閉后的PVDF膜用TBST洗滌3次,每次5 min。然后將PVDF膜加入相應(yīng)的二抗孵育1 h,然后用PBST洗滌3次,每次10 min。用ECL顯色液顯色。以β-actin為參比蛋白對FXR、SHP-1、SHP-2、CYP7A1、CYP27A1、MREP2、BSEP、NTCP進行分析。

    2.9 統(tǒng)計學分析

    應(yīng)用軟件SPSS 19.0、Image J對結(jié)果進行數(shù)據(jù)處理,各組數(shù)據(jù)以±s表示,多組間比較采用多因素方差分析(One Way ANOVA,P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義,P<0.01是顯著性差異。

    3 結(jié) 果

    3.1 垂盆草苷對膽汁流量的影響

    膽汁流量是考察ANIT誘導的大鼠肝損傷模型是否造模成功的最直觀指標。結(jié)果如表1所示,與正常組相比,模型組大鼠膽汁流量被明顯抑制(P<0.01),說明造模成功。與模型組相比,UDCA組大鼠的膽汁流量顯著增加(P<0.01),垂盆草苷低劑量組無統(tǒng)計學意義,垂盆草苷中劑量組膽汁流量有一定的增加(P<0.05,P<0.01),垂盆草苷高劑量組膽汁流量顯著增加(P<0.01),且膽汁流量的恢復呈劑量依賴性。

    3.2 垂盆草苷對血清生化指標的影響

    如表2所示,模型組大鼠血清中 ALT、AST、ALP、TBIL、DBIL和TBA含量水平較正常組均顯著升高(P<0.01),說明ANIT造模成功;與模型組相比,UDCA組大鼠血清中 ALT、AST、ALP、TBIL、DBIL和TBA水平顯著下降(P<0.01);垂盆草苷低劑量組大鼠血清中的ALT、TBIL和DBIL水平降低(P<0.05);垂盆草苷中、高劑量組大鼠血清中的 ALT、AST、ALP、TBIL、DBIL和 TBA水平顯著降低(P<0.05,P<0.01)。垂盆草苷對于生化指標的影響呈劑量依賴性,其中,垂盆草苷高劑量組降低血清中的AST與AST水平優(yōu)于陽性對照組,降低ALP、TBIL、DBIL和TBA水平與UDCA相近,說明垂盆草苷高劑量組與UDCA組作用相當。

    Table 1 Effect of sarmentosin(SA)on bile flow rate within 45 min in rats(±s,n=8)

    Table 1 Effect of sarmentosin(SA)on bile flow rate within 45 min in rats(±s,n=8)

    UDCA:Ursodeoxycholic acid**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs model group

    Group Dose/(mg/kg) Bile flow rate/[μL/(min·100 g )]0 15 15 30 30 45 min Control - 10.43±2.53 11.14±2.31 8.79±1.55 Model 80 2.64±0.87** 2.95±0.65** 2.20±0.41**UDCA 100 8.49±1.10## 9.24±1.24## 7.23±0.66##SA 20 3.38±0.46 4.27±0.92 2.76±0.69 40 5.52±1.65# 7.91±0.68## 4.23±0.82##80 7.24±1.07## 9.02±0.72## 7.04±1.04##

    Table 2 Effect of SA on alanine aminotransferase(ALT),aspartate aminotransferase(AST),alkaline phosphatase(ALP),total bilirubin(TBIL),direct bilirubin(DBIL)and total bile acid(TBA)in serum of rats(±s,n=8)

    Table 2 Effect of SA on alanine aminotransferase(ALT),aspartate aminotransferase(AST),alkaline phosphatase(ALP),total bilirubin(TBIL),direct bilirubin(DBIL)and total bile acid(TBA)in serum of rats(±s,n=8)

    **P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs model group

    Group Dose/(mg/kg)ALT/(U/L)AST/(U/L)ALP/(U/L)TBIL/(μmol/L)DBIL/(μmol/L)TBA/(μmol/L)Control - 36.28±3.62 134.81±25.77 54.34±15.45 6.63±3.38 3.06±1.14 47.93±8.17 Model 80 161.75±27.96**305.79±38.39**143.88±25.88**44.25±8.31**25.94±4.88**145.85±19.34**UDCA 100 48.65±10.82## 142.48±29.68## 59.7±10.91## 8.13±2.42## 5.68±1.54## 57.96±7.82##SA 20 136.95±24.36# 277.63±32.26 131.49±14.95 36.75±5.99# 20.5±3.89# 131.34±15.76 40 90.1±10.26## 205.09±29.53## 85.91±11.75## 18.25±3.49## 14.01±2.57## 102.15±8.48##80 46.01±8.59## 135.85±35.50## 62.9±9.91## 8.5±1.60## 6.73±1.17## 67.03±17.94##

    3.3 垂盆草苷對肝臟組織病理學的影響

    如圖1所示,正常組大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)形態(tài)正常,細胞排列整齊緊密,未出現(xiàn)變性壞死的狀態(tài)(圖1-A);模型組大鼠肝臟組織受損嚴重,遭到嚴重破壞,中央靜脈充血嚴重,出現(xiàn)明顯的炎癥浸潤現(xiàn)象,說明造模成功(圖1-B);與模型組相比,UDCA組大鼠肝細胞壞死明顯減少,肝細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)較為完整,中性粒細胞浸潤明顯減少,未出現(xiàn)明顯的炎癥浸潤現(xiàn)象(圖1-C);垂盆草苷低劑量組大鼠肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)好轉(zhuǎn),但是中央靜脈區(qū)周圍肝細胞壞死,中央靜脈未出現(xiàn)嚴重的充血現(xiàn)象,同時有少量的炎癥浸潤現(xiàn)象(圖1-D);垂盆草苷中劑量組大鼠肝組織可見大部分肝細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整,中央靜脈區(qū)出現(xiàn)少量充血現(xiàn)象和炎癥浸潤現(xiàn)象(圖1-E);垂盆草苷高劑量組與UDCA組類似,肝組織中細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)保持完整,中央靜脈區(qū)周圍界限模糊,比模型組明顯的好轉(zhuǎn)(圖1-F)。組織病理學結(jié)果表明,垂盆草苷對模型組肝臟組織損傷具有一定程度的改善作用,其中高劑量組大鼠肝組織病理改善明顯。

    3.4 垂盆草苷對MDA、SOD、GSH-Px的影響

    如表3所示,與正常組相比,模型組大鼠肝組織勻漿中脂質(zhì)代謝產(chǎn)物MDA含量明顯升高(P<0.01),抗氧化酶 SOD和 GSH-Px含量顯著降低(P<0.01),說明模型組大鼠出現(xiàn)明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)。與模型組相比,UDCA組大鼠肝組織勻漿中MDA含量有明顯降低(P<0.01),而抗氧化酶SOD和GSH-Px含量顯著升高(P<0.01);垂盆草苷低劑量組大鼠肝組織勻漿中MDA含量下降同時,GSH-Px含量升高(P<0.05);而垂盆草苷中、高劑量組大鼠肝組織勻漿中MDA含量明顯下降(P<0.01),而抗氧化酶SOD和GSH-Px含量明顯升高(P<0.05,P<0.01)。結(jié)果表明,垂盆草苷高劑量組降低組織中MDA的效果與UDCA組相似,同時提升組織中抗氧化酶SOD與GSH-Px的活性與UDCA組的效果類似。

    Figure 1 Effect of SA on hepatic histopathology inα-naphthylisothiocyanate(ANIT)-induced cholestasis rats(HE,×200)A:Control;B:Model;C:UDCA;D:SA(20 mg/kg);E:SA(40 mg/kg);F:SA(80 mg/kg)

    Table 3 Effect of SA on malondialdehyde(MDA),superoxide dismutase(SOD)and glutathione peroxidase(GSH-Px)in rats tissue homogenate(±s,n=8)

    Table 3 Effect of SA on malondialdehyde(MDA),superoxide dismutase(SOD)and glutathione peroxidase(GSH-Px)in rats tissue homogenate(±s,n=8)

    **P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs model group

    Group Dose/(mg/kg) MDA/(nmol/mg) SOD/(U/mg) GSH-Px/(mg/g )Control - 0.98±0.09 122.85±14.10 9.60±1.46 Model 80 2.83±0.58** 80.69±7.91** 2.43±0.82**UDCA 100 1.13±0.21## 118.82±9.38## 8.87±1.43##SA 20 2.26±0.43# 85.09±6.45 4.54±0.86#40 1.69±0.28## 99.02±10.94# 6.69±1.71##80 1.19±0.24## 115.39±10.87## 8.79±1.83##

    3.5 垂盆草苷對 TNF-α、IFN-γ、IL-1β的影響

    如表4所示,與正常組相比,模型組大鼠血清中 TNF-α、IFN-γ、IL-1β的表達明顯升高(P<0.01),說明模型組大鼠出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng),與模型組相比,UDCA組大鼠血清中 TNF-α、IFN-γ、IL-1β的表達明顯降低(P<0.01),垂盆草苷低劑量組大鼠血清中TNF-α與IL-1β表達降低(P<0.05),;而垂盆草苷中、高劑量組大鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-1β的表達明顯降低(P<0.01)。結(jié)果表明,垂盆草苷高劑量組下調(diào)炎癥因子TNF-α、IFN-γ的表達效果與UDCA組相似,說明垂盆草苷可以降低炎癥因子的表達。

    Table4 Effect of SA on serum levels of tumor necrosis factor-alpha(TNF-α),interferon-gamma(IFN-γ)and interleukin-1β(IL-1β)in rats(±s,n=8)

    Table4 Effect of SA on serum levels of tumor necrosis factor-alpha(TNF-α),interferon-gamma(IFN-γ)and interleukin-1β(IL-1β)in rats(±s,n=8)

    **P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs model group

    Group Dose/(mg/kg) TNF-α/(pg/mL) IFN-γ/(pg/mL) IL-1β/(pg/mL)Control - 60.69±5.25 25.05±4.50 41.51±6.29 Model 80 208.95±8.85** 116.14±10.72** 195.28±15.16**UDCA 100 90.34±5.41## 38.34±10.09## 85.74±9.01##SA 20 198.34±10.71# 111.93±8.58 178.19±9.23#40 135.09±10.54## 64.33±8.05## 142.31±8.51##80 94.74±4.66## 36.59±5.61## 102.56±12.23##

    3.6 垂盆草苷對膽汁酸轉(zhuǎn)運蛋白和合成蛋白的影響

    模型組 FXR、SHP-1、SHP-2、BSEP、MREP2、NTCP蛋白表達水平較正常組顯著下降(P<0.01),CYP7A1、CYP27A1蛋白表達水平顯著升高(P<0.01);與模型組相比,垂盆草苷低劑量組SHP-1、BSEP、MREP2、NTCP蛋白表達水平升高(P<0.05),垂盆草苷中劑量組 FXR、SHP-1、SHP-2、BSEP、MREP2、NTCP蛋白表達水平升高(P<0.05,P<0.01),CYP7A1蛋白表達水平降低(P<0.05);垂盆草苷高劑量組 FXR、SHP-1、SHP-2、MREP2、BSEP、NTCP蛋白表達水平顯著升高(P<0.01),CYP7A1、CYP27A1蛋白表達水平顯著下降(P<0.01),且蛋白表達呈劑量依賴性(如圖2所示)。實驗結(jié)果表明,垂盆草苷是通過調(diào)控相關(guān)蛋白來發(fā)揮治療作用的。

    Figure 2 Effect of SA on bile acid transporters and synthetic protein(xˉ±s,n=3)**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs model group

    4 討 論

    肝內(nèi)膽汁淤積患者主要臨床癥狀為黃疸、尿色深、皮膚瘙癢等[8],其發(fā)病機制為肝細胞中膽汁轉(zhuǎn)運體異常、膽汁調(diào)節(jié)機制失控[9-10]等。新生兒肝內(nèi)膽汁淤積癥在新生兒中發(fā)病率較高,而ANIT是常用的誘導肝內(nèi)膽汁淤積的模型藥物,能夠很好地模擬人體肝內(nèi)膽汁淤積疾病的特點[11],因此本研究選用ANIT誘導的幼齡肝內(nèi)膽汁淤積大鼠模型探討垂盆草苷的保肝機制。

    研究表明,ANIT給藥造模后,能觀察到大鼠膽汁流量減少[12-14],血清中 AST、ALT、ALP等水平升高,出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng),在炎癥反應(yīng)中淋巴細胞被激活進入肝臟,從而產(chǎn)生氧化應(yīng)激現(xiàn)象[15],同時,ANIT給藥造模后,SOD、GSH-Px抗氧化酶顯著下降[16]。本研究結(jié)果與文獻報道一致,ANIT誘導的模型組大鼠膽汁流量明顯降低,血清中ALT、AST、ALP、TBIL、DBIL、TBA水平顯著升高,炎癥因子 TNF-α、IFN-γ、IL-1β的表達升高,肝組織勻漿中MDA含量增加,而抗氧化酶SOD、GSH-Px含量下降,這些都說明ANIT誘導的膽汁淤積癥狀有明顯的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激現(xiàn)象。

    研究發(fā)現(xiàn),F(xiàn)XR核受體是維持膽汁酸肝腸循環(huán)和穩(wěn)態(tài)平衡的重要核受體,在膽汁淤積過程中發(fā)揮重要作用,可以誘導多種基因的表達,參與調(diào)控膽汁酸的新陳代謝,維護體內(nèi)膽汁酸動態(tài)平衡[17-18]。首先是膽汁酸合成,膽汁酸合成有兩個途徑,中性合成途徑是其主要途徑,CYP7A1是該途徑的關(guān)鍵酶,會通過一系列酶促反應(yīng)生產(chǎn)膽汁酸,而激活 FXR會激活 SHP受體,從而抑制CYP7A1的表達,達到抑制膽汁酸合成[19]的目的;另外一個途徑被稱為替代途徑,這個途徑會產(chǎn)生酸性膽固醇,若膽固醇進入線粒體內(nèi)會導致膽汁酸合成受到限制,CYP27A1是一種多功能的細胞色素羥化酶,能夠催生替代途徑的第一步,因此,抑制CYP27A1的表達也會抑制膽汁酸的合成;同時,激活FXR-SHP軸[20],可以抑制?;撬岬暮铣?,而?;撬嵩谀懼岽x中起著重要的中間作用。另外是膽汁酸轉(zhuǎn)運,F(xiàn)XR可激活膽汁酸外排轉(zhuǎn)運蛋白有膽鹽輸出泵(BSEP),其激動劑能上調(diào)MRP2的表達;同時,激活FXR誘導SHP上調(diào),可調(diào)節(jié)鈉離子?;撬峁厕D(zhuǎn)運多肽(NTCP)對膽汁酸的攝取作用[21]。因此,探討膽汁酸合成和轉(zhuǎn)運的分子機制是研究膽汁淤積發(fā)生發(fā)展機制的熱點。在本研究結(jié)果中,模型組大鼠肝臟組織中的 FXR、SHP-1、SHP-2、MREP2、BSEP、NTCP蛋 白 表 達 降 低,CYP7A1、CYP27A1蛋白表達升高,這說明ANIT會誘導膽汁酸的合成增加以及降低膽汁酸的轉(zhuǎn)運,這樣會導致嚴重的膽汁淤積現(xiàn)象。

    FXR核受體是調(diào)節(jié)膽汁酸合成、轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵受體,這是臨床研究膽汁淤積發(fā)病機制和臨床治療膽汁淤積的重要參考和方向[22]。但是,目前由于治療肝內(nèi)膽汁淤積的藥物十分缺乏,通過現(xiàn)代藥理學研究分析肝內(nèi)膽汁淤積病理機制,建立類似的動物模型,是目前去尋找發(fā)現(xiàn)治療藥物的常用方法[23]。因此,本研究利用ANIT誘導的幼齡SD大鼠的肝內(nèi)膽汁淤積模型,以探討垂盆草苷(SA)ANIT誘導的肝內(nèi)膽汁淤積大鼠模型的干預和調(diào)節(jié)作用。研究結(jié)果表明,垂盆草苷可顯著增加幼齡SD大鼠膽汁流量;降低血清中 ALT、AST、ALP、TBIL、DBIL、TBA水平;降低炎癥因子 TNF-α、IFN-γ、IL-1β的表達;顯著降低肝臟組織中脂質(zhì)代謝產(chǎn)物MDA的含量,顯著升高抗氧化酶SOD、GSH-Px的含量;改善肝臟組織病理狀態(tài),垂盆草苷高劑量組的作用效果與UDCA組類似。同時,通過Western blot法分析膽汁酸轉(zhuǎn)運蛋白與合成蛋白發(fā)現(xiàn),垂盆草苷可上調(diào) FXR、SHP-1、SHP-2、MREP2、BSEP、NTCP蛋白表達,下調(diào) CYP7A1、CYP27A1蛋白表達。因此,本研究結(jié)果表明,垂盆草苷可顯著改善幼齡SD大鼠膽汁淤積造成的肝臟損傷,對肝內(nèi)膽汁淤積造成的幼齡SD大鼠肝功能損傷具有干預和調(diào)節(jié)作用,其作用機制可能與參與膽汁酸的轉(zhuǎn)運與合成有關(guān)。

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