• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    金水寶片對(duì)順鉑所致大鼠急性腎損傷的保護(hù)作用及機(jī)制

    2020-05-12 15:42:50劉學(xué)武周志敏姜德建
    關(guān)鍵詞:金水造模預(yù)防性

    劉學(xué)武,周志敏,姜德建*,龍 利

    (1湖南省藥物安全評(píng)價(jià)研究中心,長(zhǎng)沙410331;2新藥藥效與安全性評(píng)價(jià)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長(zhǎng)沙410331;3湖北省第三人民醫(yī)院腎病科,武漢430033

    藥物性腎損傷在臨床用藥時(shí)十分常見(jiàn),約占急性腎損傷的20%左右。能引起急性腎損傷的藥物有很多,常見(jiàn)的有化療藥物、抗生素、非甾體抗炎藥(nonsteroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑等。臨床上發(fā)生藥物性腎損傷時(shí),通常在停藥以及糾正酸堿度的同時(shí),給予腎功能保護(hù)藥,以加速腎功能的恢復(fù)。對(duì)已知有腎臟損傷的藥物,通??陕?lián)合腎功能保護(hù)藥物一起服用,以減少急性腎損傷的發(fā)生和發(fā)展。金水寶片主要用于各種病因所致的急性腎臟損傷的預(yù)防和治療[1-2],其療效顯著,但作用機(jī)制不甚明確。本研究采用順鉑誘導(dǎo)大鼠急性腎損傷模型,通過(guò)預(yù)防和治療性給予金水寶片,以評(píng)價(jià)其療效,并探索金水寶片治療急性腎損傷的作用機(jī)制[3]。

    1 材 料

    1.1 試 劑

    金水寶片(江西濟(jì)民可信金水寶制藥有限公司);地塞米松片(廣東南國(guó)藥業(yè)有限公司);順鉑注射液(山東仁和堂藥業(yè)有限公司);大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELSIA試劑盒、大鼠活性氧簇(ROS)ELISA試劑盒(武漢貝茵萊生物科技有限公司);大鼠Caspase 3活性檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司);Anti-p38抗體、Anti-p-p38抗體、Anti-Bax抗體、Anti-Bcl-2抗體(英國(guó) Abcam公司);Anti-β-actin抗體(美國(guó) Proteintech公司)。

    1.2 儀 器

    TP1020型全自動(dòng)脫水機(jī)、ASP300S型全自動(dòng)組織脫水機(jī)、RM2235型石蠟切片機(jī)、EG1150H+C型組織包埋(德國(guó)Leica公司);BX43型生物顯微鏡+MD50型數(shù)碼成像系統(tǒng)(日本奧林巴斯公司);LABOSPECT003型自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司);SpectraMax i3x型多功能酶標(biāo)儀(上海美谷分子儀器有限公司);164-5050電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司);DYCZ-40A轉(zhuǎn)膜儀(北京六一儀器廠)。

    1.3 動(dòng) 物

    SD大鼠144只,SPF級(jí),雄性,(200±20)g,購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)生物技術(shù)有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(湘)2016-0002;在湖南省藥物安全評(píng)價(jià)研究中心屏障環(huán)境飼養(yǎng),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(湘)2015-0016。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

    2 方 法

    分別進(jìn)行金水寶片預(yù)防性給藥和治療性給藥實(shí)驗(yàn),其中預(yù)防性給藥實(shí)驗(yàn)采用大劑量的順鉑經(jīng)腹腔注射誘導(dǎo)急性腎損傷模型;治療性給藥采用小劑量的順鉑經(jīng)靜脈注射誘導(dǎo)急性腎損傷模型。腹腔注射順鉑和靜脈注射順鉑分別模擬臨床大劑量或小劑量的順鉑進(jìn)行化療給藥。

    2.1 預(yù)防性給藥對(duì)順鉑腹腔注射所致急性腎損傷的作用

    雄性SD大鼠66只,按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組(地塞米松,2 mg/kg)、金水寶片低、中、高劑量組(0.135、0.270、0.540 g/kg),其中正常組6只,其余各組均為12只。各組大鼠按10 mL/kg灌胃給予相應(yīng)劑量金水寶片(研磨成粉末,用蒸餾水配制成相應(yīng)濃度的藥液),每日1次,連續(xù)13 d,正常組、模型組灌胃給予等體積蒸餾水。于給藥7 d后,各組大鼠按5 mL/kg一次性腹腔注射順鉑5 mg/kg誘導(dǎo)大鼠急性腎損傷模型,正常組腹腔注射給予等體積0.9%氯化鈉注射液。

    2.2 治療性給藥對(duì)順鉑靜脈注射所致急性腎損傷的作用

    雄性SD大鼠78只,選用其中72只大鼠作為模型組,并按1 mL/kg經(jīng)靜脈注射順鉑2.5 mg/kg,每日1次,連續(xù)5次,誘導(dǎo)大鼠急性腎損傷模型。另取6只雄性大鼠,采用相同方法注射給予等體積0.9%氯化鈉注射液,作為正常組。各組大鼠于造模結(jié)束后眼眶靜脈叢采血,檢測(cè)腎功能尿素氮(BUN)和肌酐(CRE)水平,選取CRE水平最高的大鼠60只,根據(jù)血清CRE水平兼顧BUN和體重,隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性對(duì)照組(地塞米松,2 mg/kg)、金水寶片低、中、高劑量組(0.135、0.270、0.540 g/kg),每組12只。每日給藥前將金水寶片(研磨成粉末)用蒸餾水配制成相應(yīng)濃度藥液。各組大鼠均按10 mL/kg灌胃給予相應(yīng)劑量金水寶片,每日1次,連續(xù)9 d,正常組、模型組灌胃給予等體積蒸餾水。

    2.3 生理指標(biāo)檢測(cè)

    2.3.1 對(duì)腎功能的影響 預(yù)防性給藥和治療性給藥實(shí)驗(yàn)的各組大鼠分別于造模后各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行眼眶靜脈叢采血,檢測(cè)血清BUN和CRE,以監(jiān)測(cè)腎功能的變化。每次采血前均禁食不禁水6 h,然后眼眶采血約1 mL,3 000 r/min離心10 min,取上層血清,采用自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清BUN和CRE。于造模第6天采用代謝籠收集各組大鼠6 h尿量,測(cè)量排尿量,并用自動(dòng)生化儀檢測(cè)尿肌酐水平,并計(jì)算肌酐清除率(mL/min)=尿肌酐×排尿量/(360×血肌酐)。

    2.3.2 對(duì)腎臟組織病理變化的影響 各組大鼠分別于末次給藥后禁食不禁水6 h,CO2麻醉,放血安樂(lè)死,取左側(cè)腎臟,福爾馬林固定,石蠟包埋,切片,HE染色,光鏡下觀察腎臟組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和腎小管上皮細(xì)胞變性等病理改變,并進(jìn)行病理評(píng)分,具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下:腎小管上皮:正常,完好無(wú)損,記“0”分;極少細(xì)胞變性壞死,記“1”分;輕度,記“2”分;中度,記“3”分;重度,記“4”分。透明管型:無(wú),記“0”分;極少,記“1”分;輕度,記“2”分;中度,記“3”分;重度,記“4”分。炎細(xì)胞浸潤(rùn):無(wú),記“0”分;極少,記“1”分;輕度,記“2”分;中度,記“3”分;重度,記“4”分。將各類病理改變的評(píng)分進(jìn)行累加,計(jì)算總分作為腎臟損傷的整體病理評(píng)分。

    2.3.3 對(duì)細(xì)胞因子的影響 各組大鼠分別于末次給藥后禁食不禁水6 h,取右側(cè)腎臟0.025 g,用冰預(yù)冷PBS洗組織,加入RIPA裂解液200μL于勻漿器中反復(fù)研磨至看不見(jiàn)組織塊,冰上蛋白裂解10 min,4℃,12 000 r/min離心 15 min,取上清液,采用ELISA試劑盒檢測(cè)腎臟組織中 TNF-α、ROS的水平和Caspase 3活性。

    2.3.4 對(duì)腎臟凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 取左側(cè)腎臟,福爾馬林固定,石蠟包埋,切片,HE染色,同時(shí)取右側(cè)腎臟0.025 g,用冰預(yù)冷PBS洗組織,加入RIPA裂解液200μL于勻漿器中反復(fù)研磨組織直至看不見(jiàn)組織塊,冰上蛋白裂解10 min,4℃,12 000 r/min離心15 min,將離心后的上清液分裝到0.5 mL的離心管中,并進(jìn)行蛋白定量。分別取總蛋白50μg上樣,進(jìn)行凝膠電泳,半干法轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,以5%的脫脂奶粉封閉1.5 h。用多克隆一抗(兔抗大鼠 t-p38、p-p38、Bax、Bcl-2)與PVDF膜4℃孵育過(guò)夜,TBST洗3次,每次15 min。用HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育90 min,TBST洗3次,每次15 min,ECL化學(xué)發(fā)光法曝光掃描拍照,用Quantity One軟件分析各組大鼠腎臟中t-p38、pp38、Bax、Bcl-2的蛋白相對(duì)表達(dá)量,并計(jì)算各組中相應(yīng)蛋白的表達(dá)與內(nèi)參β-actin的相對(duì)比值。

    2.4 統(tǒng)計(jì)方法

    本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),計(jì)量資料采用±s表示。用Leven′s test方法檢驗(yàn)方差齊性。用單因素方差分析(One-Way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,用LSD test(參數(shù)法)進(jìn)行兩兩比較分析。

    3 結(jié) 果

    3.1 對(duì)腎功能的影響

    3.1.1 對(duì)血清BUN的影響 如圖1所示,經(jīng)預(yù)防性給藥,金水寶片在造模后第3天起效,且持續(xù)給藥,各給藥組BUN在造模后給藥第5天達(dá)到峰值,其中低劑量組血清BUN在造模后給藥第3天較模型組顯著降低(P<0.05),中、高劑量組血清BUN在第3~6天均較模型組顯著降低(P<0.05或P<0.01),各組大鼠血清BUN在造模后給藥第6天可見(jiàn)恢復(fù)趨勢(shì)。經(jīng)治療性給藥,金水寶片在造模后給藥第5天起效,且持續(xù)給藥,各給藥組BUN在造模后給藥第5天達(dá)到峰值,其中低、中劑量組血清BUN在造模后給藥第7、9天較模型組顯著降低(P<0.05),高劑量組血清BUN在第5~9天均較模型組顯著降低(P<0.05或P<0.01),各給藥組BUN在造模后給藥第7天可見(jiàn)恢復(fù)趨勢(shì)。

    Figure 1 Prophylactic effect(A)and therapeutic effect(B)of Jinshuibao tablet on blood urea nitrogen(BUN)level of cisplatin induced acute renal injury model in rats(xˉ±s,n=6 10)1:Normal;2:Model;3:Positive control;4:Jinshuibao tablet(0.135 g/kg);5:Jinshuibao tablet(0.270 g/kg);6:Jinshuibao tablet(0.540 g/kg)##P<0.01 vs normal group;*P<0.05,**P<0.01 vs model group

    3.1.2 對(duì)血清CRE的影響 如圖2所示,經(jīng)預(yù)防性給藥,金水寶片在造模后第3天起效,且持續(xù)給藥,各給藥組CRE在造模后給藥第5天達(dá)到峰值,其中低劑量組血清CRE在造模后各時(shí)間點(diǎn)均與模型組無(wú)明顯差異;中、高劑量組血清CRE在第3~6天均較模型組顯著降低(P<0.05或P<0.01),各組大鼠血清CRE在造模后給藥第6天可見(jiàn)恢復(fù)趨勢(shì)。經(jīng)治療性給藥,金水寶片在造模后給藥第5天起效,且持續(xù)給藥,各給藥組CRE在造模后給藥第5天達(dá)到峰值,其中低、中劑量組血清CRE分別在造模后給藥第7、9天較模型組顯著降低(P<0.05),高劑量組血清CRE在第5~9天均較模型組顯著降低(P<0.05或P<0.01),各給藥組CRE在造模后給藥第7天可見(jiàn)恢復(fù)趨勢(shì)。

    Figure 2 Prophylactic effect(A)and therapeutic effect(B)of Jinshuibao tablet on serum creatinine(CRE)level of cisplatin induced acute renal injury model in rats(x±s,n=6 10)1:Normal;2:Model;3:Positive control;4:Jinshuibao tablet(0.135 g/kg);5:Jinshuibao tablet(0.270 g/kg);6:Jinshuibao tablet(0.540 g/kg)##P<0.01 vs normal group;*P<0.05,**P<0.01 vs model group

    3.1.3 對(duì)肌酐清除率和胱抑素C的影響 如圖3所示,與正常組相比,模型組大鼠肌酐清除率顯著減?。≒<0.01),血清胱抑素 C水平顯著升高(P<0.05或P<0.01);與模型組比較,金水寶片預(yù)防性給藥和治療性給藥后,金水寶片低、中、高劑量組肌酐清除率均顯著增加(P<0.05或P<0.01),血清胱抑素C水平均顯著降低(P<0.05或 P<0.01)。

    3.2 對(duì)腎臟組織的影響

    如圖4所示,正常組腎臟皮質(zhì)、髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰,腎單位形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,間質(zhì)未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組腎臟大量腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死,并可見(jiàn)纖維化,大量管內(nèi)可見(jiàn)透明管型,間質(zhì)可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);經(jīng)預(yù)防性給藥或治療性給藥后,金水寶片各劑量組的腎小管變性、壞死以及炎癥浸潤(rùn)等程度均較模型組有顯著改善,且具有顯著的劑量依賴關(guān)系,其中預(yù)防性給藥的起效劑量為低劑量(0.135 g/kg),治療性給藥的起效劑量為中劑量(0.270 g/kg)。

    Figure 3 Prophylactic effect and therapeutic effect of Jinshuibao tablet on creatinine clearance rate(A)and cystatin Clevel(B)of cisplatin induced acute renal injury model in rats(xˉ±s,n=6 10)1:Normal;2:Model;3:Positive control;4:Jinshuibao tablet(0.135 g/kg);5:Jinshuibao tablet(0.270 g/kg);6:Jinshuibao tablet(0.540 g/kg)##P<0.01 vs normal group;*P<0.05,**P<0.01 vs model group

    Figure 4 Prophylactic effect and therapeutic effect of Jinshuibao tablet on the changes of renal histopathology of cisplatin induced acute renal injury model in rats(xˉ±s,n=6 10)A:Prophylactic administration;B:Therapeutic administration;C:Renal histopathology scores1:Normal;2:Model;3:Positive control;4:Jinshuibao tablet(0.135 g/kg);5:Jinshuibao tablet(0.270 g/kg);6:Jinshuibao tablet(0.540 g/kg)##P<0.01 vs normal group;**P<0.01 vs model group

    3.3 對(duì)腎臟炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)因子的影響

    如圖5所示,與正常組比較,模型組大鼠腎臟組織中 TNF-α、ROS含量升高(P<0.05或 P<0.01);與模型組比較,金水寶片預(yù)防性給藥和治療性給藥均能顯著降低大鼠急性腎損傷模型腎組織TNF-α和 ROS含量(P<0.05或 P<0.01),且其藥效作用具有明顯的劑量依賴關(guān)系。

    3.4 對(duì)腎臟細(xì)胞凋亡蛋白的影響

    3.4.1 對(duì)腎臟 Caspase 3活性以及 t-p38、p-p38 MAPK蛋白表達(dá)的影響 如圖6、7所示,與正常組比較,模型組大鼠腎臟組織Caspase 3活性顯著升高(P<0.05或 P<0.01),t-p38、p-p38蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.01);與模型組比較,經(jīng)預(yù)防性給藥和治療性給藥后,金水寶片低、中、高劑量組Caspase3活性均顯著降低(P<0.05或P<0.01),腎臟組織t-p38和p-p38蛋白的表達(dá)(P<0.05或P<0.01)顯著減少,且均具有明顯的劑量依賴關(guān)系。

    3.4.2 對(duì)腎臟Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)以及Bax/Bcl-2比值的影響 如圖7、8所示,與正常組比較,模型組腎臟Bax的蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.01),Bcl-2蛋白表達(dá)顯著減少(P<0.01),Bcl-2/Bax比值顯著減?。≒<0.01);預(yù)防性給藥和治療性給藥均能顯著減少腎臟組織Bax蛋白的表達(dá)(P<0.05或P<0.01),增加 Bcl-2的蛋白表達(dá)(P<0.01),并顯著增大Bcl-2/Bax比值(P<0.01),且均具有明顯劑量依賴關(guān)系。

    Figure 6 Prophylactic effect and therapeutic effect of Jinshuibao tablet on the protein expression of t-p38(A),p-p38(B)and the activity of Caspase 3(C)of cisplatin induced acute renal injury model in rats(xˉ±s,n=6 10)1:Normal;2:Model;3:Positive control;4:Jinshuibao tablet(0.135 g/kg);5:Jinshuibao tablet(0.270 g/kg);6:Jinshuibao tablet(0.540 g/kg)##P<0.01 vs normal group;*P<0.05,**P<0.01 vs model group

    Figure 7 Prophylactic effect and therapeutic effect of Jinshuibao tablet on the protein expression of Bax(A)、Bcl-2(B)and the ratio of Bcl-2/Bax(C)of cisplatin induced acute renal injury model in rats(xˉ±s,n=6 10)1:Normal;2:Model;3:Positive control;4:Jinshuibao tablet(0.135 g/kg);5:Jinshuibao tablet(0.270 g/kg);6:Jinshuibao tablet(0.540 g/kg)##P<0.01 vs normal group;*P<0.05,**P<0.01 vs model group

    Figure 8 Prophylactic effect(A)and therapeutic effect(B)of Jinshuibao tablet on the protein expression of t-p38,p-p38,Bax and Bcl-2 of cisplatin induced acute renal injury model in rats(xˉ±s,n=6 10)1:Normal;2:Model;3:Positive control;4:Jinshuibao tablet(0.135 g/kg);5:Jinshuibao tablet(0.270 g/kg);6:Jinshuibao tablet(0.540 g/kg)

    4 討 論

    急性腎損傷是一種以短時(shí)間內(nèi)腎小球?yàn)V過(guò)率迅速下降為主要特點(diǎn)的臨床綜合征,是臨床常見(jiàn)的危重病癥之一,發(fā)病后的病死率極高,其病理生理過(guò)程較為復(fù)雜,主要累及腎臟管狀細(xì)胞和血管細(xì)胞的損害,且伴有明顯的炎癥反應(yīng)。本研究分別通過(guò)單次大劑量腹腔注射5 mg/kg的順鉑和連續(xù)5 d小劑量靜脈注射2.0 mg/kg的順鉑誘導(dǎo)大鼠急性腎損傷模型,其中腹腔注射和靜脈注射分別與臨床腹腔灌注給藥和靜脈注射給藥的方式和劑量接近[4-5]。經(jīng)兩種給藥方案造模后,大鼠均表現(xiàn)為典型的急性腎損傷癥狀,如血清CRE、BUN顯著升高,肌酐清除率顯著下降,其中單次大劑量造模的大鼠血清CRE和BUN可升高至小劑量造模的3倍左右,胱抑素C水平可升高至小劑量造模的1.2倍左右,肌酐清除率可下降至小劑量造模的20%左右,組織病理學(xué)結(jié)果也顯示了單次大劑量造模能引更嚴(yán)重的急性腎損傷。分別通過(guò)對(duì)單次大劑量造模大鼠進(jìn)行預(yù)防性給藥以及對(duì)多次小劑量造模的大鼠進(jìn)行治療性給藥后發(fā)現(xiàn),雖然單次大劑量造模能引起更嚴(yán)重的急性腎損傷,但預(yù)防性給藥仍能較好的改善順鉑所致的急性腎損傷,且其療效較治療性給藥更好,主要表現(xiàn)為血清CRE、BUN指標(biāo)的起效時(shí)間縮短(3 d vs 5 d),且肌酐清除率可恢復(fù)到與治療性給藥方式的相當(dāng)水平,提示在臨床應(yīng)用時(shí),通過(guò)提前預(yù)防性給藥,能較早的干預(yù)藥物性腎損傷發(fā)生和發(fā)展。

    研究表明,順鉑經(jīng)腎臟排泄時(shí),可損傷腎小管上皮而產(chǎn)生炎癥和氧化等應(yīng)激反應(yīng),并進(jìn)一步釋放炎癥因子(TNF-α、IL-6、IL-1β等)和氧化產(chǎn)物(ROS)等[6-7],進(jìn)而引起速腎臟細(xì)胞的變性、凋亡和壞死[8-9]。炎癥和氧化應(yīng)激做為刺激信號(hào),可誘導(dǎo)p38的表達(dá)和磷酸化激活[10-11],磷酸化的 p38(p-p38)可進(jìn)一步刺激各種細(xì)胞因子的分泌[12-13],同時(shí)p-p38還能通過(guò)誘導(dǎo)Bax的轉(zhuǎn)位和Bcl-2的表達(dá)來(lái)調(diào)控 Bax、Bcl-2的變化[14]。Bax和 Bcl-2可作為上游信使和下游底物調(diào)節(jié)Caspase 3的表達(dá)。Caspase 3作為細(xì)胞凋亡的下游執(zhí)行者,其高表達(dá)能加速細(xì)胞凋亡的進(jìn)程[14-16]。本研究結(jié)果顯示,金水寶片均能通過(guò)抑制腎臟中TNF-α和ROS的含量來(lái)達(dá)到抗炎和抗氧化的作用,并通過(guò)降低t-p38、p-p38和Bax的蛋白表達(dá),升高Bcl-2的蛋白表達(dá)來(lái)抑制p38 MAPK通路的活化、降低Caspase 3的活性,提示金水寶片對(duì)順鉑所致急性腎損傷的保護(hù)作用機(jī)制可能與其減少 TNF-α,抑制 ROS-p38MAPK-Caspase 3通路來(lái)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān),且金水寶片預(yù)防性給藥和治療性的作用機(jī)制基本類似。

    綜上所述,金水寶片預(yù)防性給藥和治療性給藥均能顯著改善順鉑所致的急性腎損傷模型的腎功能以及腎臟的組織病理變化,提示金水寶片對(duì)順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷具有顯著防治作用,且其作用機(jī)制可能與金水寶片的抑制TNF-α、抑制ROS-p38MAPK-Caspase 3通路,進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。

    猜你喜歡
    金水造模預(yù)防性
    Effectiveness and safety of Jinshuibao capsules (金水寶膠囊) in treatment of residual cardiopulmonary symptoms in convalescent patients of coronavirus disease 2019: a pilot randomized,double-blind,placebo-controlled clinical trial
    金水堂主詞一首
    海燕(2022年2期)2022-02-18 01:37:34
    腎陽(yáng)虛證動(dòng)物模型建立方法及評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)研究進(jìn)展
    脾腎陽(yáng)虛型骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型造模方法及模型評(píng)價(jià)
    濕熱證動(dòng)物模型造模方法及評(píng)價(jià)研究
    晨釣
    2015款奔馳R400車預(yù)防性安全系統(tǒng)故障
    微表處在瀝青路面預(yù)防性養(yǎng)護(hù)中的應(yīng)用
    館藏唐卡保管與預(yù)防性保護(hù)
    西藏科技(2015年1期)2015-09-26 12:09:22
    高等級(jí)公路機(jī)電系統(tǒng)預(yù)防性維護(hù)探索與實(shí)踐
    午夜免费观看性视频| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产成人精品婷婷| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲国产精品国产精品| 国产成人精品在线电影| av福利片在线| 国产精品一区二区在线不卡| 久久久久久久久免费视频了| 欧美bdsm另类| 18禁国产床啪视频网站| 日韩精品免费视频一区二区三区| 午夜精品国产一区二区电影| 亚洲精品在线美女| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 三上悠亚av全集在线观看| 国产成人欧美| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 精品少妇内射三级| 亚洲天堂av无毛| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲av成人精品一二三区| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产精品偷伦视频观看了| 欧美精品一区二区大全| 亚洲一码二码三码区别大吗| 18在线观看网站| 美女主播在线视频| 一区二区三区精品91| 99精国产麻豆久久婷婷| 性高湖久久久久久久久免费观看| 亚洲成人av在线免费| 亚洲人成77777在线视频| 久久国产精品大桥未久av| 色94色欧美一区二区| 亚洲人成77777在线视频| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 亚洲一码二码三码区别大吗| 美女主播在线视频| 最近中文字幕高清免费大全6| 免费黄色在线免费观看| 十八禁高潮呻吟视频| 少妇 在线观看| 国产精品.久久久| 天堂俺去俺来也www色官网| 久久久精品区二区三区| 久久久久精品性色| 99久久精品国产国产毛片| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 色播在线永久视频| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 国产精品女同一区二区软件| 男男h啪啪无遮挡| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 性色av一级| 涩涩av久久男人的天堂| 最近中文字幕2019免费版| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 肉色欧美久久久久久久蜜桃| av片东京热男人的天堂| 亚洲av免费高清在线观看| 久久久久久久亚洲中文字幕| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲内射少妇av| 女性被躁到高潮视频| 国产一区有黄有色的免费视频| av有码第一页| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产av国产精品国产| 午夜激情久久久久久久| videos熟女内射| 18禁动态无遮挡网站| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产精品久久久av美女十八| 赤兔流量卡办理| 国产精品.久久久| 电影成人av| 大香蕉久久成人网| 青草久久国产| 亚洲熟女精品中文字幕| 最黄视频免费看| 国产黄频视频在线观看| 七月丁香在线播放| 国产精品人妻久久久影院| 国产精品一区二区在线不卡| 日本av手机在线免费观看| 毛片一级片免费看久久久久| 午夜91福利影院| 亚洲精品国产av成人精品| 亚洲av免费高清在线观看| 777米奇影视久久| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 久久久久久人妻| 纯流量卡能插随身wifi吗| 91成人精品电影| 成年动漫av网址| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 人妻一区二区av| 久久亚洲国产成人精品v| 久久这里有精品视频免费| 亚洲视频免费观看视频| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 卡戴珊不雅视频在线播放| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 亚洲精品av麻豆狂野| 天堂8中文在线网| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲精品av麻豆狂野| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 成年美女黄网站色视频大全免费| 国产精品.久久久| 天天操日日干夜夜撸| 日韩av不卡免费在线播放| 波多野结衣一区麻豆| 男女高潮啪啪啪动态图| 久久 成人 亚洲| 亚洲av免费高清在线观看| 三上悠亚av全集在线观看| 国产精品国产av在线观看| 国产免费现黄频在线看| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 男女啪啪激烈高潮av片| 久久精品亚洲av国产电影网| 精品国产乱码久久久久久小说| 97在线视频观看| 丰满迷人的少妇在线观看| 精品一品国产午夜福利视频| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 免费在线观看完整版高清| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 女性生殖器流出的白浆| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 中文欧美无线码| 中文欧美无线码| 在线观看三级黄色| 91久久精品国产一区二区三区| 青春草亚洲视频在线观看| 建设人人有责人人尽责人人享有的| a 毛片基地| 秋霞在线观看毛片| 午夜福利视频在线观看免费| 1024香蕉在线观看| 18在线观看网站| 午夜日本视频在线| 丰满迷人的少妇在线观看| 丰满乱子伦码专区| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 久久久国产精品麻豆| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 91国产中文字幕| 日韩三级伦理在线观看| 91精品伊人久久大香线蕉| 久久久久久免费高清国产稀缺| 久久鲁丝午夜福利片| 国产成人91sexporn| 色婷婷久久久亚洲欧美| 岛国毛片在线播放| 最近最新中文字幕免费大全7| 丝袜脚勾引网站| 久久精品国产亚洲av涩爱| 七月丁香在线播放| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲欧美精品自产自拍| 成人漫画全彩无遮挡| 国产爽快片一区二区三区| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 亚洲情色 制服丝袜| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 欧美日韩综合久久久久久| 一边亲一边摸免费视频| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 国产乱人偷精品视频| 大话2 男鬼变身卡| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产亚洲精品第一综合不卡| 日本av免费视频播放| 丰满少妇做爰视频| 另类亚洲欧美激情| 欧美日韩一级在线毛片| 超碰成人久久| 美女高潮到喷水免费观看| 少妇的丰满在线观看| 在线免费观看不下载黄p国产| 大香蕉久久网| 黑人猛操日本美女一级片| 中文字幕制服av| 大话2 男鬼变身卡| 日韩中文字幕视频在线看片| 制服人妻中文乱码| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 在线观看人妻少妇| 午夜福利,免费看| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 欧美激情极品国产一区二区三区| 2022亚洲国产成人精品| 一级片'在线观看视频| 午夜日韩欧美国产| 丰满饥渴人妻一区二区三| 黄色配什么色好看| 久久久久人妻精品一区果冻| 免费黄频网站在线观看国产| 一区二区三区精品91| 美国免费a级毛片| 国产精品国产av在线观看| 久久这里只有精品19| 欧美日韩av久久| 国产在线免费精品| 男女高潮啪啪啪动态图| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 电影成人av| 91精品伊人久久大香线蕉| 精品人妻在线不人妻| 亚洲美女视频黄频| 99热全是精品| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 成人午夜精彩视频在线观看| 日本vs欧美在线观看视频| 少妇熟女欧美另类| 久久精品国产亚洲av高清一级| 观看美女的网站| 一个人免费看片子| 中文字幕人妻熟女乱码| 一区二区三区激情视频| 制服丝袜香蕉在线| 咕卡用的链子| 在线天堂中文资源库| 亚洲综合色网址| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 丰满乱子伦码专区| 亚洲伊人色综图| 国产福利在线免费观看视频| 中文字幕最新亚洲高清| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产极品粉嫩免费观看在线| 亚洲三区欧美一区| 国产精品 国内视频| 亚洲欧美一区二区三区久久| 亚洲在久久综合| 国产男人的电影天堂91| 国产野战对白在线观看| 国产精品成人在线| 国产亚洲最大av| 免费高清在线观看视频在线观看| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲四区av| 91成人精品电影| 边亲边吃奶的免费视频| 午夜激情久久久久久久| 欧美日韩精品网址| 日日啪夜夜爽| 岛国毛片在线播放| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 捣出白浆h1v1| 精品一区在线观看国产| 国产xxxxx性猛交| 视频区图区小说| 一级黄片播放器| av.在线天堂| 中文字幕av电影在线播放| 午夜福利乱码中文字幕| 一级片'在线观看视频| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 成人黄色视频免费在线看| 水蜜桃什么品种好| 永久网站在线| 中文字幕精品免费在线观看视频| 久久精品人人爽人人爽视色| 久久午夜综合久久蜜桃| av视频免费观看在线观看| 国产男女超爽视频在线观看| 看免费av毛片| 尾随美女入室| 精品国产乱码久久久久久小说| 国产一区二区 视频在线| 国产精品一二三区在线看| 欧美97在线视频| 天天操日日干夜夜撸| 欧美另类一区| 亚洲国产欧美网| 黄片无遮挡物在线观看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国产成人av激情在线播放| 久久精品久久精品一区二区三区| 日韩大片免费观看网站| 免费观看无遮挡的男女| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 两性夫妻黄色片| 嫩草影院入口| 成年女人在线观看亚洲视频| 欧美精品一区二区大全| 亚洲欧洲日产国产| 在线 av 中文字幕| 在线观看一区二区三区激情| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 国产一区亚洲一区在线观看| 亚洲欧美精品综合一区二区三区 | 视频区图区小说| 妹子高潮喷水视频| 1024视频免费在线观看| 久久久久网色| 亚洲精品aⅴ在线观看| 性色avwww在线观看| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 青青草视频在线视频观看| 久久久欧美国产精品| 亚洲国产欧美在线一区| 国产xxxxx性猛交| 色吧在线观看| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产高清不卡午夜福利| 精品久久蜜臀av无| 欧美日韩av久久| 成人午夜精彩视频在线观看| 亚洲精品自拍成人| 久久综合国产亚洲精品| 亚洲成人一二三区av| 欧美激情极品国产一区二区三区| 色吧在线观看| 2021少妇久久久久久久久久久| 少妇的逼水好多| 久久99蜜桃精品久久| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 成人二区视频| 老司机影院毛片| 国产男女内射视频| 婷婷成人精品国产| 91aial.com中文字幕在线观看| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 交换朋友夫妻互换小说| a级毛片黄视频| 免费观看在线日韩| 春色校园在线视频观看| 亚洲第一区二区三区不卡| videossex国产| 国产一区二区激情短视频 | 亚洲人成77777在线视频| 在线观看免费高清a一片| 九草在线视频观看| 国精品久久久久久国模美| 久久久久精品人妻al黑| 啦啦啦在线免费观看视频4| 不卡视频在线观看欧美| 亚洲,一卡二卡三卡| 人妻一区二区av| 9色porny在线观看| 国产成人一区二区在线| 青青草视频在线视频观看| 免费在线观看完整版高清| 在线观看国产h片| 精品人妻在线不人妻| 国产精品免费大片| 久久久欧美国产精品| 丰满乱子伦码专区| 尾随美女入室| 色视频在线一区二区三区| 亚洲国产精品999| 国产人伦9x9x在线观看 | 毛片一级片免费看久久久久| 久久国产精品大桥未久av| 久久午夜福利片| 色94色欧美一区二区| 国产高清国产精品国产三级| 成年av动漫网址| 亚洲第一区二区三区不卡| 中文字幕色久视频| 少妇人妻精品综合一区二区| 国产不卡av网站在线观看| 18在线观看网站| 观看美女的网站| 纯流量卡能插随身wifi吗| 午夜福利网站1000一区二区三区| 夫妻午夜视频| 少妇 在线观看| 日本黄色日本黄色录像| 国产男人的电影天堂91| 亚洲精品国产av蜜桃| av网站免费在线观看视频| 在线观看免费高清a一片| 免费看不卡的av| 99久久中文字幕三级久久日本| 黄色 视频免费看| 久久精品国产亚洲av高清一级| 看免费av毛片| 国产精品久久久av美女十八| 一区在线观看完整版| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| www.av在线官网国产| 欧美另类一区| 在线观看一区二区三区激情| 最新中文字幕久久久久| 亚洲精品成人av观看孕妇| 老司机影院毛片| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 十八禁高潮呻吟视频| 中文欧美无线码| 国产片特级美女逼逼视频| 久久精品人人爽人人爽视色| 精品第一国产精品| 青春草视频在线免费观看| 日本wwww免费看| 亚洲av综合色区一区| 丝袜人妻中文字幕| 欧美成人精品欧美一级黄| 成人国产麻豆网| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲av男天堂| 久久婷婷青草| 人人澡人人妻人| 看免费成人av毛片| 好男人视频免费观看在线| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 欧美日韩av久久| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产一区二区在线观看av| 一个人免费看片子| 男女国产视频网站| 免费看不卡的av| 天美传媒精品一区二区| 老司机影院毛片| 亚洲av免费高清在线观看| 男女下面插进去视频免费观看| 欧美日韩精品网址| 永久免费av网站大全| av不卡在线播放| 人成视频在线观看免费观看| 国产精品国产三级国产专区5o| 街头女战士在线观看网站| 纯流量卡能插随身wifi吗| 日日撸夜夜添| 一区二区日韩欧美中文字幕| 观看av在线不卡| 99热全是精品| 国产极品粉嫩免费观看在线| 久久久久久久亚洲中文字幕| 亚洲综合色惰| 丝袜在线中文字幕| 久久久亚洲精品成人影院| 1024视频免费在线观看| 91久久精品国产一区二区三区| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 婷婷色麻豆天堂久久| 又黄又粗又硬又大视频| 国产免费现黄频在线看| 最近中文字幕高清免费大全6| a级片在线免费高清观看视频| 国产激情久久老熟女| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 99热网站在线观看| 午夜福利视频在线观看免费| 国产成人免费观看mmmm| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 男女下面插进去视频免费观看| 我要看黄色一级片免费的| 久久精品国产亚洲av涩爱| 成人国语在线视频| 国产综合精华液| 十八禁高潮呻吟视频| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲欧美一区二区三区久久| 女人久久www免费人成看片| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产高清不卡午夜福利| 欧美日韩精品网址| 午夜av观看不卡| av线在线观看网站| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 欧美人与善性xxx| 色播在线永久视频| 母亲3免费完整高清在线观看 | 在线天堂中文资源库| 春色校园在线视频观看| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 99久久中文字幕三级久久日本| 两个人免费观看高清视频| 免费av中文字幕在线| 看免费成人av毛片| 高清欧美精品videossex| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 97人妻天天添夜夜摸| 男女边摸边吃奶| 999精品在线视频| 色吧在线观看| 久久亚洲国产成人精品v| 国产成人av激情在线播放| 久久久欧美国产精品| 中文字幕人妻熟女乱码| 桃花免费在线播放| 老汉色∧v一级毛片| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 十八禁网站网址无遮挡| av天堂久久9| 亚洲欧美色中文字幕在线| 少妇人妻久久综合中文| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 欧美日韩精品成人综合77777| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲精品自拍成人| 亚洲av免费高清在线观看| 丝袜美腿诱惑在线| 国产成人a∨麻豆精品| 国产不卡av网站在线观看| 少妇人妻久久综合中文| av线在线观看网站| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 乱人伦中国视频| 99热国产这里只有精品6| 在线观看www视频免费| 国产精品成人在线| 人妻系列 视频| 亚洲av日韩在线播放| 国产精品嫩草影院av在线观看| 最近中文字幕2019免费版| 国产精品久久久久久av不卡| 宅男免费午夜| 丰满迷人的少妇在线观看| 深夜精品福利| 亚洲 欧美一区二区三区| 九草在线视频观看| 嫩草影院入口| 亚洲成人av在线免费| 一本久久精品| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲av成人精品一二三区| 日韩免费高清中文字幕av| 欧美最新免费一区二区三区| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 美女中出高潮动态图| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 欧美日韩成人在线一区二区| 亚洲精品在线美女| 五月伊人婷婷丁香| 精品亚洲成国产av| 成人漫画全彩无遮挡| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 妹子高潮喷水视频| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产一区二区三区综合在线观看| 久久久久网色| 国产国语露脸激情在线看| 国产av一区二区精品久久| 人人澡人人妻人| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | freevideosex欧美| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| av天堂久久9| 免费高清在线观看日韩| 欧美日韩精品网址| 少妇人妻 视频| 亚洲视频免费观看视频| 国产在视频线精品| 日本色播在线视频| 青春草视频在线免费观看| 国产1区2区3区精品| 1024视频免费在线观看| 精品亚洲成a人片在线观看| 青青草视频在线视频观看| 大话2 男鬼变身卡| 亚洲精品国产av蜜桃| 一级毛片电影观看| 国产男女超爽视频在线观看| 性色av一级| 国产成人精品婷婷| 成人亚洲精品一区在线观看| 一级a爱视频在线免费观看| 美女国产视频在线观看| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 人妻 亚洲 视频| 午夜91福利影院| 欧美精品一区二区免费开放| 国产淫语在线视频| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 街头女战士在线观看网站| 男人添女人高潮全过程视频| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲av中文av极速乱| tube8黄色片| 亚洲精品av麻豆狂野| 亚洲精品视频女| 91成人精品电影| 久久青草综合色| 男的添女的下面高潮视频| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 黄片播放在线免费| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 成人二区视频| www.精华液| 熟女电影av网| 久久久久久人人人人人| 多毛熟女@视频| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 香蕉精品网在线| 伦理电影免费视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 午夜久久久在线观看| 欧美日韩综合久久久久久| 国产成人欧美| av一本久久久久| 日本免费在线观看一区| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产片内射在线| 男女免费视频国产| 乱人伦中国视频| 黄色怎么调成土黄色| 老鸭窝网址在线观看| 丝袜喷水一区| 热re99久久国产66热| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 一区二区日韩欧美中文字幕|