壯骨舒筋丸藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

楊丁懿 張永萍 楊芳芳

摘要：目的 建立壯骨舒筋丸（白芍、白術(shù)、骨碎補、淫羊藿、黨參等二十余味藥材）的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 方法 TCL法鑒定白芍、白術(shù)、骨碎補、川續(xù)斷皂苷VI、淫羊藿苷。HPLC法測定芍藥苷含量。結(jié)果 TCL斑點清晰，重復(fù)性好。芍藥苷在9.15～228.75μg/mL范圍內(nèi)線性良好，平均加樣回收率為99%（RSD=2.03%）。結(jié)論 該方法可行，重復(fù)性好，可用于壯骨舒筋丸的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：壯骨舒筋丸;TCL;HPLC;白芍;白術(shù);骨碎補;川續(xù)斷皂苷VI;淫羊藿;芍藥苷

中圖分類號：R927.11 ? 文獻標(biāo)志碼：A ? 文章編號：1007-2349（2020）02-0078-07

舒筋壯骨丸為貴州省遵義紅花崗劉端方骨科醫(yī)院的經(jīng)驗方，由黨參、白術(shù)、白芍、當(dāng)歸、熟地黃、海馬、鹿茸、淫羊藿、杜仲、續(xù)斷等20余位味中藥制成的濃縮丸，氣香、味微苦。具有補氣血、養(yǎng)心脾、補肝腎、強筋骨，祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)的功效。治療骨折后期，已近愈合，肝脾腎虛弱證。該方成分復(fù)雜多樣，為保證臨床用藥安全有效，故需要建立統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-A20高效液相色譜儀器（日本島津公司）;郁金香C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;JM-B2003電子天平（諸暨市超澤衡器有限公司）;恒溫水浴鍋（上海雙捷實驗設(shè)備有限公司，批號：DRHH-S4）;SB-4200D超聲波清洗儀（寧波新藝超聲設(shè)備有限公司，批號：18-005016）;ZF-1型三用紫外線分析儀（上海金鵬分析儀器有限公司）;點樣毛細(xì)管（規(guī)格：0.3x100 上海長城科學(xué)儀器商店經(jīng)銷）

1.2 試藥 骨碎補對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號：121169-201304）、川續(xù)斷皂苷VI對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111685-201707）、白術(shù)對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號：120925-201611）、淫羊藿對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號：121632-201502）、白芍對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號：120905-201109）;芍藥苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111685-201734）;高效板G薄層板、硅膠G薄層板（規(guī)格：50×100mm、100×200mm 青島海洋化工廠分廠）;結(jié)晶氯化鋁（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：Q/12HB4249-2009）、硅膠GF254薄層板（規(guī)格：100×200mm 青島海洋化工有限公司制造）、香草醛（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：Q/12HB3637-2010）、乙腈為色譜級（國藥集團化學(xué)試劑有限公司），高液用水均為哇哈哈礦泉水，其他試劑均為分析純（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）。舒筋壯骨丸由貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥劑實驗室提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC含量測定

2.1.1 色譜條件 乙腈-水（12：88）;檢測波長：230 nm;流速：1.0 mL/min;柱溫：30℃。

2.1.2 供試品溶液制備工藝考察：

2.1.2.1 提取方法考察 取本品，混勻，研細(xì)，取1 g，精密稱定，置于50 mL錐形瓶中，移液管精密吸取30 mL甲醇，分別進行回流處理30 min和超聲處理30 min，放冷后補重，吸取溶液過微孔濾膜即為供試品。將供試品分別注入高效液相色譜儀，考察不同提取方法提取樣品中芍藥苷含量的影響，結(jié)果見表1。

2.1.2.2 提取溶劑考察 取本品，混勻，研細(xì)，取1 g，精密稱定，置于50 mL量瓶中，用移液管精密吸取甲醇30 mL與乙醇30 mL作為溶劑采用超聲法處理30 min，放冷后補重，吸取樣品溶液過微孔濾膜即為供試品。將供試品分別注入高效液相色譜儀，考察不同提取溶劑提取對樣品中芍藥苷含量的影響，結(jié)果見表2。

2.1.2.3 提取時間考察 取本品，混勻，研細(xì)，取1 g，精密稱定，置于50 mL量瓶中，用移液管精密吸取甲醇30 mL作為提取溶劑，分別超聲處理15 min，30 min，45 min，放冷后補重，吸取樣品溶液過微孔濾膜即為供試品。將供試品分別注入高效液相色譜儀，考察不同提取時間對樣品中芍藥苷含量的影響，結(jié)果見表3。

2.1.2.4 提取溶劑用量考察 取本品，混勻，研細(xì)，取1 g，精密稱定，置于50 mL量瓶中，用移液管分別精密吸取10 mL，20 mL，30 mL甲醇，超聲處理15 min，放冷后補重，吸取樣品溶液過微孔濾膜即為供試品。將供試品分別注入高效液相色譜儀，考察不同提取溶劑用量對樣品中芍藥苷的影響，結(jié)果見表4。

2.1.2.5 供試品溶液的制備 綜上所述，為了減少細(xì)小顆粒對于有效成分的吸附，便于其提取與溶出，供試品溶液的制備方法為：取壯骨舒筋丸研細(xì)混勻，精密稱取本品1 g，置于50 mL錐形瓶中，用移液管精密吸取20 mL甲醇，稱定重量，超聲15 min，放冷后用甲醇補足損失的重量，過微孔濾膜，即得。

2.1.3 陰性供試品溶液的制備 按壯骨舒筋丸處方稱取方中藥材，剔除白芍，再按照相關(guān)制備工藝制成不含白芍的“壯骨舒筋丸”即為陰性樣品，再按“2.1.2.5”項下的制備方法制備成陰性供試品溶液。

2.1.4 對照品溶液的配制 用十萬分之一天平精密稱取芍藥苷對照品0.68 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖至對照品完全溶解，即得每1 mL含68 μg的對照品溶液。

2.1.5 專屬性考察 按照《中國藥典》2015年版白芍含量測定項下芍藥苷測定方法，檢測波長為230nm，對照品、供試品、陰性供試品溶液均在“2.1.1”色譜條件下進樣，色譜圖見下圖1。

2.1.6 線性關(guān)系考察 精密稱取芍藥苷18.30 mg，溶于20 mL甲醇，將對照品配置成0.915 mg/mL。用移液管分別精密吸取0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1 mL、2 mL、2.5 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇溶液定容至10 mL。在“2.1.1”色譜條件下進樣10μl進行高效液相色譜測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進行回歸，得方程為y =12477x-8856.4（R=0.999），故在9.15～228.75 μg/mL 范圍內(nèi)線性良好。

2.1.7 精密度實驗 在“2.1.1”色譜條件下精密吸取對照品溶液（68 ug/mL）進樣10 μL進行高效液相色譜測定。根據(jù)實驗結(jié)果分析測得芍藥苷峰面積RSD為0.63%，說明儀器精穩(wěn)定，密度良好。

2.1.8 穩(wěn)定性實驗 按“2.1.2.5”項下供試品制備方法制備供試品溶液，在不同時段進行測定（0，2，4，6，8，10，12，16，24小時），按“2.1.1”色譜條件下進樣10μl進行高效液相色譜測定。根據(jù)實驗結(jié)果分析測得芍藥苷峰面積RSD為0.71%，表明樣品溶液在24小時內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.9 重復(fù)性實驗 按“2.1.2.5”項下供試品制備方法制備供試品溶液六份，在“2.1.1”色譜條件下進樣10μl對六份樣品進行測定。測得芍藥苷含有量RSD為2.48%。

2.1.10 加樣回收率實驗 精密稱取六份芍藥苷含量已知的（1.56 mg/g）本品，精密稱取，每份0.5 g，用移液槍精確吸取對照品（0.915 mg/mL）857μl加入六份樣品中，按照“2.1.2.5”項下供試品制備方法制備供試品溶液，在“2.1.1”色譜條件下進樣10μl進行高效液相色譜測定，結(jié)果見表5。

2.2 TLC定性鑒別

2.2.1 續(xù)斷的TCL鑒別

2.2.1.1 供試品的制備[1] 取本品適量，研細(xì)，取5 g，加水50 mL，超聲30 min，過濾，取濾液10 mL，加用水飽和的正丁醇萃取3次，每次10 mL，合并萃取液，用氨試液（40 mL濃氨加水到100 mL）10 mL萃取1次，用正丁醇飽和的水10 mL萃取一次，均取上層澄明溶液，萃取液蒸干，之后加1 mL甲醇使其慢慢溶解，即得供試品溶液。

2.2.1.2 對照品的制備[2] 用十萬分之一天平精密稱取川續(xù)斷皂苷VI對照品0.56 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖至對照品完全溶解，即得每1 mL含56 μg的對照品溶液。

2.2.1.3 陰性樣品溶液的制備 按壯骨舒筋丸處方稱取方中藥材，剔除續(xù)斷，再按照相關(guān)制備工藝制成不含續(xù)斷的“壯骨舒筋丸”即為陰性樣品，再按“2.1.1.1”項下壯骨舒筋丸供試品溶液的制備方法制備陰性樣品溶液。

2.2.1.4 試驗方法與結(jié)果 根據(jù)《中國藥典》2015版第四部通則0502薄層色譜試驗[2]，采用毛細(xì)管點樣器吸取“2.1.1.1”“2.1.1.3”項下溶液5μL，“2.1.1.2”項下溶液2μL，分別點于同一硅膠G板上，正丁醇：醋酸：水（4：1：5）上層溶液為展開劑展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液置于105℃下加熱至斑點顯色清晰[3]。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上都顯紫色斑點，而續(xù)斷陰性對照溶液在相應(yīng)位置處無干擾。見圖2。

2.2.2 白芍的TCL鑒別

2.2.2.1 供試品溶液的制備[2] 取本品適量，研細(xì)，取5 g，加水50 mL，超聲30 min，過濾，取濾液10 mL，加用水飽和的正丁醇萃取2次，每次10 mL，合并萃取液，用氨試液（40 mL濃氨加水到100 mL）2.5 mL萃取1次，用正丁醇飽和的水7.5 mL萃取1次，均取上層溶液，取萃取液蒸干，加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。2.2.2.2對照藥材溶液的制備：稱取0.5 g白芍對照藥材，用“2.2.2.1”項下同樣方法制得。

2.2.2.3 白芍陰性溶液的制備 按壯骨舒筋丸處方稱取方中藥材，剔除白芍，再按照相關(guān)制備工藝制成不含白芍的“壯骨舒筋丸”即為陰性樣品，再按“2.2.2.1”項下壯骨舒筋丸供試品溶液的制備方法制備陰性樣品溶液。

2.2.2.4 試驗方法與結(jié)果 根據(jù)《中國藥典》2015版第四部通則0502薄層色譜試驗，采用毛細(xì)管點樣器吸取“2.2.2.1”“2.2.2.3”項下溶液4μL，“2.2.2.2”項下溶液2μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇：濃氨（8：1：4：1）溶液[4]為展開劑展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸乙醇溶液置于105℃下加熱至斑點顯色清晰[2]。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上都顯藍紫色斑點，而白芍陰性對照溶液在相應(yīng)位置處無干擾。見圖3。

2.2.3 白術(shù)的TCL鑒別

2.2.3.1 供試品溶液的制備[5] 取本品適量，研細(xì)，取5 g，加乙醚50 mL，超聲30 min，過濾，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL溶解，作為供試品溶液。

2.2.3.2 對照藥材溶液的制備 稱取白術(shù)對照藥材0.5 g，按“2.2.3.1”項下同法制成對照藥材溶液。

2.2.3.3 陰性樣品溶液制備 按壯骨舒筋丸處方稱取方中藥材，剔除白術(shù)、蒼術(shù)（含有特定成分蒼術(shù)酮[6]）再按照相關(guān)制備工藝制成不含白術(shù)、蒼術(shù)的“壯骨舒筋丸”即為陰性樣品，再按“2.2.3.1”項下壯骨舒筋丸供試品溶液的制備方法制備陰性樣品溶液。

2.2.3.4 試驗方法與結(jié)果 根據(jù)《中國藥典》2015版第四部通則0502薄層色譜試驗，采用毛細(xì)管點樣器吸取“2.2.3.1”“2.2.3.3”項下溶液7μL，“2.2.3.2”項下溶液4μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚：乙酸乙酯（3：1）溶液為展開劑展開，取出，晾干，置紫外燈（254nm）下觀察[7]。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上都顯暗斑，而白術(shù)陰性樣品色譜在相應(yīng)位置處無相同顯示。且無干擾，分離效果、重現(xiàn)性均好。見圖4。

2.2.4 淫羊藿的TCL鑒別

2.2.4.1 供試品溶液的制備[8] 取本品適量，研細(xì)，取5 g，加水50 mL，超聲30 min，過濾，取濾液10 mL，加用水飽和的正丁醇萃取3次，每次10 mL，合并萃取液，用氨試液（40 mL濃氨加水到100 mL）10 mL萃取2次，用正丁醇飽和的水10 mL萃取3次，蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。

2.2.4.2 對照藥材溶液的制備 稱取0.5 g淫羊藿對照藥材，用“2.2.4.1”項下同樣方法制得。

2.2.4.3 陰性樣品溶液的制備 按壯骨舒筋丸處方稱取方中藥材，剔除淫羊藿，再按照相關(guān)制備工藝制成不含淫羊藿的“壯骨舒筋丸”即為陰性樣品，再按“2.2.4.1”項下壯骨舒筋丸供試品溶液的制備方法制備陰性樣品溶液。

2.2.4.4 試驗方法與結(jié)果 根據(jù)《中國藥典》2015版第四部通則0502薄層色譜試驗，采用毛細(xì)管點樣器吸取“2.2.4.1”“2.2.4.3”項下溶液8μL，“2.2.4.2”項下溶液3μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷：甲醇：水（13：7：2）下層溶液為展開劑展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液置于105℃下加熱至斑點顯色清晰。在對照品色譜顯示色斑的相應(yīng)位置上，供試品色譜顯示相同顏色的淡黃色斑點，而陰性樣品色譜在同樣位置上無相同顯示，且干擾較小，分離效果。重現(xiàn)性均好。見圖5。

2.2.5 骨碎補的TCL鑒別

2.5.5.1 供試品溶液的制備[9] 取本品適量，研細(xì)，取5 g，加水50 mL，超聲處理30 min，過濾，取濾液10 mL，用乙酸乙酯20 mL萃取1次，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解。即得供試品溶液。

2.5.5.2 對照藥材溶液的制備 取對照藥材0.5 g，按“2.5.5.1”項下同法制得對照藥材溶液。

2.5.5.3 陰性樣品溶液的制備 按壯骨舒筋丸處方稱取方中藥材，剔除骨碎補，再按照相關(guān)制備工藝制成不含骨碎補的“壯骨舒筋丸”即為陰性樣品，再按“2.5.5.1”項下壯骨舒筋丸供試品溶液的制備方法制備陰性樣品溶液。

2.2.5.4 試驗方法與結(jié)果 根據(jù)《中國藥典》2015版第四部通則0502薄層色譜試驗，采用毛細(xì)管點樣器吸取“2.2.5.1”“2.2.5.3”項下溶液7μL，“2.2.5.2”項下溶液1μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯：乙酸乙酯：甲酸：水（1：12：2.5：3）上層溶液為展開劑展開，取出，晾干，噴以5%三氯化鋁乙醇溶液，晾干，置于紫外燈（365nm）下檢視。在對照品色譜顯示色斑的相應(yīng)位置上，供試品色譜顯示兩個相同顏色的黃綠色斑點，而陰性樣品色譜在同樣位置上無相同顯示，且干擾較小，分離效果。重現(xiàn)性均好。見圖6。

3 討論

本研究的處方藥味多，研究干擾多，難度較大。而本實驗在測定芍藥苷含量時，考察了多種流動相，如水-甲醇，0.1%磷酸水-乙腈，但由于此藥方中藥味多達20多種，成分多樣且復(fù)雜，導(dǎo)致了上述的流動相檢測出來的芍藥苷均有各種問題，如分離度達不到，基線不平穩(wěn)等，而采用水-乙腈（88：12）則檢測芍藥苷能達到標(biāo)準(zhǔn)，故采用此方法測芍藥苷。

在對白術(shù)進行薄層鑒別時，通關(guān)查閱相關(guān)資料，發(fā)現(xiàn)該處方中的蒼術(shù)也含有蒼術(shù)酮，故在做雙陰性鑒別。白術(shù)含有蒼術(shù)酮，又因本品處方中蒼術(shù)也含有蒼術(shù)酮，所以做成雙陰性試驗，在展開系統(tǒng)石油醚：乙酸乙酯（50：1）[2]條件下，薄層板上呈現(xiàn)紅色斑點，由于顯色劑是香草醛，背景顏色太深致使桃紅色斑點顏色不清晰，故舍棄。于是查閱資料講展開系統(tǒng)換成氯仿：丙酮（19：1）[9]和環(huán)己烷：乙酸乙酯：乙醚（1：1：1）[10]均出現(xiàn)斑點顏色淡不清晰的情況。

在實驗點樣的過程中，分別考察了5μL、7μL、10μL三個點樣量，色譜圖顯示點樣量為10μL時主斑點有拖尾現(xiàn)象，而為5μL時主斑點顏色淡看不清，所以選擇7μL作為最佳點樣量。

4 結(jié)論

壯骨舒筋丸藥味多，不管是進行高效液相色譜檢測還是薄層鑒定法干擾都極大，而本實驗則建立了壯骨舒筋丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，該法準(zhǔn)確性高，有著良好的重復(fù)性，可為該制劑的質(zhì)量控制提供可靠的參考依據(jù)。

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（收稿日期：2019-10-28）