類風濕關節(jié)炎大鼠滑膜細胞凋亡基因調(diào)控的實驗研究

周文旭 譚湘淑 佘君

摘要：目的 ?觀察甲氨蝶呤（MTX）對類風濕關節(jié)炎（RA）大鼠滑膜細胞凋亡及細胞凋亡調(diào)控基因的影響，探討MTX的作用機制。方法 ?選擇SPF級雌性健康SD大鼠40只，每只大鼠尾根部皮下多點注射Ⅱ型膠原蛋白0.2 mg，造模后l0 d將動物隨機分為假模型組、模型組，高（30 mg/kg）、中（3 mg/kg）、低（0.3 mg/kg）給藥組，各8只。給藥組每組按10 ml/kg MTX灌胃，假模型組、模型組給予等量生理鹽水灌胃。分離培養(yǎng)大鼠膝關節(jié)滑膜組織，采用流式細胞術檢測細胞凋亡率，WB技術檢測Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2蛋白表達情況。結果 ?高、中、低劑量給藥組抑制大鼠足腫脹的作用均優(yōu)于模型組（P<0.05），且呈劑量依賴性;各組均能不同程度誘導RA滑膜細胞凋亡，高劑量給藥組與模型組及假模型組比較，誘導RA滑膜細胞凋亡更明顯（P<0.05）;高劑量給藥組Caspase-3、Caspase-9、Bax蛋白表達量與模型組比較明顯上調(diào)，Bc1-2蛋白表達量下降（P<0.05）。結論 ?MTX誘導風濕性關節(jié)炎大鼠滑膜細胞凋亡，其機制可能與下調(diào)Bcl-2表達，上調(diào)Caspase-3、Caspase-9與Bax表達有關。

關鍵詞：關節(jié)炎，類風濕;甲氨蝶呤;細胞凋亡;滑膜;大鼠;Bcl-2;Caspase-3

中圖分類號：R593.22 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.05.021

文章編號：1006-1959（2020）05-0071-03

Abstract：Objective ?To observe the effects of methotrexate （MTX） on the apoptosis of synovial cells and apoptosis-regulating genes in rats with rheumatoid arthritis （RA）， and to explore the mechanism of action of MTX. Methods ?40 SPF female healthy SD rats were selected. Each rat was injected subcutaneously with 0.2mg of type Ⅱ collagen at the subcutaneous point.On the 10th d after modeling， the animals were randomly divided into a sham model group， a model group， a high （30 mg/kg）， a medium （3 mg/kg）， and a low （0.3 mg/kg） administration group.Each group consisted of 8 rats. Each dose group was administrated with 10 ml/kg MTX. The sham model group and model group were given the same amount of normal saline. The knee synovial tissue of rats was isolated and cultured， and the apoptosis rate was detected by flow cytometry， and the expression of Caspase-3， Caspase-9， Bax， Bcl-2 was detected by WB technology. Results ?The high， medium and low dose groups were better than the model group in inhibiting the swelling of the rats' feet，the difference was statistically significant （P<0.05） and was dose-dependent; each group could induce RA synovial cells to varying degrees Apoptosis， compared with the model group and the pseudo-model group， the high-dose administration group induced apoptosis of RA synovial cells more significantly （P<0.05）; the high-dose administration group expressed Caspase-3， Caspase-9， and Bax proteins with The model group was significantly up-regulated， and the expression of Bc1-2 protein decreased （P<0.05）. Conclusion ?MTX induces apoptosis of synovial cells in rheumatoid arthritis rats. The mechanism may be related to down-regulating Bcl-2 expression， up-regulating Caspase-3， Caspase-9 and Bax expression.

Key words：Arthritis， rheumatoid;Methotrexate;Apoptosis;Synovial membrane;Rat;Bcl-2;Caspase-3

類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種臨床常見的以侵犯關節(jié)滑膜、軟骨及骨為主的自身免疫病，其發(fā)病機制復雜，病變過程涉及多種細胞和細胞因子，位于關節(jié)滑膜內(nèi)層的成纖維樣滑膜細胞（fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS）在RA病變中異?；罨?，是介導關節(jié)局部炎癥的關鍵細胞之一。研究表明[1]，RA的關節(jié)軟骨和骨組織損害，與滑膜細胞的過度增生活化與凋亡不足密切相關。因此，抑制炎性滑膜組織增生及誘導滑膜組織中各種細胞凋亡是類風濕性關節(jié)炎治療的靶點[2，3]。甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）是傳統(tǒng)的改善病情抗風濕藥（DMARDs），近20多年來已成為RA臨床治療的基石用藥（Anchor drug）[4]，但其治療RA的作用機制尚不明確。本研究采用CIA模型，觀察MTX對大鼠整體療效及對滑膜組織中Bcl-2、Bax、caspase-3、9蛋白的表達影響，探討MTX治療RA的作用機制，以期為尋找新的抗RA藥物提供實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗動物 ?本實驗方案已通過西安交通大學醫(yī)學院動物實驗倫理審查委員會審查同意，審批許可號為XJMU2018032。SPF級雌性健康SD大鼠40只，體重50～100 g，體重（120±20 g），鼠齡4～5周，中國醫(yī)學科學院生物制品研究所提供。實驗開始前 ? ? 1周進行適應性飼養(yǎng)，保持室內(nèi)22℃，自由攝食。

1.2藥品與試劑 ?酸可溶性Ⅱ型膠原蛋白（CⅡ）與弗氏不完全佐劑為Sigma公司產(chǎn)品，MTX片（通化茂祥制藥有限公司，國藥準字H22022674，規(guī)格：2.5 mg×100片），Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2和GAPDH抗體及辣根過氧化物酶標記山羊抗大鼠IgG購自碧云天生物技術有限公司。Trizol購自Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo公司;熒光定量試劑購自北京康為世紀生物科技有限公司。引物由Invitrogen公司合成。藥物均研磨成粉末，用生理鹽水制成所需濃度。

1.3方法

1.3.1動物造模與分組 ?選取SPF級雌性健康SD大鼠40只，用0.l mmol/L醋酸溶解Ⅱ型膠原蛋白 ? ?（2 mg/ml，4℃，過夜），再與等量弗氏完全佐劑混合，于冰浴中充分乳化，除正常組外每只大鼠尾根部皮下多點注射膠原蛋白0.2 mg。造模后10 d將動物隨機分為假模型組、模型組，高、中、低給藥組，各8只。各組給藥（MTX）量如下：高劑量給藥組30 mg/kg，中劑量給藥組3 mg/kg，低劑量給藥組0.3 mg/kg，按10 ml/kg量灌胃，1次/d。假模型組、模型組給予等量生理鹽水灌胃，1.0 g/kg，1次/d。各組給藥頻次按照藥物的臨床用藥規(guī)格，連續(xù)用藥30 d。分別于致炎后第14、16、18、20、24、28天用毛細管放大測量法測右后足體積，求出腫脹增長百分率=[（給藥后值-給藥前值）/給藥前值]×100%。分別于造模前、造模后每天觀察大鼠體毛的色澤改變、神志及活動狀態(tài)、局部炎癥紅腫及全身遲發(fā)性變態(tài)反應等，并每周測1次體重。

1.3.2滑膜細胞分離培養(yǎng) ?各組大鼠末次給藥后24 h，無菌操作取大鼠膝關節(jié)滑膜組織，剪成1 mm3大小后加4 m1 0.4 mg/ml的Ⅱ型膠原酶（溶于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基），于5% CO2條件下孵育3 h，離心收集未貼壁的細胞，將細胞重懸于含有15%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置37℃、體積分數(shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗用第2～4代細胞。實驗時用含15%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液將滑膜細胞數(shù)調(diào)整至1×106個/ml細胞加入6孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔2 ml，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h。

1.3.3流式細胞術檢測細胞凋亡率 ?取對數(shù)生長期細胞，按細胞濃度為2×105/ml，每孔接種1 ml于6孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)24 h后，吸棄殘余培養(yǎng)基，根據(jù)動物造模結果選取大鼠足腫脹抑制作用最有效的藥物濃度組（3 mg/kg MTX），與未給藥的模型組共3個組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后吸棄上清液，PBS洗滌2次，胰酶消化收集細胞，重懸于離心管中，室溫下2000 r/min離心5 min。用Loading Buffer懸浮細胞，制備細胞懸液，向懸液中加入5 μl AnnexinV FITC和10 μl碘化丙啶（PI），混勻。室溫避光孵育5 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，重復3次。

1.3.4 Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2 蛋白表達測定 ?提取細胞總蛋白，然后取蛋白質(zhì)樣品50 μg加上樣緩沖液煮沸變性后，進行10% SDS PAGE;電轉(zhuǎn)移至PVDF膜;用含5%脫脂奶粉的TBS（pH 8.0）封閉2 h;分別加入適量Bc1-2、Bax 鼠單抗IgG （1∶400）、Caspase-3兔多抗IgG（1∶400），搖床上室溫反應2 h，洗膜3次，20 min/次;加辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG（1∶6000），室溫反應2 h;洗膜后作ECL化學發(fā)光，X光顯影。圖像經(jīng)掃描儀掃描后，用圖像分析軟件Band Scan 5.0進行吸收度積分值分析，計算目的蛋白與內(nèi)參照GAPDH蛋白表達量的吸收度積分值之比作為目的蛋白表達量的相對含量，實驗重復3次。

1.4統(tǒng)計學方法 ?本研究全部數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以（x±s）表示，進行單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1 MTX對Ⅱ型膠原蛋白誘導大鼠足腫脹的抑制作用 ?與模型組比較，MTX抑制大鼠足腫脹的作用呈劑量依賴性，模型的足腫脹度越高，MTX的抑制作用越強，藥物在致炎后28 d左右抑制作用達到峰值，見圖1。其中，以高劑量給藥組最為明顯（P<0.05），與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。

2.2 MTX對RA滑膜細胞凋亡的影響 ?流式細胞術檢測各組凋亡細胞結果見圖2，以右上和右下象限為凋亡細胞，統(tǒng)計各組凋亡細胞百分率。各組均能不同程度誘導RA滑膜細胞凋亡，以高劑量給藥組的作用最明顯。與模型組及假模型組比較，高劑量給藥組明顯誘導RA滑膜細胞凋亡（P<0.05）。

2.3對大鼠關節(jié)滑膜細胞中Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2 蛋白表達的影響 ?高劑量給藥組的Caspase-3、Caspase-9、Bax蛋白表達量與模型組比較明顯上調(diào)，Bc1-2蛋白表達量下降（P<0.01），見圖3。

3討論

RA是一種病變累及周圍關節(jié)的多系統(tǒng)性炎癥性的自身免疫病，主要表現(xiàn)為慢性、對稱性、多滑膜關節(jié)炎和關節(jié)外病變，若未早期診治，在發(fā)病兩年內(nèi)即可出現(xiàn)不可逆的骨關節(jié)破壞，造成關節(jié)畸形及功能喪失，最終殘疾[5]。研究表明[1]，RA的關節(jié)軟骨和骨組織損害與滑膜細胞過度增生活化及凋亡不足密切相關。因此，抑制自身免疫反應的細胞增殖及促進該免疫反應的細胞凋亡，阻止關節(jié)滑膜中炎性細胞的浸潤可減輕關節(jié)炎病變，是治療該病的重要途徑。

MTX是目前公認的有效治療RA的免疫抑制劑，其通過對腺苷誘導的免疫抑制作用、對炎性細胞增殖和凋亡的影響及對單核細胞和淋巴細胞因子及其抑制因子的作用等，降低滑膜組織金屬蛋白酶水平，發(fā)揮抗炎及免疫抑制作用[6，7]。許多RA患者單用MTX即可使炎癥緩解，疾病活動性得到明顯的控制，且單藥治療除了極高的衛(wèi)生經(jīng)濟學價值外，還有相當好的安全性。有研究對服用MTX的RA患者的長期隨訪研究發(fā)現(xiàn)患者的關節(jié)腫痛晨僵血沉及C-反應蛋白的指標在6個月左右開始顯著改善。本研究中CIA大鼠造模后關節(jié)出現(xiàn)明顯腫脹，以后肢最為明顯，在第28天達到了高峰。治療后，高劑量治療組肢體炎癥的腫脹程度與模型組相比均有改善。結果表明MTX的應用對局部關節(jié)炎癥均有明顯控制作用，這與文獻報道相一致[8]。

本研究中給藥組滑膜細胞的凋亡幅度明顯上升，與模型組差異顯著，模型組大鼠滑膜組織的Bcl-2表達增加，而Caspase-3、Caspase-9、Bax蛋白表達下降，提示滑膜細胞凋亡相關基因表達異常，導致細胞增生與凋亡的不平衡，引起滑膜細胞增生。而MTX可以使從大鼠滑膜細胞Bc1-2表達減少，Caspase-3、Caspase-9、Bax表達明顯升高。提示MTX可能通過調(diào)控Bcl-2和Bax等凋亡相關基因，并誘導RA滑膜細胞Caspase-3、9活化，促進滑膜細胞的凋亡，從而抑制關節(jié)滑膜細胞的增殖，減輕滑膜增厚而發(fā)揮治療作用。

綜上所述，通過MTX對大鼠類風濕性關節(jié)炎模型滑膜細胞凋亡基因調(diào)控的實驗研究，初步證明了MTX對RA滑膜細胞較強的誘導凋亡作用。MTX在誘導RA滑膜細胞凋亡的作用機制較為復雜，涉及體液、內(nèi)分泌、免疫網(wǎng)絡中的多種調(diào)節(jié)因子、多種轉(zhuǎn)錄、代謝調(diào)控因素，故還需從其他相關基因或蛋白表達方面做進一步研究。

參考文獻：

[1]Seca S，Kirch S，Cabrita AS，et al.Evaluation of the effect of acupuncture on hand pain，functional deficits and health-related quality of life in patients with rheumatoid arthritis-A study protocol for a multicenter，double-blind，randomized clinical trial[J].J Integr Med，2016，（3）：219-227.

[2]Derk CT.Rheumatoid arthritis： an update[J].Del Med J，2015，77（2）：59-63.

[3]Kawai S.Current drug therapy for rheumatoid arthritis[J].J Orthop Sci，2013，8（2）：259-263.

[4]Isomaki P，Junttila I，Vidqvist KL，et al.The activity of JAK-STAT pathways in rheumatoid arthritis： constitutive activation of STAT3 correlates with interleukin 6 levels[J].Rheumatology （Oxford），2015，54（6）：1103-1113.

[5]李娟.艾拉莫德與甲氨蝶呤配伍治療老年類風濕關節(jié)炎84例[J].陜西醫(yī)學雜志，2016，45（1）：120-121.

[6]Kakinohana M，Kida K，Minamishima S，et al.Delayed paraplegia after spinal cord ischemic injury requires caspase-3 activation in mice[J].Stroke，2011，42（8）：2302-2307.

[7]Yilmaz ER，Kertmen H，Dolgun H，et al.Effects of darbepoetin-α in spinal cord ischemia-reperfusion injury in the rabbit[J].Acta Neurochir （Wien），2012，154（6）：1037-1044.

[8]霍愛鑫.腫瘤壞死因子拮抗劑聯(lián)合甲氨蝶呤治療活動期中重度類風濕關節(jié)炎56例對比觀察[J].陜西醫(yī)學雜志，2015，44（9）：1209-1211.

收稿日期：2019-11-07;修回日期：2020-03-15

編輯/肖婷婷