新疆一枝蒿藥材雙波長HPLC指紋圖譜的研究

張逸凡，鮑鳳霞，夏振江，尚 靖**

(1中國藥科大學中藥學院，南京 211198；2南京大學環(huán)境學院,污染控制與資源化研究國家重點實驗室，南京 210023)

新疆一枝蒿是菊科蒿屬植物巖蒿ArtemisiarupestrisL.的全草，是新疆特有的一到多年生藥用草本植物，主要分布于新疆天山、阿爾泰山等地區(qū)，具有清熱解毒、抗過敏[1]、抗病毒[2]、以及抗腫瘤多方面藥理作用，用于治療感冒發(fā)燒、腹胃脹痛、肝炎、蕁麻疹、過敏性疾病等[3]，是新疆維吾爾族醫(yī)學傳統(tǒng)用藥。我國清代趙學敏《本草綱目拾遺》中早有記載[4]，并收載于《藥品標準》維吾爾藥分冊和《維吾爾藥志(上冊)》[5]，而目前新疆一枝蒿在中國藥典中并無收錄。在衛(wèi)生部藥品標準中藥材第一冊(1992)中僅規(guī)定其來源、性狀、鑒別等，存在質(zhì)量控制標準缺失的問題。

新疆一枝蒿化學成分的研究始于20世紀80年代，其生物活性成分極其復雜，且用不同方法提取得到的主成分和含量均有較大的差異，目前已報道的從新疆一枝蒿中提取的化學成分主要包括萜類、黃酮及酮酸類、多糖、揮發(fā)油、氨基酸等[6-7]。一枝蒿酮酸是從新疆一枝蒿中分離得到的一種結(jié)構(gòu)獨特的倍半萜,是其特征化合物之一,在新疆一枝蒿中占約1%的含量[8]。但由于地理條件、氣候和生態(tài)環(huán)境的不同，新疆一枝蒿中有效成分存在差異，僅用性狀、理化鑒別以及個別有效成分含量的測定并不能準確評價藥材質(zhì)量[9]。

賀飛等[10]在不同波長下對新疆一枝蒿的指紋圖譜進行了研究比較，發(fā)現(xiàn)在245 nm波長條件下其分離效果較好。但由于其有效成分等最大吸收波長不一致，建立單一波長下的HPLC指紋圖譜難以對新疆一枝蒿成分進行整體表達和全面評價。

本研究收集了9批新疆一枝蒿藥材，同時運用HPLC-DAD技術(shù)建立了2種波長條件下的HPLC指紋圖譜，完善了新疆一枝蒿藥材的鑒別和質(zhì)量控制，可為建立更加規(guī)范的藥材質(zhì)量標準提供參考。

1 材 料

1.1 對照品與試劑

對照品槲皮素(批號：100081-201610，含量以99.1%計)、綠原酸(批號：110753-201716，含量以99.3%計)、木犀草素(批號：111520-201605，含量以99.6%計)、芹菜素(批號：111901-201603，含量以99.2%計)、紫花牡荊素(批號：111554-201705，含量以98.3%計)均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為市售分析純。

1.2 藥 材

新疆一枝蒿藥材購自新疆，由新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所何江副研究員鑒定為新疆一枝蒿ArtemisiarupestrisL.的干燥全草，共9批，分別編號為樣品S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9。產(chǎn)地和采購時間見表1。

Table1 Sources ofArtemisiarupetrisL.

1.3 儀 器

1260 Infinity高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；BSA1245電子天平(北京賽多利斯有限公司)；TU-1810紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；KH-500DB超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 供試品溶液的制備 取新疆一枝蒿藥材于50 ℃下干燥4 h，粉碎、過篩60目。取粉末25 g，精密稱量。加入甲醇100 mL，于70 ℃下沸騰回流提取1 h。過濾，殘渣用少量甲醇洗滌2次。置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上揮干溶劑，加入甲醇溶液并定容至50 mL。搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液即為新疆一枝蒿檢測用供試品溶液。

2.1.2 對照品溶液的制備 分別取槲皮素、綠原酸、木犀草素、芹菜素、紫花牡荊素對照品適量，精密稱量，加甲醇溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度分別為0.89，0.55，0.60，0.62，0.44 mg/mL的對照品溶液，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液備用。

2.2 色譜條件

Zorbax SB-C18色譜柱(4.6 mm× 250 mm,5 μm)；甲醇流動相A，0.2%甲酸水流動相B，線性梯度洗脫(A∶B)，0 min(30∶70)～40 min(70∶30)～55 min(80∶20)～65 min(100∶0)；流速1.0 mL/min；柱溫：32 ℃；進樣量：20 μL；檢測波長：245和325 nm。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度 取新疆一枝蒿藥材，按“2.1.1”項下方法配制試品溶液，按“2.2”項下色譜條件連續(xù)進樣5次，記錄色譜圖。在245 nm處，識別各共有峰，并計算與參照峰(槲皮素)的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果RSD分別為0.02%～0.10%和0.10%～1.53%。在325 nm處，識別各共有峰，并計算與參照峰(綠原酸)的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果RSD分別為0.03%～0.07%和3.00%～4.05%。結(jié)果表明本方法具有較好的精密度。

2.3.2 重復性 取同一批次藥材樣品，按“2.1.1”項下方法配制試品溶液，平行制備5份，按“2.2”項下色譜條件連續(xù)進樣，記錄各共有色譜峰保留時間和積分面積，以及與相應對照色譜峰的相對保留時間和相對峰面積為指標計算RSD。在245 nm處，各共有峰與參照峰(槲皮素)的相對保留時間RSD的范圍是0.09%～0.50%，相對峰面積RSD的范圍是0.43%～2.46%。在325 nm處，各共有峰與參照峰(綠原酸)的相對保留時間RSD的范圍是0.10%～0.43%，相對峰面積RSD的范圍是1.43%～2.71%。結(jié)果表明，RSD均小于3.00%，重復性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性 取同一批次樣品，按“2.1.1”項下方法配制試品溶液，分別在0，2，4，8，16，24 h按“2.2”項下色譜條件連續(xù)進樣，記錄各共有色譜峰保留時間和積分面積，以色譜峰相對保留時間和相對峰面積為指標計算RSD。在245 nm處，各共有峰與參照峰(槲皮素)的相對保留時間RSD的范圍是0.01%～0.4%，相對峰面積RSD的范圍是1%～3%。在325 nm處，各共有峰與參照峰(綠原酸)的相對保留時間RSD的范圍是0.09%～0.90%，相對峰面積RSD的范圍是1.95%～2.87%。結(jié)果表明，制備樣品穩(wěn)定性較好，常溫下24 h內(nèi)能保持較好的穩(wěn)定性。

2.4 新疆一枝蒿雙波長指紋圖譜建立

2.4.1 指紋圖譜的建立及相似度評價 取9批次新疆一枝蒿藥材按“2.1.1”項下方法配制試品溶液，按“2.2”項下色譜條件測定，得到9批新疆一枝蒿藥材高效液相色譜圖。將9批次新疆一枝蒿藥材的高效液相色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2.0版》(國家藥典委員會)，以S1為參照指紋圖譜，經(jīng)多點矯正，采用中位數(shù)的方法，得到新疆一枝蒿色譜對照指紋圖譜(圖1)，以對照圖譜為參照，在峰位匹配的基礎(chǔ)上，采用夾角余弦法對待測樣品圖譜之間以及與對照指紋圖譜間進行相似度計算，9批新疆一枝蒿樣品指紋圖譜的相似度大于0.9，相似性良好。

Figure1 HPLC fingerprints of 9 batches ofArtemisiarupestrisL.at (A) 245 and (B) 325 nm

2.4.2 特征指紋峰的標定及確認 以對照圖譜為參照，按照峰面積大小，在245 nm處取前7列峰，在325 nm處取前8列峰標定為共有峰。計算各共有指紋峰的相對保留時間和相對峰面積。在245 nm時，相對保留時間RSD的范圍是0.1%～1.3%，相對峰面積RSD的范圍是1.9%～3.4%。在325 nm時，相對保留時間RSD的范圍是0.6%～1.6%，相對峰面積RSD的范圍是2.5%～3.8%。各共有峰穩(wěn)定，具有指紋圖譜的特征性。取對照品按將“2.1.2”項下方法配制對照品溶液，按“2.2”項下色譜條件進行檢測，得到對照品高效液相色譜圖(圖2)，與對照圖譜相比對，指認出槲皮素、綠原酸、木犀草素、芹菜素、蔓荊子素5個峰。

3 討 論

3.1 檢測波長的選擇

本研究對新疆一枝蒿在紫外可見范圍下進行全波長掃描并進行考察，藥材樣品在325 nm處有最大吸收，并根據(jù)此前文獻報道，新疆一枝蒿指紋圖譜常用波長為245 nm，因此本實驗最終確定波長為245和325 nm，在這兩個波長下對新疆一枝蒿進行綜合的質(zhì)量評價。

Figure2 Comparison fingerprint ofArtemisiarupestrisL at (A) 245 nm and (B) 325 nm

2：Quercetin；8：Chlorogenic acid；11：Luteolin；12：Apigenin；13：Casticin

3.2 流動相的選擇

本實驗在245和325 nm波長下，分別對3種流動相系統(tǒng)進行考察，結(jié)果見圖3，甲醇-0.2%甲酸水的分離效果最好，基線平穩(wěn)，出峰較多，故選用該流動相為洗脫條件。

3.3 色譜柱選擇

不同品牌規(guī)格的色譜柱因柱料填充、鍵合條件等因素會在性能上存在不同，導致指紋圖譜存在差異，本實驗中，考察Agilent C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)和Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)兩個不同廠家色譜柱，比較指紋圖譜的差異。采用同一供試品溶液，依次使用不同的色譜柱，進樣，記錄保留時間和峰面積，在245和325 nm波長條件下，Agilent C18的柱效均大于Diamonsil C18，并結(jié)合目標成分峰的拖尾因子等多因素進行評價，最終選定Agilent C18色譜柱。

4 結(jié) 論

中藥指紋圖譜是目前符合中藥特色的評價中藥真實性、穩(wěn)定性和一致性的質(zhì)量控制手段之一。本實驗通過在245和325 nm雙波長條件下對9批藥材進行指紋圖譜的研究，彌補了單一波長下對質(zhì)量控制不全面的弊端。在色譜條件的優(yōu)化中，對流動相、色譜柱等洗脫條件進行不同的考察，最終確定穩(wěn)定的系統(tǒng)條件，為指紋圖譜的建立奠定基礎(chǔ)。新疆一枝蒿內(nèi)主要藥效成分以黃酮及酮酸類化合物為主，在對照品選擇上，本實驗分別在245和325 nm下以槲皮素和綠原酸為對照，廉價且易于獲得，符合一測多評的選擇原則。以相似度評價系統(tǒng)對9批藥材的指紋圖譜進行計算模擬，得到新疆一枝蒿對照圖譜并進行相似度評價，進一步對所建立的指紋圖譜進行特征峰的標定，分別在245和325 nm得到7個和8個共有峰，并確認了槲皮素、綠原酸[11]、木犀草素、芹菜素、紫花牡荊素5個峰，且共有峰穩(wěn)定，所建立指紋圖譜能夠作為新疆一枝蒿質(zhì)量控制的評價標準。

Figure3 HPLC ofArtemisiarupestrisL.with different mobile phase at (A) 245 nm and (B) 325 nm

1：Methanol-water；2：Methanol-0.2% formic acid-water；3：Acetonitrile-water