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    金黃色葡萄球菌核酸酶對2,4,6-三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的保護(hù)作用

    2020-05-11 07:43:54張婷婷梅銀柳董萬法王鏡勛
    中國藥科大學(xué)學(xué)報 2020年2期
    關(guān)鍵詞:克羅恩結(jié)腸炎乳酸菌

    張婷婷,梅銀柳,董萬法,王鏡勛,金 亮,吳 潔

    (中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院微基因藥學(xué)實驗室,南京 210009)

    炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)是一種慢性腸道疾病,包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulceration colitic,UC)和克羅恩病(Crohn′s disease,CD),在西方國家較為常見,北美和歐洲分別有超過150萬和200萬人患病,近年來,隨著生活方式的改變,亞洲國家發(fā)病率逐年提高[1]。IBD發(fā)病機(jī)制不明,一般認(rèn)為與環(huán)境因素、遺傳因素、腸道微環(huán)境和免疫因素等相關(guān)。目前IBD治療手段主要依賴手術(shù)切除和病癥緩解,但存在不良反應(yīng)強(qiáng)、易復(fù)發(fā)等缺點,因此尋找新的治療靶點是十分必要。

    中性粒細(xì)胞是機(jī)體抵抗病原體入侵的第一道屏障,在固有免疫中發(fā)揮重要作用。2004年,研究人員發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞可通過一種新型方式達(dá)到殺滅病原體的作用——中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps,NETs),它是活化的中性粒細(xì)胞釋放核內(nèi)包括染色質(zhì)DNA在內(nèi)的核酸,并包裹自身胞質(zhì)顆粒蛋白酶所形成的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[2]。研究發(fā)現(xiàn),NETs在殺傷病原菌的同時也會對機(jī)體黏膜組織造成損傷,NETs的過度強(qiáng)盛或者不及時清除與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等多種自身性免疫疾病密切相關(guān)[3-4]。蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)潰瘍性結(jié)腸炎患者結(jié)腸組織中有多種NETs成分蛋白[5],另有研究發(fā)現(xiàn)對中性粒細(xì)胞蛋白如蛋白酶3(PR3)、髓過氧化物酶(MPO)、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(NE)和組蛋白的抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體(ANCA)可成為IBD診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物[6],這些蛋白會在NETs形成過程中釋放并成為ANCA的來源[7-8],從而增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng),造成組織損傷。由此可見,NETs形成參與IBD疾病發(fā)展。

    DNA是NETs主要的結(jié)構(gòu)成分,NETs抗原性也需DNA維持結(jié)構(gòu)完整性[9],因此破環(huán)NETs的DNA骨架可以阻止其導(dǎo)致的異常自身免疫。國內(nèi)外也有多項研究證明,DNase可用于改善和治療因NETs增多而引發(fā)的疾病[10]。金黃色葡萄球菌分泌的葡萄球菌核酸酶(SNase)是一種具有磷酸二酯酶活性的單鏈蛋白,能迅速切割DNA和RNA長鏈形成的3′-核苷酸產(chǎn)物,且pH 4.8~9.2之間具有很好的酶活等優(yōu)點[11]。

    乳酸菌(lactis acid bacteria,LAB)是公認(rèn)的食品級安全菌,試驗表明,乳酸乳球菌(Lactococcuslactis,L.lactis)可以逃離胃酸的過度侵襲(存活率90%~98%),并成功定植腸道,以乳酸乳球菌表達(dá)載體已逐漸成為口服疫苗的熱點[12]。本課題組前期構(gòu)建制備的重組乳酸菌L.lactispCYT:SNase可以穩(wěn)定表達(dá)SNase,并用于遞送基于自身抗原設(shè)計的重組蛋白疫苗[13]。前期的實驗結(jié)果表明:灌胃給予表達(dá)SNase的重組乳酸菌一方面可以穩(wěn)定定植于NOD小鼠腸道中并表達(dá)SNase蛋白[14]。在本次研究中將已表達(dá)SNase的重組乳酸菌灌胃給TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型小鼠,以探究其基于NETs降解而對小鼠腸道炎癥的保護(hù)機(jī)制。

    1 材 料

    1.1 藥品與試劑

    5% TNBS水溶液(美國Sigma公司);乳鏈菌肽(上海源葉生物科技有限公司);胰蛋白胨、酵母提取物(德國Oxoid公司);M17肉湯粉(青島海博生物技術(shù)有限公司);兔Ly6G抗體(美國Santa Cruz公司),兔citH3抗體(英國Abcam公司);隱血試劑盒(上海雷根生物科技有限公司);LEGENDplexTM多因子檢測試劑盒(美國Biolegend公司);TMB顯色液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(武漢艾瑞科生物科技有限公司);SYBR Green Premix試劑盒(上海天根生物科技有限公司),其他試劑均為市售化學(xué)或分析純。

    1.2 儀 器

    Spark多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司);離心機(jī)(湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司);7300 Plus Real-Time PCR system、FACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司);數(shù)理切片掃描儀(日本Hamamatsu公司);超聲破碎儀、LGJ-12冷凍干燥機(jī)、ZXZ-2型旋片式真空泵(臺州市博雯真空設(shè)備有限公司);研磨儀(北京赫得科技有限公司);MylabTMShaker SLST3(韓國Seoulin公司)。

    1.3 菌 種

    L.lactisNZ9000和L.lactispCYT:SNase均為本實驗室保存。

    1.4 動 物

    清潔級BALB/c小鼠,雌性,體質(zhì)量20~22 g,購自上海西普兒-必凱實驗動物有限公司,合格證號:SCXK(滬)2018-0006。所有動物實驗均符合動物倫理操作。

    2 方 法

    2.1 給藥乳酸菌L.lactis pCYT:SNase的制備

    給藥乳酸菌L.lactispCYT:SNase的制備方法參見文獻(xiàn)[14],即從保存的L.lactispCYT:SNase甘油管按照體積分?jǐn)?shù)1%加到GM17培養(yǎng)基中30 ℃恒溫靜置過夜培養(yǎng)。次日按體積分?jǐn)?shù)4%的接種量將活化的菌液轉(zhuǎn)接到GM17大瓶培養(yǎng)基中培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)液A600達(dá)到0.5左右時加乳鏈菌肽(nisin)誘導(dǎo)培養(yǎng),至A600達(dá)到1.2時停止培養(yǎng)。收集菌體,用無菌水對沉淀進(jìn)行重懸,調(diào)整菌體濃度至2×1010CFU/mL。L.lactisNZ9000(以下簡稱NZ9000)同法培養(yǎng)和制備,但不加誘導(dǎo)劑。

    2.2 TNBS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎模型的建立及給藥

    小鼠清潔級環(huán)境下適應(yīng)飼養(yǎng)1周,實驗前按體質(zhì)量隨機(jī)分為4組:健康對照組(Control)、TNBS模型組(TNBS)、TNBS+NZ9000組(LL)、TNBS+L.lactispCYT:SNase組(LL-SNase);每組12只。造模前小鼠禁食不禁水24 h,4%水合氯醛按照10 μL/g 的劑量腹腔注射麻醉小鼠,用3.5F橡膠軟管甘油浸潤后從肛門緩慢插入4 cm處,按照100 mg/kg的劑量灌入5% TNBS水溶液加等體積乙醇的混合液,靜置30 s拔出,倒置5 min放回籠中,待其自然清醒。每天觀測小鼠體質(zhì)量、糞便性狀及隱血狀況,根據(jù)表1的疾病活動指數(shù)(DAI)評分標(biāo)準(zhǔn)計算出每組小鼠的平均DAI分?jǐn)?shù)[15]。給藥流程見圖1,具體為造模前3天提前乳酸菌灌胃給藥,每天1次,劑量均為每只4×109CFU。于第6天處死小鼠,分離結(jié)腸和脾臟,后續(xù)進(jìn)行組織學(xué)分析。

    Figure1 Schematic representation ofL.lactisadministration and induction of colitis in mice by 2.5%2,4,6-trinitro-benzene sulfonic acid(TNBS)

    Table1 Disease activity index (DAI) score after TNBS induction in mice

    ScoreBody weight loss/%Stool consistencyBleeding0<0NormalNegative11-5--26-10Loose stoolHemoccult positive311-15--4>15DiarrheaGross bleeding

    2.3 結(jié)腸組織HE分析

    分別取各組結(jié)腸于4%多聚甲醛中固定,經(jīng)石蠟包埋,制成5 μm切片,HE染色后,在顯微鏡下觀察結(jié)腸黏膜肌層結(jié)構(gòu)完整性、杯狀細(xì)胞數(shù)量、隱窩結(jié)構(gòu)及炎性細(xì)胞浸潤等情況,根據(jù)影響的程度對各組小鼠結(jié)腸組織進(jìn)行評分[16]:無影響(0)、輕(1)、重(2)。每組最終評分為各項指標(biāo)的平均數(shù)。

    2.4 結(jié)腸組織MPO酶活測定

    分別取各組結(jié)腸組織20 mg左右,加入生理鹽水研磨成10%的組織勻漿液,4 ℃,12 000 r/min離心15 min收集上清液,取10%結(jié)腸勻漿上清 10 μL 和TMB溶液100 μL,37 ℃反應(yīng)5 min,加入2 mol/L硫酸50 μL終止反應(yīng),于450 nm處測定吸收度。MPO相對酶活(U/g組織濕重)=(測定吸收度-對照吸收度)/取樣量(g)。

    2.5 結(jié)腸組織QPCR檢測

    稱取結(jié)腸組織50 mg,加入Trizol 500 μL,提取總RNA,定量后取2 μg RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,用SYBR Green進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)條件如下:95 ℃ 30 s循環(huán)1次,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s循環(huán)40次。GAPDH作為每次擴(kuò)增內(nèi)參,相對表達(dá)水平用2-ΔΔCt表示,引物序列見表2。

    Table2 Sequences of real time PCR primers

    GenePrimer sequences (5′→3′)GAPDHForward:CTCTCTGCTCCTCCTGTTCGACAGReverse:GTGGAATCTATTGGAACATGTTNF-ɑForward:CCTGTAGCCCACGTCGTAGReverse:GGGAGTAGACAAGGTACAACCCIL-1βForward:GAAATGCCACCTTTTGACAGTGReverse:TGGATGCTCTCATCAGGACAGIL-6Forward:CTGCAAGAGACTTCCATCCAGReverse:TCAGTGGTATAGACAGGTGTTGG

    2.6 血清流式多細(xì)胞因子檢測

    采用LEGENDplexTM多因子檢測試劑盒,流式檢測血清與炎癥相關(guān)的炎性細(xì)胞因子。簡要流程為:標(biāo)準(zhǔn)品和血清稀釋樣本分別與磁珠室溫孵育2 h,加抗體后繼續(xù)室溫孵育1 h,加PE熒光標(biāo)記的鏈霉親和素室溫孵育30 min,離心加緩沖液混懸上流式細(xì)胞儀檢測,用Legendplex軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

    2.7 結(jié)腸組織免疫組化分析

    各組石蠟包埋的結(jié)腸組織切成5 μm的切片,進(jìn)行Ly6G和citH3抗體染色,用數(shù)字病理切片掃描儀進(jìn)行掃描,Image Pro Plus軟件分析陽性信號。

    2.8 統(tǒng)計分析

    3 結(jié) 果

    3.1 重組乳酸菌SNase表達(dá)的鑒定

    如圖2所示,乳鏈菌肽誘導(dǎo)的工程菌L.lactispCYT:SNase能穩(wěn)定表達(dá)SNase。在本課題組前期研究中,重組乳酸菌誘導(dǎo)表達(dá)的SNase可在體外有效降解中性粒細(xì)胞刺激形成的NETs,并能通過灌胃乳酸菌成功被遞送至腸道發(fā)揮其降解NETs的作用[14]。

    3.2 SNase緩解TNBS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎疾病指征

    用TNBS建立小鼠結(jié)腸炎模型,提前3 d乳酸菌給藥,觀測小鼠生存情況,體質(zhì)量變化,DAI評分。在實驗第6天處死小鼠,分離結(jié)腸和脾臟,測量結(jié)腸長度和稱量脾臟重量。TNBS造模后小鼠生存3只,經(jīng)過LL處理小鼠生存4只,LL-SNase組小鼠生存3只。結(jié)果顯示,相比較于健康對照組,TNBS誘導(dǎo)小鼠體質(zhì)量下降(圖3-A)更明顯,DAI評分(圖3-B)顯著提高,結(jié)腸長度明顯縮短(圖3-C,圖3-D),脾臟質(zhì)量也明顯增加(圖3-E)。經(jīng)LL-SNase給藥處理后,體質(zhì)量下降有所緩解,DAI評分也有下降,結(jié)腸長度明顯變長。從宏觀指標(biāo)上看,SNase可以緩解TNBS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的發(fā)展。

    為進(jìn)一步觀察SNase對結(jié)腸組織組織結(jié)構(gòu)和炎性細(xì)胞浸潤的影響,對結(jié)腸組織進(jìn)行HE染色分析。由圖4-A可以看出,相比較于健康對照組,TNBS組結(jié)腸組織黏膜肌層結(jié)構(gòu)被破環(huán),腺上皮細(xì)胞大量較少,結(jié)構(gòu)紊亂,而經(jīng)LL-SNase處理后,黏膜肌層結(jié)構(gòu)較為完整,腺上皮細(xì)胞增多,排布整齊。根據(jù)黏膜肌層結(jié)構(gòu)破環(huán)程度,杯狀細(xì)胞數(shù)量,隱窩結(jié)構(gòu)及中性粒細(xì)胞,淋巴細(xì)胞浸潤情況對各組結(jié)腸HE切片進(jìn)行評分(圖4-B),LL-SNase組中TNBS小鼠的結(jié)腸組織損傷得到明顯改善。結(jié)果表明,SNase能夠很好地緩解TNBS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的發(fā)展。

    3.2 SNase緩解小鼠結(jié)腸組織炎性水平

    為了探究乳酸菌遞呈的SNase對結(jié)腸組織炎性水平的影響,本研究測定了小鼠結(jié)腸組織MPO酶活。如圖5-A所示,相比較于健康對照組,TNBS組MPO酶活顯著提高,而LL-SNase處理明顯下調(diào) TNBS 誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸組織MPO酶活性,提示SNase能夠改善TNBS小鼠結(jié)腸組織中性粒細(xì)胞浸潤狀況。本研究進(jìn)一步對小鼠結(jié)腸組織炎性細(xì)胞因子TNF-ɑ、IL-1β和IL-6進(jìn)行mRNA水平分析。如圖5B-5D顯示,相比較于健康對照組,TNBS組IL-1b mRNA水平明顯提高,TNF-ɑ和IL-6也有上升趨勢,但經(jīng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計無顯著性差異。經(jīng)LL-SNase處理后,IL-1b mRNA水平得到顯著抑制,TNF-ɑ和IL-6均有不同程度的下調(diào)??偟膩碚f,SNase能從mRNA水平上改善TNBS結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織的炎性水平。

    Figure2 12% SDS-PAGE analysis of SNase induced by nisin inL.lactispCYT:SNase

    Lane 1:Protein marker;Lane 2:Supernant of the lysate ofL.lactispCYT:SNase;Lane 3:Supernant of the lysate ofL.lactispCYT:SNase induced by nisin (50 ng/mL)

    A:Body weight changes;B:Disease activity index (DAI) scores;C:Images of colon;D:Relative colon lengths;E:Relative spleen weights LL:TNBS+NZ9000;LL-SNase:TNBS+L.lactispCYT:SNase

    *P<0.05,**P<0.01vsTNBS group

    A:Histological micro-photographs of hematoxylin/eosin-stained sections of distal colon (×200);B:Histological scores for histological change

    *P<0.05,***P<0.001vsTNBS group

    3.3 SNase改善結(jié)腸炎小鼠體內(nèi)炎性因子水平

    本研究對各組血清中與炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子水平進(jìn)行含量測定。如圖6所示,TNBS誘導(dǎo)的小鼠血清促炎細(xì)胞因子IL-6水平顯著提高,抑炎細(xì)胞因子IL-10顯著下降,TNF-ɑ、IL-1β、IL-17A和IFN-γ水平均有上升趨勢,但數(shù)據(jù)分析無顯著性差異。而LL-SNase處理能顯著上調(diào)TNBS結(jié)腸炎小鼠的抑炎細(xì)胞因子IL-10水平,不同程度下調(diào)促炎細(xì)胞因子水平。由此可以看出,SNase能改善小鼠體內(nèi)的炎癥水平。

    A:Activity of myeloperaxidase (MPO) enzyme in colon;B:Relative mRNA expression level of TNF-ɑ;C:Relative mRNA expression level of IL-1β;D:Relative mRNA expression level of IL-6

    *P<0.05,**P<0.01vsTNBS group

    A:TNF-ɑ;B:IL-1β;C:IL-6;D:IL-17A;E:IFN-γ;F:IL-10

    *P<0.05vsTNBS group

    3.4 SNase能夠減少TNBS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸組織中NETs水平標(biāo)志物含量

    為了探究SNase靶向腸道是否可以抑制腸道NETs形成,本研究對各組結(jié)腸組織NETs水平標(biāo)志物表達(dá)進(jìn)行評估,通過免疫組化染色檢測結(jié)腸組織中NETs水平標(biāo)志物citH3和中性粒細(xì)胞標(biāo)記分子Ly6G表達(dá)。如圖7所示,TNBS組中Ly6G和citH3 含量明顯高于健康對照組,提示TNBS組小鼠體內(nèi)存在更顯著的NETs水平,而LL-SNase處理均能夠顯著下調(diào)TNBS小鼠結(jié)腸組織Ly6G和 citH3 含量。此外,MPO也是NETs水平的一個重要標(biāo)志物,LL-SNase給藥處理也大大降低了其在TNBS小鼠結(jié)腸組織MPO酶的活性(圖5-A)。結(jié)果表明,SNase經(jīng)口給藥可以減少TNBS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸組織中NETs水平標(biāo)志物含量,抑制腸道NETs形成。

    A:Representative immunohistochemical images showing Ly6G-positive cell and citH3-positive cell in colon section (×200);B:Percentages of Ly6G-positive cell and citH3-positive cell in colon section

    **P<0.01vsTNBS group

    4 討 論

    炎癥性腸病是一種病因不明的慢性腸道炎癥疾病,包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病。這兩種疾病類型臨床診斷、發(fā)病部位及致病機(jī)制有所不同??肆_恩病在整個胃腸道均可發(fā)病,多見于結(jié)腸部位,伴有腸道狹窄癥狀,主要是由Th1細(xì)胞引起的免疫反應(yīng)[17]。TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎與臨床上克羅恩病的病癥表現(xiàn)相似,可用來研究克羅恩病的發(fā)病機(jī)制[18]。越來越多的證據(jù)表明NETs形成參與炎癥性腸病的致病形成,盡管部分研究表明NETs成分在潰瘍性結(jié)腸炎患者中檢測要比克羅恩病患者更為顯著。不可否認(rèn)的是,確有多項研究表明NETs形成與克羅恩病相關(guān)。在克羅恩病患者糞便、血清和活檢組織中確實可檢測到NETs主要成分,包括citH3,NE,MPO等[19-22]。Cl-amidine是PAD4酶抑制劑,能抑制NETs的前期形成,Chumanevich等[23]發(fā)現(xiàn)腹腔注射Cl-amidine能夠緩解葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎。由此看出,干預(yù)NETs降解是IBD治療的一個方向。

    為探究SNase降解NETs對小鼠結(jié)腸炎的影響,同時為了讓SNase直接靶向到腸道而發(fā)揮作用,本研究選擇重組乳酸菌作為遞呈載體。結(jié)果發(fā)現(xiàn),乳酸菌遞呈的SNase能緩解TNBS造模小鼠體質(zhì)量下降,降低DAI評分,增加結(jié)腸長度以及減輕結(jié)腸組織病理損傷。MPO酶作為中性粒細(xì)胞特異性表達(dá)的酶,其活力水平可以反應(yīng)組織中性粒細(xì)胞浸潤情況。TNF-ɑ、IL-1β、IL-6等炎性細(xì)胞因子上調(diào)是結(jié)腸炎炎癥的顯著表現(xiàn)。通過表達(dá)SNase的重組乳酸菌LL-SNase灌胃給藥,結(jié)果表明SNase能下調(diào)結(jié)腸組織MPO酶活水平以及TNF-ɑ、IL-1β、IL-6炎性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平。進(jìn)一步利用免疫組化檢測結(jié)腸組織NETs水平標(biāo)志物citH3水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),TNBS模型組citH3含量明顯上調(diào),提示結(jié)腸炎中NETs形成活躍,經(jīng)LL-SNase處理后,中性粒細(xì)胞浸潤以及citH3含量明顯下調(diào),而乳酸菌NZ9000也能改善NETs相關(guān)指標(biāo),可能因為乳酸菌本身作為益生菌,可以調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)從而抑制NETs形成。本研究結(jié)果初步表明,SNase能通過抑制NETs形成從而緩解小鼠結(jié)腸炎癥。

    雖然本項研究存在一些不足,例如:TNBS造模病死率偏高,導(dǎo)致樣本較少,在統(tǒng)計學(xué)分析時部分指標(biāo)只出現(xiàn)差異趨勢,未能得到理想的顯著性差異結(jié)果。但是,實驗結(jié)果依然可以初步顯示NETs參與克羅恩病小鼠的疾病發(fā)展,本研究通過SNase處理,靶向NETs降解可以緩解TNBS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎,保護(hù)結(jié)腸組織結(jié)構(gòu),緩解炎性浸潤下調(diào)促炎細(xì)胞因子和上調(diào)抑炎細(xì)胞因子等。后續(xù)本課題組將增加實驗動物數(shù)量,繼續(xù)深入探究SNase對TNBS造模小鼠結(jié)腸炎癥影響的機(jī)制。總的來說,SNase靶向NETs降解是克羅恩病的一個治療方向,其具體機(jī)制還需進(jìn)一步探索。

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