C端斷裂型內(nèi)含肽Npu DnaE介導(dǎo)的抗體片段及免疫毒素在大腸埃希菌中的可溶性表達與純化

曹 津，陳 浩，張 靜，朱建偉，陳俊升

(上海交通大學(xué)藥學(xué)院細(xì)胞工程及抗體藥物教育部工程研究中心,上海 200240)

長期以來，大腸埃希菌一直是外源蛋白的首選表達系統(tǒng)，但由于重組蛋白在大腸埃希菌中合成速度過快導(dǎo)致沒有足夠的時間進行折疊、含硫氨基酸過多不易正確配對、胞內(nèi)pH接近蛋白等電點、缺乏真核生物中翻譯后修飾所需的酶類和輔助因子等原因，重組蛋白在大腸埃希菌中非常容易形成包涵體，導(dǎo)致其應(yīng)用受到了限制[1-2]。目前，國內(nèi)外對蛋白質(zhì)體外復(fù)性研究較多，過程主要包括破菌、包涵體洗滌、包涵體溶解、復(fù)性等步驟。蛋白質(zhì)復(fù)性是一個非常復(fù)雜的環(huán)節(jié)，其復(fù)性結(jié)果除與蛋白質(zhì)復(fù)性的過程控制相關(guān)外，還很大程度上與蛋白質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)，該過程費時費力，且不經(jīng)濟。雖然添加促溶標(biāo)簽可以促進蛋白在大腸埃希菌中的可溶性表達，但含有促溶標(biāo)簽的重組蛋白需要用多種蛋白酶切除標(biāo)簽，在大規(guī)模生產(chǎn)時使用蛋白酶降解成本很高，應(yīng)用也受到了限制。因此，探索重組蛋白在大腸埃希菌中的可溶性表達以及低成本的標(biāo)簽純化方式具有廣泛的應(yīng)用前景。

SS1是小鼠中提取的抗間皮素單克隆抗體的單鏈二硫鍵穩(wěn)定抗體(scdsFv)片段，可與間皮素特異性結(jié)合。其與假單胞菌外毒素A(Pseudomonas exotoxin A)的衍生毒素PE38KDEL連接的產(chǎn)物SS1P目前已進入臨床Ⅱ期階段，主要用于針對間皮瘤、卵巢癌等的治療[5]。

內(nèi)含肽是一種可介導(dǎo)前體蛋白質(zhì)自我切除，將兩側(cè)外顯肽連接在一起的功能性蛋白質(zhì)。內(nèi)含肽按照結(jié)構(gòu)特征分類，可分為標(biāo)準(zhǔn)蛋白內(nèi)含肽、微小蛋白內(nèi)含肽和斷裂蛋白內(nèi)含肽[7-8]。其中，標(biāo)準(zhǔn)蛋白內(nèi)含肽由蛋白剪接結(jié)構(gòu)域和歸巢核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域組成；微小蛋白內(nèi)含肽僅含有剪接結(jié)構(gòu)域；斷裂蛋白內(nèi)含肽的剪接結(jié)構(gòu)域則位于兩個不同的編碼框中[6-7]。斷裂內(nèi)含肽如NpuDnaE可有效避免體內(nèi)提前斷裂，具有廣泛應(yīng)用前景[8-12]。Zetteler等[13]證實，NpuDnaE具有很高的反應(yīng)速率，且適用條件寬泛。研究表明，天然內(nèi)含肽分子內(nèi)的半胱氨酸之間形成了二硫鍵，降低了內(nèi)含肽的剪切反應(yīng)速率，加入DTT會破壞分子內(nèi)的二硫鍵，可能會提高斷裂反應(yīng)速率[14]。Ramirez等[15]建立了NpuDnaED118G的突變體，這種突變體可以在有效抑制N端斷裂的同時提高C端的斷裂效率，在重組蛋白生產(chǎn)純化中被廣為應(yīng)用。

本實驗中將斷裂內(nèi)含肽與促溶標(biāo)簽聯(lián)用，實現(xiàn)免疫毒素在大腸埃希菌中的可溶性表達；同時，內(nèi)含肽的自我斷裂可以很容易地將標(biāo)簽從免疫毒素中除去，避免通過蛋白酶等方法去除標(biāo)簽，降低了實驗成本。

1 材 料

1.1 試 劑

PCR所用DNA聚合酶、連接酶和限制性內(nèi)切酶(大連寶生物工程有限公司)；同源重組試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)；質(zhì)粒抽提試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒(美國Axygen公司)；ECL發(fā)光顯色液(美國Millipore生物公司)；異丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG，美國Sigma公司)；抗組氨酸標(biāo)簽抗體、羊抗鼠二抗(anti His,goat anti mouse IgG,上海生工生物工程股份有限公司)；生物素化人源間皮素(北京義翹神州生物科技有限公司)；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

Dextrin Beads 6FF柱和鎳柱(常州天地人和生物科技有限公司)；DNA凝膠電泳儀和凝膠成像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；蛋白凝膠電泳儀(美國BioRad公司)；型號為Octet RED 96生物分子相互作用工作站(Fortebio，上海交通大學(xué)生命學(xué)院)。

1.3 菌株和質(zhì)粒

大腸埃希菌DH5α、SHuffle T7感受態(tài)均為實驗室自制；包含促溶標(biāo)簽麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)片段的質(zhì)粒pET30a/MBP、包含斷裂內(nèi)含肽NpuDnaE的C端內(nèi)含肽的質(zhì)粒pET32a/NpuC、包含斷裂內(nèi)含肽NpuDnaE的N端內(nèi)含肽的質(zhì)粒pET30a/NpuN均為實驗室保存[16]；包含毒素PE38KDEL片段的質(zhì)粒pET32a/PE38KDEL為實驗室保存[17]；包含scdsFv片段的質(zhì)粒pUC57/SS1由金斯瑞生物科技有限公司合成。

2 方 法

2.1 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建

本研究以斷裂內(nèi)含肽NpuDnaE(NpuDnaED118G突變體)為工具，通過外顯肽與NpuC端連接構(gòu)建4種重組質(zhì)粒(圖1)，分別在大腸埃希菌SHuffle T7中表達后比較重組蛋白的溶解性。實驗所用到的引物見表1，所需構(gòu)建的質(zhì)粒、所用模板等信息見表2。其中，6H為His標(biāo)簽的縮寫，TH為硫氧還蛋白促溶標(biāo)簽(thioredoxins，Trx)與His標(biāo)簽聯(lián)用的縮寫。

由式(17) 可知，策略概率更新規(guī)則{P(t),t≥0}實際上是一個馬爾柯夫更新過程，當(dāng)前狀態(tài)由N個M×L概率矩陣構(gòu)成，策略空間為Ω={P∈[0,1]M*L}，用戶基于隨機學(xué)習(xí)博弈的目標(biāo)函數(shù)為：

Figure1 Schematic diagram of plasmids

A:pET32a/TH-NpuC-SS1-PE38KDEL;B:pET28a/6H-SS1-PE38KDEL;C:pET28a/6H-MBP-NpuC-SS1;D:pET28a/6H-MBP-NpuC-SS1-PE38KDEL

Table1 Primers used to construct plasmids

No.Sequence15'-CATGGCTGATATCGGATCCGAATTCATGATCGAGATAGCCACAGAGAAATA-3'25'-CCAGACTGCTGCAGTTGTACCTGCATATTAGAAGCTATGAAGCCATTCTCGAGTGCAAA-3'35'-CCAGACTGCTGCAGTTGTACCTGCAT-3'45'-GCAAGCGGAGGACCAGAA-3'55'-GTGCTGGGACAAAGTTGGAAATAGGCGGCAGCCTGGCCGCGCTGACCGCGCACCAG-3'65'-TGGTGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCTCACAGCTCGTCTTTCGGCGG-3'75'-TGAAAGAGTTCCTCGACGCTAACCTGGCCATGATCAAAATAGCCACACGTAAATATTT-3'85'-GCCGGACTACGCCAGCCAGCCCGGCAAACCGCCGAAAGACGAGCTGTGAGGAATTCAAA-3'95'-TGCTGTCCACCAGTCATGCTAGCCATATGAAAATCGAAGAAGGTAAACTGGTA-3'105'-CTCGTATCACCAAGGGCGGAGGCGGATCTGGTGGTGGCGGATCCGGAGGTGGCGGAAGC-3'115'-GGATCCGGAGGTGGCGGAAGCATGATCAAAATAGCCACACGTAAATATTTAGGCAAAC-3'125'-AGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCATGAGAATTCGAGCTCCGTCGACAAGCTTGC-3'

Table2 Template,primers and restriction enzymes used to construct plasmids and bp of insert gene

Plasmids NameTemplatePrimersRestriction enzymebppET32a/TH-NpuC-SS1-PE38KDELpET32a/NpuCpUC57/SS1pET32a/PE38KDEL1-6EcoRⅠNotⅠ1 887pET28a/6H-SS1-PE38KDELpET32a/NpuC-SS1-PE38KDEL7-8NdeⅠEcoRⅠ1 770pET28a/6H-MBP-NpuC-SS1pET30a/MBPpET32a/NpuC-SS19-12NdeⅠEcoRⅠ2 008pET28a/6H-MBP-NpuC-SS1-PE38KDELpET28a/MBP-NpuC-SS1pET32a/PE38KDEL5,89,12NdeⅠEcoRⅠ3 054

2.1.1 pET32a/TH-NpuC-SS1-PE38KDEL質(zhì)粒構(gòu)建 使用引物1和引物2從pET32a/NpuC中擴增NpuC片段；使用引物3與引物4從pUC57/SS1中擴增SS1片段；使用引物5與引物6從pET32a/PE38KDEL中擴增PE38KDEL片段。膠回收后用引物1和引物4通過重疊PCR連接NpuC、SS1兩個片段得到NpuC-SS1；質(zhì)粒pET32a用EcoRⅠ，NotⅠ酶切后，使用多片段同源重組酶將NpuC-SS1、PE片段與pET32a質(zhì)粒相連接；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DH5α感受態(tài)中，挑取單菌落培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒并送測序。

2.1.2 pET28a/6H-SS1-PE38KDEL質(zhì)粒構(gòu)建 使用引物7和引物8從pET32a/NpuC-SS1-PE38KDEL中擴增SS1-PE38KDEL片段，膠回收后用NdeⅠ 和EcoRⅠ酶切；pET28a用NdeⅠ和EcoRⅠ酶切，分別膠回收后用連接酶SolutionⅠ連接；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DH5α感受態(tài)中，挑取單菌落培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒并送測序。

2.1.3 pET28a/6H-MBP-NpuC-SS1質(zhì)粒構(gòu)建 使用引物9和引物10從pET30a/MBP中擴增MBP片段；使用引物11和引物12從pET32a/NpuC-SS1中擴增NpuC-SS1片段；pET28a質(zhì)粒用NdeⅠ和EcoRⅠ酶切；分別膠回收后使用多片段同源重組酶將兩個擴增片段與酶切回收后pET28a質(zhì)粒相連接；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DH5α感受態(tài)中，挑取單菌落培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒并送測序。

2.1.4 pET28a/6H-MBP-NpuC-SS1-PE38KDEL質(zhì)粒構(gòu)建 使用引物9和引物12從pET28a/MBP-NpuC-SS1中擴增MBP-NpuC-SS1片段；使用引物5和引物8從pET32a/PE38KDEL中擴增PE38KDEL片段；pET28a用NdeⅠ和EcoRⅠ酶切；分別膠回收后使用多片段同源重組酶將兩個擴增片段與pET28a質(zhì)粒相連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DH5α感受態(tài)中，挑取單菌落培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒并送測序。

2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達及純化

2.2.1 重組蛋白的誘導(dǎo)表達 將以上所得重組表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入大腸埃希菌SHuffle T7中得到相應(yīng)的重組蛋白表達菌株。SHuffle T7菌株在含有相應(yīng)抗性平板上37 ℃培養(yǎng)過夜后挑取單菌落接種到含有相同抗性的LB 5 mL培養(yǎng)基中培養(yǎng)。其中，含有pET32a/TH-NpuC-SS1-PE38KDEL質(zhì)粒的菌株為Amp抗性，其余3種表達菌株均為Kan抗性。將LB 5 mL培養(yǎng)基在37 ℃、220 r/min培養(yǎng)12 h后，按1%的接種量接種到含有相同抗性的LB 500 mL培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)3～4 h，當(dāng)A600達到0.5時，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，20 ℃、180 r/min過夜培養(yǎng)。分別取誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后、裂解后上清液與裂解后沉淀制樣，用考馬斯亮藍方法檢測蛋白表達情況和可溶性，用GraphPad Prisim(8.3.0版)軟件做統(tǒng)計學(xué)分析。本實驗中表達的蛋白及其基本性質(zhì)見表3。用Western blot方法驗證蛋白。

Table3 Theoretical molecular weight and pI of proteins expressed in this study

Recombinant protein nameTheoretical molecular weight / kDpITH-NpuC-SS1-PE38KDEL100.65.716H-SS1-PE38KDEL65.85.406H-MBP-NpuC-SS174.17.026H-MBP-NpuC-SS1-PE38KDEL112.05.696H-NpuN14.04.75

2.2.26H-MBP-NpuC-SS1，6H-MBP-NpuC-SS1-PE38KDEL重組蛋白純化 過夜誘導(dǎo)后，7 000 r/min離心10 min收集菌體，用純化用緩沖液(20 mmol/L Tris，200 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA 咪唑，pH 7.4)40 mL將沉淀菌重懸，高壓均質(zhì)機加壓至900 bar(1 bar=0.1 MPa)，4 ℃破碎3 min后逐漸減壓并收集菌液。后迅速在離心機內(nèi)4 ℃、4 000 r/min 離心30 min，收集上清液備用，收集裂菌沉淀并制備蛋白電泳樣品。用Dextrin Beads 6FF重力柱純化，使用洗脫液(20 mmol/L Tris，200 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，10 mmol/L麥芽糖，pH 7.4)洗脫，分管收集蛋白。利用考馬斯亮藍法對蛋白純化結(jié)果進行檢測，將含有目的蛋白的洗脫液合并，放置在-20 ℃凍存待用。

2.2.3 6H-NpuN重組蛋白純化 純化采用鎳柱。上樣緩沖液為含有40 mmol/L咪唑的PBS緩沖液(pH 7.4)；洗脫緩沖液分別為含有60、80、200 mmol/L咪唑的PBS緩沖液(pH 7.4)，每個濃度洗脫10 mL，分管收集蛋白。利用考馬斯亮藍法對蛋白純化結(jié)果進行檢測，將含有目的蛋白的洗脫液合并，放置在-20 ℃凍存待用。

2.3 內(nèi)含肽的體外剪切反應(yīng)

2.3.1 內(nèi)含肽的體外剪切反應(yīng)的檢測NpuN端反應(yīng)底物為6H-NpuN，分別與NpuC端反應(yīng)底物6H-MBP-NpuC-SS1、6H-MBP-NpuC-SS1-PE38KDEL混合加入，其中6H-NpuN過量。加入二硫蘇糖醇(D，L-dithiothreitol，DTT)至終濃度為1 mmol/L，30 ℃反應(yīng)2 h。以上反應(yīng)均加入蛋白電泳的5×上樣緩沖液終止反應(yīng)，用考馬斯亮藍染色法對內(nèi)含肽剪切反應(yīng)進行檢測。剪切后可能包括的產(chǎn)物如表4。使用Image J軟件掃描SDS-PAGE電泳圖上對應(yīng)條帶的光密度并計算產(chǎn)物生成率，產(chǎn)物生成率計算公式如下：

產(chǎn)物生成率(%)=目的蛋白條帶的光密度與相對分子質(zhì)量的比值/(剩余前體蛋白光密度與相對分子質(zhì)量的比值+目的蛋白條帶的光密度與相對分子質(zhì)量的比值)×100。

Table4 Theoretical molecular weight and pI of intein cleavage product

NameTheoretical molecular weight / kDpISS125.47.96SS1-PE38KDEL62.95.406H-MBP-NpuC46.26.27

2.3.2 影響內(nèi)含肽體外剪切反應(yīng)的因素 為了進一步優(yōu)化斷裂反應(yīng)條件，提高斷裂反應(yīng)效率，本實驗以6H-MBP-NpuC-SS1和6H-MBP-NpuC-SS1-PE38KDEL為例，在6H-NpuN過量條件下，對可能影響內(nèi)含肽斷裂的幾個因素進行探索，包括DTT濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間3個方面。在時間為2 h，DTT濃度為1 mmol/L條件下，探究在4，30，37 ℃ 3個溫度條件下內(nèi)含肽剪切產(chǎn)物生成率；在溫度為30 ℃，DTT濃度為1 mmol/L條件下，探究在5，30，60 min 3個時間點時內(nèi)含肽剪切產(chǎn)物生成率；在溫度為30 ℃，反應(yīng)時間為2 h條件下，探究不加DTT和DTT濃度為5 mmol/L 2個條件下內(nèi)含肽剪切產(chǎn)物生成率。用Graphpad Prisim(8.3.0版)軟件作統(tǒng)計學(xué)分析，通過不同條件下斷裂內(nèi)含肽剪切產(chǎn)物生成率的比較，考察內(nèi)含肽對剪切反應(yīng)不同條件的耐受度。使用ImageJ軟件掃描SDS-PAGE電泳圖上對應(yīng)條帶的光密度并計算產(chǎn)物生成率，生成率計算公式同“2.3.1”項。

2.4 蛋白除雜與目的蛋白的濃縮

斷裂反應(yīng)完成后產(chǎn)物在4 ℃下用3 kD濾膜按照1∶1 000的比例透析，透析液為PBS(pH 7.4)，每隔6小時換液1次，共換液2次。透析樣品稀釋5倍后用鎳柱除去未完全斷裂的6H-MBP-NpuC-SS1、6H-MBP-NpuC-SS1-PE38KDEL和斷裂后的產(chǎn)物雜質(zhì)6H-MBP-NpuC，接流穿。用Capto L柱濃縮流穿中的目的蛋白，洗脫液為檸檬酸緩沖液(pH 2.6)，洗脫后立即加入1 mol/L Tris-HCl(pH 9)調(diào)節(jié)pH至7.4，所得到的蛋白立即用PBS(pH 7.4)透析，透析步驟同上。

2.5 Fortebio檢測親和力

SS1是鼠源的抗間皮素片段抗體，可與間皮素特異性結(jié)合，實驗以生物素化人源間皮素為抗原，以pH 7.4的PBS作為蛋白稀釋緩沖液，將抗體SS1與免疫毒素SS1-PE38KDEL分別稀釋成20，50，100，200，300 nmol/L 5個濃度梯度檢測其親和力。其中傳感器采用SA傳感器，在PBS浸泡30 min后使用?？乖Y(jié)合時間設(shè)定為300 s，之后用含有0.05% BSA的0.02% PBST封閉300 s，在PBS浸泡120 s后，用抗體親和300 s，然后在PBS中解離300 s，循環(huán)3次再生步驟后(pH 3的10%甘氨酸浸泡15 s，0.05%PBST浸泡5 s)，相同步驟測定下一個濃度的抗體親和情況。

3 結(jié) 果

3.1 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果顯示NpuC-SS1片段、PE38KDEL片段、NpuC片段、SS1片段、SS1-PE38KDEL片段、MBP-NpuC-SS1片段、MBP片段均與理論片段大小一致，電泳結(jié)果如圖2。同源重組或酶切連接后轉(zhuǎn)入DH5α中，抽提質(zhì)粒后送測序，結(jié)果表明質(zhì)粒均為正確序列。

3.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達及純化

3.2.1 重組蛋白的誘導(dǎo)表達 將大腸埃希菌SHuffle T7作為宿主細(xì)胞表達重組蛋白，探索含有不同促溶標(biāo)簽的蛋白可溶性。其中6H-SS1-PE38KDEL重組蛋白不含有促溶標(biāo)簽。TH-NpuC-SS1-PE38KDEL、6H-MBP-NpuC-SS1、6H-MBP-NpuC-SS1-PE38KDEL分別與6H-SS1-PE38KDEL對比可溶性，結(jié)果如圖3。對比看出，相較無促溶標(biāo)簽的6H-SS1-PE38KDEL，含有Trx促溶標(biāo)簽的TH-NpuC-SS1-PE38KDEL上清液中蛋白由43%提高到47%；含有MBP促溶標(biāo)簽的6H-MBP-NpuC-SS1上清液中蛋白約為87%，6H-MBP-NpuC-SS1-PE38KDEL上清液中蛋白約為98%?？梢奙BP促溶標(biāo)簽對本實驗中重組蛋白促溶效果更佳，因此實驗選用MBP作為促溶標(biāo)簽的重組蛋白用于后期純化。用Western blot驗證蛋白，一抗為抗組氨酸標(biāo)簽抗體(anti His)，二抗用羊抗鼠二抗(goat anti mouse IgG)，結(jié)果如圖4，結(jié)果表明4種表達蛋白為所構(gòu)建的重組蛋白。

3.2.2 重組蛋白的純化 6H-MBP-NpuC-SS1與6H-MBP-NpuC-SS1-PE38KDEL重組蛋白經(jīng)過Dextrin Beads 6FF(MBP標(biāo)簽親和柱)純化后，使用SDS-PAGE進行鑒定，結(jié)果如圖5-A。結(jié)果顯示條帶大小均符合理論相對分子質(zhì)量。6H-NpuN蛋白經(jīng)過鎳柱純化后，結(jié)果如圖5-B。蛋白在60 mmol/L咪唑濃度條件下開始洗脫，在200 mmol/L咪唑條件下洗脫集中。將含有目的蛋白較多的收集液合并，以待下一步反應(yīng)。

Figure2 PCR products detected by 1% agarose gel electrophoresis

Lane M:Nucleic acid marker;(A) Lane 1:PCR productNpuC-SS1 amplified by primer 1 and primer 4;Lane 2:PCR productNpuC-SS1 amplified by primer 11 and primer 12;(B) Lane 1:PCR product PE38KDEL amplified by primer 5 and primer 6;Lane 2:PCR product PE38KDEL amplified by primer 5 and primer 8;(C) Lane 1:PCR productNpuC amplified by primer 1 and primer 2;Lane 2:PCR product SS1 amplified by primer 3 and primer 4;(D) Lane 1:PCR product SS1-PE amplified by primer 7 and primer 8;(E):Lane 1:PCR product MBP-NpuC-SS1 amplified by primer 9 and primer 12；Lane 2:PCR product MBP amplified by primer 9 and primer 10

Figure3 12% SDS-PAGE analysis of the expression of recombinant proteins

Lane M:Molecular weight marker;Lane T:Whole cell lysates;Lane S:Soluble fraction;Lane I:Insoluble fraction;Full-length fusion proteins are indicated with arrows

Figure4Western blot of four kind of recombinant proteins

The primary antibody is anti His antibody,and the secondary antibody is goat anti mouse IgG antibody

Lane M:Molecular weight marker;(A) Lane 1:Western blot of 6H-NpuC-SS1-PE38KDEL;Lane 2:Western blot of 6H-SS1-PE38KDEL;(B) Lane 1:Western blot of 6H-MBP-NpuC-SS1;Lane 2:Western blot of 6H-MBP-NpuC-SS1-PE38KDEL

Figure5 12% SDS-PAGE of purification ofNpuC recombinant proteins andNpuN 6H-MBP-NpuC-SS1-PE38KDEL and 6H-MBP-NpuC-SS1 purified by Dextrin Beads 6FF column,6H-NpuN purified by nickel column.Full-length fusion proteins are indicated with arrows

(A) Lane M:Molecular weight marker;Lane S:Supernatant after induction;Lane F:Flow through;Lane 1- 5:Elution of 6H-MBP-NpuC-SS1-PE38KDEL using 10 mmol/L maltose;Lane 6- 10:Elution of 6H-MBP-NpuC-SS1 using 10mmol/L maltose;(B) Lane M:the molecular weight marker;Lane S:Supernatant after induction;Lane F:Flow through;Lane 1:Elution of 6H-NpuN using 60 mmol/L imidazole;Lane 2-3:Elution of 6H-NpuN using 80 mmol/L imidazole;Lane 4-8:Elution of 6H-NpuN using 200 mmol/L imidazole

3.3 內(nèi)含肽的體外剪切反應(yīng)

3.3.1 內(nèi)含肽的體外剪切反應(yīng)的檢測NpuC端反應(yīng)底物6H-MBP-NpuC-SS1和6H-MBP-NpuC-SS1-PE38KDEL分別與NpuN端表達產(chǎn)物6H-NpuN反應(yīng)，結(jié)果如圖6所示。反應(yīng)體系中出現(xiàn)了SS1預(yù)期分子大小產(chǎn)物和SS1-PE38KDEL預(yù)期分子大小產(chǎn)物。由ImageJ計算得6H-MBP-NpuC-SS1的轉(zhuǎn)化率約為74%，6H-MBP-NpuC-SS1-PE38KDEL的轉(zhuǎn)化率約為70%。

Figure6 12% SDS-PAGE of intein mediated cleavage of recombinant proteins((t=2 h,T=30 ℃,c(DTT )=1 mmol)

Lane M:Molecular weight marker;Lane 1:NpuC cleavage product of 6H-MBP-NpuC-SS1 when add excess 6H-NpuN；Lane 2:NpuC cleavage of 6H-MBP-NpuC-SS1-PE38KDEL when add excess 6H-NpuN

3.3.2 影響內(nèi)含肽的體外剪切反應(yīng)的因素 6H-MBP-NpuC-SS1斷裂效率受溫度影響較小，在4，30，37 ℃下斷裂產(chǎn)物生成率基本相當(dāng)；在DTT濃度為5 mmol/L條件下斷裂產(chǎn)物生成率明顯高于DTT不存在時斷裂產(chǎn)物生成率，且斷裂反應(yīng)5 min之內(nèi)即可達到平衡。

6H-MBP-NpuC-SS1-PE38KDEL在低溫下剪切效率受到較大影響，在30 ℃或37 ℃條件下斷裂產(chǎn)物生成率較高；在DTT濃度為5 mmol/L條件下斷裂產(chǎn)物生成率明顯高于DTT不存在時斷裂產(chǎn)物生成率，且斷裂反應(yīng)在30 min內(nèi)達到平衡。

3.4 內(nèi)含肽斷裂后蛋白純化

內(nèi)含肽斷裂后產(chǎn)物用鎳柱除去未反應(yīng)底物和斷裂雜質(zhì)后，目的蛋白SS1與SS1-PE38KDEL保留在流穿中，濃度較低。由于Capto L柱對于抗體可變區(qū)域Kappa片段具有很強的親和力，因此在本實驗中用于富集鎳柱流穿中的目的蛋白。結(jié)果表明，Capto L可捕獲SS1蛋白，對SS1-PE38KDEL無明顯富集作用。SDS-PAGE檢測結(jié)果如圖7所示。圖7-A為SS1除雜后Capto L捕獲結(jié)果，圖7-B為鎳柱除雜后流穿中剩余的SS1-PE38KDEL。

Figure7 Protein purification after intein cleavage

Nickel column removes precursor protein and impurities afterNpuC cleavage.Then Capto L column capture SS1

Lane M:Molecular weight marker;(A)Lane 1:SS1 captured by Capto L column;(B) Lane 1:SS1-PE in flow through after removal of impurities by nickel column

3.5 Fortebio檢測親和力

SS1及其免疫毒素SS1P能夠特異性的與人源mesothelin蛋白結(jié)合。利用生物膜干涉技術(shù)檢測斷裂后純化的SS1與SS1-PE38KDEL與生物素化人源間皮素之間的親和常數(shù)，檢測結(jié)果顯示(圖8)，斷裂純化后的SS1與mesothelin的親和力常數(shù)Kd為1.59×10-7mol/L，SS1P與mesothelin的親和力常數(shù)Kd為2.03×10-7mol/L，二者的親和力常數(shù)相當(dāng)。

Figure8 Affinity and dissociation between recombinant protein and human mesothelin

Concentration of human mesothelin is 100 nmol,concentration of recombinant protein is 20，50,100,200,300 nmol/L

A：Affinity and dissociation between SS1 and human mesothelin (Kd1.59×10-7mol/L);B： Affinity and dissociation between SS1-PE38KDEL and human mesothelin (Kd2.03×10-7mol/L)

4 討 論

本實驗中，應(yīng)用斷裂內(nèi)含肽實現(xiàn)蛋白SS1與免疫毒素SS1-PE38KDEL的可溶性表達，既可以省略包涵體復(fù)雜的變復(fù)性過程，又可以降低去除促溶標(biāo)簽的成本，對今后免疫毒素的生產(chǎn)過程優(yōu)化具有重要借鑒意義。

本課題中，內(nèi)含肽NpuDnaE斷裂效率略大于70%，斷裂效率還有待于進一步提高。推測較低的斷裂效率可能由于目的蛋白的首三位氨基酸殘基與NpuC天然的C端外顯肽首三位氨基酸殘基不同導(dǎo)致。大部分DnaE內(nèi)含肽C端連接的外顯肽首三位氨基酸殘基為高度保守的“CFN”(半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸)，尤其是外顯肽首位半胱氨酸對內(nèi)含肽剪接、剪切活性具有重要作用[18]，而本研究是為了探索開發(fā)適合于抗體片段及免疫毒素等藥用重組蛋白的純化方法，需避免在目的蛋白中引入外源氨基酸，因此NpuC與目的蛋白之間并未使用連接子進行連接，NpuC的C端外顯肽首三位氨基酸殘基即為SS1的首三位氨基酸殘基“DIE”(天冬氨酸、異亮氨酸、谷氨酸)，外顯肽首三位氨基酸的差異可能在一定程度上降低了斷裂效率[19-20]。此外，本實驗發(fā)現(xiàn)SS1P相較于SS1而言，剪切效率較低，且受溫度影響較大，推測是由于外顯肽自身構(gòu)象會影響內(nèi)含肽的斷裂[21]，片段抗體SS1及其免疫毒素SS1P，結(jié)構(gòu)上毒素分子的差異可能造成了斷裂產(chǎn)物生成率與剪切速度上的差異。本實驗還觀察到SS1-PE38KDEL不能很好地與Capto L柱結(jié)合，同樣提示PE38KDEL片段的存在可能影響了SS1與Capto L柱子的親和。為進一步探究斷裂效率的具體影響因素，可分別通過在外顯肽中引入外源氨基酸“CFN”探究連接外顯肽的首三位殘基的影響，進一步可通過定向進化篩選對外顯肽首三位氨基酸寬泛性更佳的內(nèi)含肽突變體；此外，由于NpuDnaE等天然斷裂內(nèi)含肽在有變性劑存在的條件下仍能保持優(yōu)異的活性，可嘗試通過加入尿素破壞蛋白空間結(jié)構(gòu)的方式探究外顯肽構(gòu)象對斷裂效率的影響。

經(jīng)Fortebio驗證，借由本研究表達純化方法得到的SS1與SS1-PE38KDEL均具有親和活性，表明方案設(shè)計的免疫毒素可溶性表達工藝具有潛在實際應(yīng)用價值。同時，本研究仍有許多方面需要進行更加深入的研究，例如內(nèi)含肽剪接反應(yīng)后產(chǎn)物的進一步純化方法的開發(fā)，空間結(jié)構(gòu)的因素是否影響斷裂反應(yīng)效率等。