miRNA-455-5p對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞株P(guān)IK3R1基因靶向調(diào)控作用的研究

柯孔亮 王金秋 樓婷婷 張魯青 繆淳迪 郭宇

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見(jiàn)惡性腫瘤，在所有癌癥死亡原因中居第3位[1]。在我國(guó)，CRC發(fā)病率和死亡率均較高[2]。由于CRC的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程復(fù)雜且影響因素較多，到目前為止其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚[3]。微小 RNA（microRNA，miRNA）是內(nèi)源性非編碼RNA，分子量小，長(zhǎng)度為22～25個(gè)核苷酸，在真核生物中廣泛存在[4]。研究表明，miRNA在調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化以及凋亡等過(guò)程起至關(guān)重要作用，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，是惡性腫瘤的潛在治療靶點(diǎn)及預(yù)后評(píng)估指標(biāo)[5-7]。miRNA-455-5p是近年發(fā)現(xiàn)的小分子RNA，位于第6條染色體。多項(xiàng)研究表明，miRNA-455-5p與多種實(shí)體惡性腫瘤相關(guān)，如在甲狀腺髓樣癌、黑色素瘤、胃癌等腫瘤中表達(dá)下調(diào)[8-10]。本研究團(tuán)隊(duì)前期檢測(cè)了miRNA-455-5p在CRC及癌旁組織中的表達(dá)，同時(shí)研究了上下調(diào)miRNA-455-5p在3株結(jié)腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)，利用信息數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)磷脂酰肌醇三激酶調(diào)節(jié)亞單位α（PIK3R1）可能是miRNA-455-5p的靶基因[11]。本文在前期研究的基礎(chǔ)上，探討miRNA-455-5p對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞株P(guān)IK3R1基因靶向調(diào)控作用，以進(jìn)一步驗(yàn)證PIK3R1基因是miRNA-455-5p的靶基因?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞株（上海諾百公司）。Trizol試劑（15596-026，美國(guó) Invitrogen公司），逆轉(zhuǎn)錄酶（R250-01，美國(guó)Invitrogen公司），熒光染料 SYBR GreenⅠ（CS7561，美國(guó) Invitrogen公司），RNA 酶抑制劑（E00381，立陶宛 Fermentas公司），oligo dT/Random primer/特異性引物（Oligo，美國(guó) Invitrogen 公司），Platinum Taq DNA多聚酶（10966034，美國(guó) Invitrogen公司），100mM dNTPs（18427013，美國(guó) Invitrogen公司），羊抗兔-辣根過(guò)氧化物酶（ab205719，上海艾博抗公司），Protein Marker（DM111-01，TransGen公司），mTOR（7C10）兔單克隆抗體（#2983，美國(guó)Cell Signaling Technology公司），抗-AKT1抗體（bs-0115R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司），HEK293細(xì)胞（sciencellZQ0034，上海雅吉生物科技有限公司），雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（Promega E1910，上海力敏實(shí)業(yè)有限公司），腔腸素（40904ES02，上海翊圣公司），內(nèi)切酶（ER0051 BamHI，立陶宛Fermentas公司），T4 DNA連接酶（EP0061，立陶宛Fermentas公司），質(zhì)粒小抽試劑盒（AP-MN-P-250，美國(guó)Ayxgen公司），質(zhì)粒中抽試劑盒（AP-MD-P-25，美國(guó)Ayxgen公司），質(zhì)粒大抽試劑盒（AP-MX-P-25，美國(guó)Ayxgen公司）。高速冷凍離心機(jī)（Neofuge13R，上海Heal Forcegons公司），生物安全柜（HFSafe-1800，上海 Heal Force公司），實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）儀（CFX96TMReal-Time Systerm，美國(guó)BIO-RAD公司），成像系統(tǒng)（Gel Doc2000，美國(guó) BIO-RAD 公司），垂直電泳系統(tǒng)（1658003，美國(guó)BIO-RAD公司），熒光素酶測(cè)定儀（Turner GloRunner，美國(guó)Turner BioSystems公司），脂質(zhì)體 2000（11668-019，美國(guó) Invitrogen公司），減血清培養(yǎng)基（31985，美國(guó)GIBCO公司），熒光顯微鏡（IX51，日本Olympus公司）。

1.2 方法 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染、qRT-PCR、免疫印跡試驗(yàn)等在寧波市第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室完成；雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)在寧波市杭州灣醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室完成。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）實(shí)驗(yàn)用的細(xì)胞為對(duì)數(shù)增殖期細(xì)胞；（2）細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)，F(xiàn)am-NC驗(yàn)證CRC細(xì)胞株HT-29的轉(zhuǎn)染效率，當(dāng)轉(zhuǎn)染效率＞50%時(shí)可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；（3）HT-29細(xì)胞使用HieffTransTMLiposomal Transfection Reagent脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染6孔板細(xì)胞效果最好的陽(yáng)性比例為70%～80%。

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 復(fù)蘇HT-29細(xì)胞并調(diào)整好細(xì)胞狀態(tài)。提前1d鋪板，按3×105個(gè)/ml接種到6孔板中，分成兩組，每組鋪3個(gè)孔。37℃培養(yǎng)過(guò)夜，使細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%；第2天分別將5μl Hieff脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑、總量為100pmol的siRNA轉(zhuǎn)染至miRNA-455-5pinhibitor（抑制劑組）、miRNA-455-5p-mimics（模擬劑組）、miRNA-455-5p-mimics-NC（模擬劑對(duì)照組）、miRNA-455-5p-inhibitor-NC（抑制劑對(duì)照組）以及Fam-NC（陽(yáng)性對(duì)照組）的細(xì)胞株中，48h后收集細(xì)胞，見(jiàn)圖1。HT-29細(xì)胞培養(yǎng)條件：McCOY’s 5A+10%胎牛血清+1%pen-strep（optional）；0.05%Trypsin 消化 1～2min；1∶2傳代，約2d長(zhǎng)滿；3d左右傳代1次。

圖1 HT-29 細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果（a：空白對(duì)照組；b：模擬劑組；c：陽(yáng)性對(duì)照組；d：模擬劑對(duì)照組；e：抑制劑組；f：抑制劑對(duì)照組）

1.2.2 PIK3R1、AKT1、MTOR mRNA表達(dá)的檢測(cè) 采用qRT-PCR法。將收集的細(xì)胞沉淀反轉(zhuǎn)錄到cDNA，用sybr染料法進(jìn)行 PIK3R1、AKT1、MTOR mRNA 表達(dá)的檢測(cè)。（1）RNA抽提：對(duì)樣本進(jìn)行組織研磨、貼壁細(xì)胞洗滌、懸浮細(xì)胞去培養(yǎng)基等處理后，置于RNaseFree的1.5ml離心管中；加入1 000μl Trizol試劑，劇烈搖晃，靜置5min；加200μl氯仿，振蕩混勻，室溫靜置5min；12 000g、4℃離心15min；將上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中，加入等體積的異丙醇，室溫靜置10min；12 000g、4℃離心10min；棄上清液，除盡異丙醇，加入1 000μl 75%無(wú)水乙醇，12 000g、4℃離心 5min；棄上清液，待沉淀干燥后加入DEPC處理水30～50μl；RNA電泳和OD檢測(cè)質(zhì)檢。（2）引物合成：miRNA-455-5p、PIK3R1、AKT1及MTOR合成的引物序列，見(jiàn)表1。（3）調(diào)整RNA濃度，按照實(shí)驗(yàn)?zāi)康南♂孯NA至統(tǒng)一濃度；取一滅菌的無(wú)RNA酶的eppendorf管，每個(gè)樣本加入以下組分，得到MixⅠ共 20μl體系：5μg 總 RNA 5μl，rimer（50μM oligo dT） 0.5μl，andom primer 0.5μl，0mM dNTP Mix 1μl，EPC-treated water 5μl；在 MixⅠ里加入以下成分，得到MixⅡ共 20μl體系：5xFirst-Strand buffer 4μl，0.1M dTT 2μl，Naseout（40U/μl）1μl，SuperScripⅢ RT（200U/μl）1μl，MixⅠ12μl。反應(yīng)條件：25℃ 5min，50℃ 60min，70℃15min。（4）將獲得的引物與cDNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系：ddH2O 23μl，10×PCR Buffer 2.0μl，Mg2+（50mM）2.0μl，dNTPs（10mM）0.5μl，Primer F（10μM）0.5μl，SYBR（20×）1.0μl，Primer R（10μM）0.5μl，Taq enzyme（5U/μl）0.2μl，Template 1.0μl，總體積 20μl。每個(gè)樣本反應(yīng)總量20μl，反應(yīng)條件：95℃ 2min，95℃ 10s，60℃ 60s，70℃45s，共40個(gè)循環(huán)；Melt（70～95℃）。采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量，ΔΔCt=待測(cè)樣品（Ct目-Ct內(nèi)）-對(duì)照樣品（Ct目-Ct內(nèi)）。

1.2.3 PIK3R1、AKT1、MTOR蛋白表達(dá)的檢測(cè) 采用免疫印跡試驗(yàn)。收集模擬劑組、模擬劑對(duì)照組、抑制劑組、抑制劑對(duì)照組轉(zhuǎn)染48h后的細(xì)胞沉淀，裂解、抽提蛋白、蛋白定量、上樣檢測(cè)。具體步驟如下：BCA法測(cè)定樣品濃度，40μg上樣；聚丙烯酰胺凝膠90V跑完積層膠后，將電壓升至200V直到電泳結(jié)束。取下凝膠，恒壓100V、恒流250mA轉(zhuǎn)膜約1.5h；取膜，PBST洗滌4次，5min/次。將膜置于5%脫脂奶粉封閉液中，37℃封閉 1h；用封閉液稀釋一抗，膜在一抗稀釋液中4℃過(guò)夜。次日取出膜，PBST洗膜4次，5min/次。用含5%牛奶的封閉液稀釋二抗，膜在二抗中37℃反應(yīng)1h。取出膜，置于干凈的盒子中洗膜4次，5min/次。最后ECL顯影，曝光。利用Image J軟件計(jì)算灰度值，即蛋白相對(duì)表達(dá)量。

表1 miRNA-455-5p、PIK3R1、AKT1及MTOR合成的引物序列

1.2.4 miRNA-455-5p的PIK3R1靶基因驗(yàn)證 采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。構(gòu)建PIK3R1的3′非編碼區(qū)（3′UTR）報(bào)告載體（包括野生型和突變型載體），測(cè)序驗(yàn)證正確后小抽制備質(zhì)粒。將miRNA-455-5p的啟動(dòng)子序列與PIK3R1的3′UTR插入到熒光素酶表達(dá)序列前方，構(gòu)成報(bào)告基因質(zhì)粒，若此轉(zhuǎn)錄因子能激活靶啟動(dòng)子，則熒光素酶基因就會(huì)表達(dá)，熒光素酶的表達(dá)量與轉(zhuǎn)入因子的作用強(qiáng)度成正比。提前1d鋪板，293細(xì)胞按8×104個(gè)/ml接種到24孔板中，分成5組[空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組（陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒pds162）、wt-455-5P-mimic組（CL1011-1-PDS162_psicheck3-gluc-_PIK3R1-3′UTRWT_-fluc）、wt-mimics-NC組（CL1011-1-PDS162_psicheck3-gluc-_PIK3R1-3′UTR-WT_-fluc）]，每組鋪 3 個(gè)孔。37℃培養(yǎng)過(guò)夜，使細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%。第2天分別以脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑 2.3μl、DNA 0.8μg+sirna 30pmol轉(zhuǎn)染細(xì)胞48h，收集上清液進(jìn)行分泌型熒光素酶（Gluc）檢測(cè)，裂解細(xì)胞沉淀進(jìn)行非分泌型熒光素酶（Fluc）檢測(cè)，計(jì)算Gluc/Fluc值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，兩組比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-455-5p 上下調(diào)后 PIK3R1、AKT1、MTOR mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 與模擬劑對(duì)照組比較，模擬劑組PIK3R1、AKT1、MTOR mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與抑制劑對(duì)照組比較，抑制劑組PIK3R1、AKT1、MTOR mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 miRNA-455-5p上下調(diào)后PIK3R1、AKT1、MTOR mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

2.2 miRNA-455-5p 上下調(diào)后 PIK3R1、AKT1、MTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 與模擬劑對(duì)照組比較，模擬劑組PIK3R1、AKT1、MTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與抑制劑對(duì)照組比較，抑制劑組PIK3R1、AKT1、MTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)圖2和表3。

2.3 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證靶基因 構(gòu)建PIK3R1的3′UTR報(bào)告載體（包括野生型和突變型載體）：CL1011-1-PDS162_psicheck3-gluc-_PIK3R1-3′UTRWT_-fluc;CL1011-2-PDS162_psicheck3-gluc-_PIK3R1-3′UTR_-MUT-fluc，結(jié)果測(cè)序驗(yàn)證正確，見(jiàn)表4。本實(shí)驗(yàn)熒光素酶切位點(diǎn)位于XhoⅠ/NotⅠ，見(jiàn)圖3。轉(zhuǎn)染293細(xì)胞48h后，陽(yáng)性對(duì)照組、wt-455-5P-mimic組、wt-mimics-NC組、mut-455-5p-micmics組、mut-mimics-NC組Gluc/Fluc 值分別為 11.52±0.38、5.66±0.16、9.42±0.36、9.10±0.35、9.42±0.36，其中 wt-455-5P-mimic 組明顯低于 wt-mimics-NC 組（P＜0.05），見(jiàn)圖 4；說(shuō)明 hsa-miRNA-455-5p能與PIK3R1基因的3′UTR結(jié)合，降低PIK3R1蛋白的翻譯水平。

圖2 miRNA-455-5p上下調(diào)后PIK3R1、AKT1、MTOR蛋白表達(dá)的電泳圖

表3 miRNA-455-5p 上下調(diào)后 PIK3R1、AKT1、MTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

表4 PIK3R1的3'UTR報(bào)告載體測(cè)序結(jié)果

3 討論

圖3 雙熒光素酶骨架載體信息（PDS162_psicheck3-gluc-fluc，5 882bp；熒光素酶切位點(diǎn)位于XhoⅠ/NotⅠ）

圖4 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)結(jié)果（Y1：wt-455-5P-mimic組；Y2：wt-mimics-NC 組；Y3：mut-455-5p-micmics組；Y4：mutmimics-NC 組；*P＜0.05）

miRNA是一類(lèi)內(nèi)源基因編碼的非編碼單鏈RNA分子，在動(dòng)植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)上午調(diào)控[4]。miRNA參與生命過(guò)程中重要進(jìn)程，包括早期發(fā)育、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞死亡、脂肪代謝以及細(xì)胞分化等[12]。目前對(duì)miRNA的研究還處于初級(jí)階段，它在高級(jí)真核生物體內(nèi)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用，可能與轉(zhuǎn)錄因子一樣重要，可能代表在一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的層次上的基因表達(dá)調(diào)控方式[13]。但是miRNA的多數(shù)功能仍是個(gè)謎。miRNA-RISC對(duì)靶基因mRNA的作用主要取決于它與靶基因轉(zhuǎn)錄體序列互補(bǔ)的程度，主要有以下3種作用方式[14]：（1）切斷靶基因的mRNA分子。miRNA與靶基因完全互補(bǔ)結(jié)合，最后切割靶mRNA。在植物中，大部分miRNA采用這種方式進(jìn)行調(diào)控。（2）抑制靶基因的翻譯。作用時(shí)與靶基因不完全互補(bǔ)結(jié)合，進(jìn)而抑制翻譯而不影響mRNA的穩(wěn)定性，此類(lèi)miRNA是目前發(fā)現(xiàn)最多的。但在植物中極少數(shù)miRNA通過(guò)此方式來(lái)抑制靶基因。（3）結(jié)合抑制。具有以上2種作用模式，當(dāng)與靶基因互補(bǔ)結(jié)合時(shí)，直接靶向切割mRNA；當(dāng)與靶基因不完全結(jié)合時(shí)，起著調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用。生物信息學(xué)數(shù)據(jù)顯示，每個(gè)miRNA可以調(diào)節(jié)數(shù)百個(gè)靶基因，這表明miRNA可能影響所有的信號(hào)途徑。最近有證據(jù)表明，miRNA突變或異位表達(dá)與人類(lèi)多種癌癥相關(guān)，miRNA可以起到腫瘤抑制基因或癌基因的功能，miRNA可以抑制重要的腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，可能在癌癥的診斷和治療中起著重要作用[15-16]。如何精確鑒定miRNA所調(diào)節(jié)的靶基因是目前所存在的挑戰(zhàn)之一。由于miRNA和其結(jié)合位點(diǎn)并不是完全互補(bǔ)的，可以存在短的錯(cuò)配和G-U配對(duì)。因此，利用簡(jiǎn)單的BLAST確定其靶基因是不可能的。但是，最近的生物信息學(xué)手段開(kāi)始利用同一家族的成熟miRNA在5′末端具有高度的同源性這一特點(diǎn)。因此，大多數(shù)生物信息學(xué)算法利用一個(gè)包含了成熟miRNA的2～8位的3′UTR的互補(bǔ)序列?，F(xiàn)單個(gè)基因的3′UTR具有幾個(gè)miRNA的結(jié)合位點(diǎn)，這表明miRNA調(diào)控基因表達(dá)存在著復(fù)雜的組合模式。由于miRNA可能調(diào)節(jié)數(shù)個(gè)信號(hào)通路，這些miRNA的缺失或異常表達(dá)可能與疾病相關(guān)，包括腫瘤[17]。

最近研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-455-5p在多種腫瘤中以抑癌基因低表達(dá)狀態(tài)的形式存在[18-20]，但關(guān)于它在CRC的研究并不多見(jiàn)。Yang等[21]研究表明，miRNA-455-5p是作用于靶基因galectin-9在結(jié)腸癌中發(fā)揮靶向調(diào)控作用。筆者前期對(duì)miRNA-455-5p在CRC中的表達(dá)及生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明CRC組織miRNA-455-5p相對(duì)表達(dá)量低于癌旁正常黏膜組織；在經(jīng)轉(zhuǎn)染后的CRC細(xì)胞中，上調(diào)miRNA-455-5p可抑制CRC細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)了PIK3R1是miRNA-455-5p的靶基因之一[11]。這表明miRNA-455-5p發(fā)揮抑癌基因的作用機(jī)制可能與調(diào)控PIK3R1基因的表達(dá)有關(guān)[19]。本研究則關(guān)于miRNA-455-5p對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞株P(guān)IK3R1基因靶向調(diào)控的作用進(jìn)行了研究，采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miRNA-455-5p的靶基因。PI3K分為3類(lèi)，其結(jié)構(gòu)和功能各異。其中研究最廣泛的是Ⅰ類(lèi)PI3K，它是異源二聚體，由1個(gè)調(diào)節(jié)亞基和1個(gè)催化亞基組成，該亞基通常稱(chēng)為p85，含有SH2和SH3結(jié)構(gòu)域，與相應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)的靶蛋白相互作用。而PIK3R1則是PI3K調(diào)節(jié)亞基p85α，各種信號(hào)分子通過(guò)與p85α亞基的結(jié)合后才能激活PI3K[22-23]。AKT是一類(lèi)AGC家族的絲氨酸/蘇氨酸激酶，它是PI3K下游的主要效應(yīng)分子之一，主要通過(guò)直接磷酸化多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子而發(fā)揮作用。PI3K/AKT信號(hào)通路參與調(diào)控下游多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（如AKT、Mtor、XIAP等），在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用[24]。

本研究檢測(cè)了miRNA-455-5p上下調(diào)后PIK3R1 mRNA和蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果表明：抑制miRNA-455-5p后，能促進(jìn)HT-29細(xì)胞PIK3R1、AKT1、MTOR mRNA及蛋白表達(dá)；與模擬劑對(duì)照組比較，上調(diào)miRNA-455-5p 能抑制 HT-29 細(xì)胞 PIK3R1、AKT1、MTOR mRNA及蛋白表達(dá)；這說(shuō)明miRNA-455-5p上下調(diào)對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路具有抑制和激活作用，也說(shuō)明了miRNA-455-5p是通過(guò)PIK3R1基因起調(diào)控作用的，PIK3R1可能是miRNA-455-5p的靶基因之一。雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)是以熒光素為底物來(lái)檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶活性的一種報(bào)告系統(tǒng)。通過(guò)熒光測(cè)定儀測(cè)定熒光素氧化過(guò)程中釋放的生物熒光，可以靈敏、高效地檢測(cè)基因的表達(dá)，是檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動(dòng)子區(qū)DNA相互作用的一種檢測(cè)方法。本研究采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)法分析轉(zhuǎn)錄因子miRNA-455-5p與PIK3R1基因啟動(dòng)子區(qū)DNA的相互作用，結(jié)果表明：hsa-miRNA-455-5p 與 psicheck3-gluc-_PIK3R1-3′UTR-WT_-fluc共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞48h后檢測(cè)的Gluc/Fluc值與 mimics-N與 psicheck3-gluc-_PIK3R1-3′UTR-WT_-fluc共轉(zhuǎn)染48h后比較明顯降低，這說(shuō)明hsa-miRNA-455-5p能與PIK3R1基因的3′UTR結(jié)合，降低PIK3R1蛋白的翻譯水平，即驗(yàn)證了PIK3R1是miRNA-455-5p的靶基因。

綜上所述，miRNA-455-5p對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞株P(guān)IK3R1基因具有負(fù)向調(diào)控作用，PIK3R1基因是miRNA-455-5p調(diào)控的靶基因。而miRNA-455-5p是如何通過(guò)靶基因PIK3R1在PI3K/AKT信號(hào)通路中影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移的機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。