益氣活血方對心力衰竭大鼠心功能的影響及其機(jī)制

邢俊娥，吳鵬，李海沅，張興博

廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530023

慢性心力衰竭(CHF)又稱充血性心力衰竭(簡稱心衰)，是一種中老年人常見而又復(fù)雜的臨床癥狀群，是各種心血管疾病發(fā)展的共同終末階段，病死率極高。近年來，CHF的治療已經(jīng)取得很大的進(jìn)展，特別是隨著血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、β受體阻滯劑及冠狀動脈血管重建術(shù)的應(yīng)用，心衰患者的生存時間明顯延長，病死率顯著下降。然而因人口老齡化程度的日益加深，CHF的發(fā)病率逐年增加，每年CHF死亡人數(shù)并沒有減少，甚至還存在上升趨勢[1]。因此，積極探討CHF的發(fā)病機(jī)制和開發(fā)有效防治CHF的藥物仍是當(dāng)今心血管疾病領(lǐng)域重大課題之一。Wnt/β-catenin信號通路是廣泛存在于多細(xì)胞真核生物中的一條高度保守的信號傳導(dǎo)通路，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、分化等多種生理病理過程。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號通路異常激活可使細(xì)胞及生物體的功能產(chǎn)生障礙或損壞，比如導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大、心肌纖維化[2]，通過干預(yù)此信號通路蛋白的表達(dá)可誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化，從而提高心功能、改善心衰癥狀[3,4]。這使人們逐漸認(rèn)識到Wnt/β-catenin信號通路異常激活可能是心衰發(fā)生發(fā)展中的重要因素。益氣活血方以補(bǔ)心益氣、活血利水為法立方，前期研究表明其能減少心肌組織細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗心衰的作用[5]。2018年5月～2019年5月，本研究通過觀察益氣活血方對心衰大鼠心肌細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路表達(dá)的影響，探討益氣活血方治療心衰的可能機(jī)制，為其在臨床上的應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑 益氣活血方由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供，藥物組成：黃芪20 g、黨參30 g、赤芍15 g、川芎15 g、丹參15 g、麥冬10 g、五味子15 g、茯神15 g、炙甘草8 g，制成每毫升含生藥1.52 g的溶液。氯沙坦片(杭州默沙東制藥有限公司，批號：H20000371，規(guī)格：50 mg/片)；兔抗大鼠Dvl1抗體(Sigma-Aldrich公司)；兔抗大鼠p-GSK-3β(Ser9)抗體(Cell Signaling公司)；兔抗大鼠B-catenin抗體(Epitomics公司)。

1.1.2 動物 健康雄性SD大鼠120只，體質(zhì)量(200±20)g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物許可證編號:SYXK(桂)2013-0005。

1.1.3 儀器 JA203型精密電子天平(上海?？惦娮觾x器廠)；TKR小動物呼吸機(jī)(江蘇特力麻醉呼吸公司)；ML870Br心電圖機(jī)(澳大利亞埃德公司)；MICRO MAXX型彩色多普勒超聲診斷儀(美國索諾聲公司)；Anke TGL-16B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；蛋白質(zhì)電泳與轉(zhuǎn)膜裝置(美國Bio-Rad公司)。

1.2 CHF模型制作 將120只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為造模組100只與假手術(shù)組20只。以10%水合氯醛(0.3 g/kg)腹腔注射麻醉，將其固定于手術(shù)臺，經(jīng)喉行氣管插管術(shù)，連接小動物呼吸機(jī)及心電圖機(jī)，以呼吸頻率80次/min、潮氣量0.7～0.8 mL(按體質(zhì)量調(diào)節(jié))行人工輔助呼吸。左胸前區(qū)備皮去毛，絡(luò)合碘消毒，在左側(cè)第3、4肋間隙橫向切開皮膚，長約1.5 cm，鈍性分離肌層，沿第3、4肋間隙打開胸腔并用開胸器撐開，撕開心包，在動脈圓錐與左心耳之間下約1 mm處用0號絲線結(jié)扎左冠狀動脈前降支，當(dāng)心電圖Ⅰ、Ⅱ?qū)?lián)顯示ST段顯著抬高后，迅速將心臟放回胸腔，擠出胸腔內(nèi)血液和氣體，并立即分層縫合胸壁，開胸時間不超過30 s。待動物狀態(tài)平穩(wěn)后，停止呼吸機(jī)輔助呼吸。術(shù)后連續(xù)3 d腹腔注射青霉素[2.4×104U/(kg·d)]預(yù)防感染。假手術(shù)組手術(shù)過程同上，但僅在冠狀動脈前降支下穿線不結(jié)扎。然后將存活大鼠返籠繼續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)4周，4周后心臟彩色超聲檢測左室射血分?jǐn)?shù)<50%者為CHF模型復(fù)制成功。

1.3 動物分組與給藥 將CHF大鼠隨機(jī)分成4組：模型組、益氣活血方低劑量組、益氣活血方高劑量組和氯沙坦陽性對照組，每組10只，益氣活血方低、高劑量組及氯沙坦陽性對照組分別灌胃3.04、6.08 g/(kg·d)益氣活血方及10 g/(kg·d)氯沙坦；另選擇假手術(shù)組10只，假手術(shù)組及模型組以20 mL/kg蒸餾水灌胃，益氣活血方低劑量組、益氣活血方高劑量組和氯沙坦陽性對照組將藥物溶于等體積蒸餾水中，1次/d，療程4周。

1.4 心功能測定 藥物干預(yù)4周后，利用心臟彩色多普勒超聲診斷儀檢測心功能。具體方法如下：大鼠稱重，以1%戊巴比妥鈉(0.03 g/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位固定，心前區(qū)脫毛，涂抹耦合劑，用心臟超聲探頭(頻率為6～13 MHz)，在二維超聲引導(dǎo)下，運(yùn)用M型超聲經(jīng)胸骨左心長軸切面測量如下指標(biāo)：左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)和左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)，計(jì)算左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和左室短軸縮短率(LVFS)。心臟超聲測定后以頸椎脫臼法處死小鼠，并快速采集心肌組織標(biāo)本，置入-80 ℃凍存待測。

1.5 心肌組織Dvl1、磷酸化GSK-3β(p-GSK-3β)和β-連環(huán)蛋白(β-catenin)表達(dá)檢測 切取-80 ℃保存心肌組織200 mg，勻漿，12 000 r/min離心15 min后取上清液進(jìn)行蛋白測定。SDS-PAGE凝膠電泳，取1 μg蛋白變性后冷卻，加樣，電泳，轉(zhuǎn)膜；轉(zhuǎn)膜后加封閉液，室溫封閉2 h，加入兔抗Dvl1抗體(1∶1 000稀釋)、兔抗p-GSK-3β抗體(1∶1 000稀釋)、兔抗B-catenin 抗體(1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，加入1∶1 000稀釋的ALP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體，37 ℃孵育1 h；漂洗后加顯色劑，避光顯色2～5 min，有顯色條帶出現(xiàn)后用蒸餾水終止顯色反應(yīng)。以GAPDH作為內(nèi)參，進(jìn)行灰度值比較。

2 結(jié)果

2.1 益氣活血方對CHF大鼠心功能的影響 藥物干預(yù)4周后，與假手術(shù)組比較，模型組LVEDD和LVESD增加，LVEF、LVFS減少(P<0.01)；與模型組比較，益氣活血方高劑量組與氯沙坦陽性對照組LVESD縮小(P均<0.01)，益氣活血方高劑量組LVEDD縮小(P<0.05)，益氣活血方低、高劑量組和氯沙坦陽性對照組LVEF和LVFS均升高(P<0.05或<0.01)。結(jié)果見表1。

表1 藥物干預(yù)4周后各組心功能比較

注：與假手術(shù)組比較，△P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，▲P<0.01。

2.2 益氣活血方對CHF大鼠心肌Dvl1、p-GSK-3β和β-catenin表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌Dvl1、p-GSK-3β和β-catenin的表達(dá)升高(P均<0.01)；與模型組比較，益氣活血方低、高劑量組和氯沙坦陽性對照組大鼠心肌Dvl1、p-GSK-3β表達(dá)下降(P<0.05或<0.01)，益氣活血方高劑量組和氯沙坦陽性對照組心肌β-catenin表達(dá)均下降(P均<0.05)。結(jié)果見表2。

表2 藥物干預(yù)4周后各組心肌Dvl1、p-GSK-3β和β-catenin表達(dá)比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05，△P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，▲P<0.01。

3 討論

心衰是各種心臟結(jié)構(gòu)或功能性疾病導(dǎo)致心室充盈和(或)射血能力受損而引起的一組綜合征。其是一個慢性的發(fā)展過程，且病因及病機(jī)也復(fù)雜多變，中醫(yī)學(xué)在疾病的診療中強(qiáng)調(diào)“整體觀念”及“辨證論治”思想，恰恰符合了這種研究思路。關(guān)于本病的病因病機(jī)，《靈樞·經(jīng)脈篇》記載為“手少陰氣絕則脈不通，脈不通則血不流?！薄毒霸廊珪ん@悸怔忡》云：“心脾血?dú)獗咎摚驗(yàn)檎纭奶撗?，神志不寧而驚悸?！薄堆C論》云：“血積既久，其水乃成。”CHF多發(fā)于中老年人，緣由中年之后，臟氣漸衰，或久病體虛，傷耗心氣，導(dǎo)致心臟功能日漸衰竭。現(xiàn)代多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為，心氣虧虛、瘀血阻滯為本病的關(guān)鍵病機(jī)[6,7]。CHF發(fā)病早期，病變以氣虛血瘀為主；中期在氣虛血瘀的基礎(chǔ)上，繼發(fā)痰濁、火熱等致病因素，加劇了患者本身虛實(shí)夾雜的病機(jī)狀態(tài)；晚期久病，陰陽皆損。有關(guān)CHF患者中醫(yī)證候分布規(guī)律研究表明，CHF以氣虛血瘀證為主[8,9]。結(jié)合以前的實(shí)驗(yàn)研究，筆者認(rèn)為益氣活血法是治療心衰的根本。

益氣活血方是本院根據(jù)此病機(jī)特點(diǎn)研制的中藥制劑。該方組方嚴(yán)謹(jǐn)，方中君藥黃芪，功善補(bǔ)氣升陽、利水消腫，故能振奮心陽、化氣利水。黨參、炙甘草健脾益氣為臣藥，能增強(qiáng)黃芪補(bǔ)中益氣之功，以助血行，取“氣為血之帥，氣行則血行”之意。川芎善于活血行氣、赤芍強(qiáng)于散瘀止痛，二者合用后可加強(qiáng)活血化瘀的功用；而祛瘀過猛易傷正，配以養(yǎng)血益氣之品丹參，使祛瘀而不傷正，且三者為同類，可達(dá)到相輔相成之效，共為佐藥。五味子和麥冬能養(yǎng)陰護(hù)心，滋養(yǎng)心血，與丹參一起避免化瘀藥物走竄耗氣傷津血；茯神甘以入心，功善益氣養(yǎng)血，使心神得養(yǎng)，故均為使藥。諸藥合用，虛實(shí)兼顧，攻補(bǔ)兼施，共奏補(bǔ)心益氣、活血利水之功。

近年來大量研究表明，Wnt/β-catenin信號通路在心肌梗死后心室重塑中持續(xù)過度激活，從而加速心衰的進(jìn)程[10,11]。Wnt/β-catenin信號通路是一條多元復(fù)雜的級聯(lián)放大信號傳導(dǎo)通路，參與調(diào)控多種生物學(xué)過程。Dvl1是Wnt/β-catenin信號通路中將胞外信號傳遞到胞內(nèi)的關(guān)鍵性信號分子。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激，Dvl1可通過抑制GSK-3β活性來阻止β-catenin被磷酸化而降解，進(jìn)而在胞質(zhì)中大量聚集并入核，啟動下游靶基因的表達(dá)并發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)作用[12,13]。β-catenin為Wnt/β-catenin信號通路中起著調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性的核心成員，當(dāng)β-catenin處于高表達(dá)狀態(tài)時，Wnt/β-catenin信號通路就處于激活狀態(tài)，相反則為抑制狀態(tài)[14]。GSK-3β是決定胞質(zhì)內(nèi)β-catenin磷酸化及穩(wěn)定的重要激酶，為該信號通路的負(fù)性調(diào)控因子[15]。研究[16]發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號通路的分子參與并調(diào)控完整的心肌細(xì)胞從出生到凋亡的各個過程。生理狀態(tài)下，Wnt/β-catenin信號通路通常是靜止的，而在心血管疾病狀態(tài)下可被異常激活[17]。Dvl-1表達(dá)水平增加可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的肥大，而心肌肥厚后心室重塑是心衰發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。在心肌纖維化中，GSK-3β活性明顯增強(qiáng)[18]，而心肌纖維化是心衰的共同病理學(xué)改變。在損傷心肌凋亡細(xì)胞中，β-catenin水平呈時間依賴性增加[19]。因此，在心肌梗死后CHF的進(jìn)程中，Wnt/β-catenin信號通路起重要作用。本實(shí)驗(yàn)提示益氣活血方在CHF治療中可抑制Wnt/β-catenin信號通路中Dvl1、p-GSK-3β和β-catenin的過表達(dá)，表明益氣活血方具有改善心功能、延緩心衰發(fā)展的療效。

綜上可見，益氣活血方可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路中Dvl1、p-GSK-3β和β-catenin的過表達(dá)來改善心衰早期心肌形態(tài)學(xué)的重構(gòu)、心肌纖維化和心臟的舒縮功能，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。