通瘀煎對ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成的影響及機制

盧素宏 姚麗梅 劉瑤 楊雅琴 林華景

(廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東 廣州 510520)

動脈粥樣硬化(AS)指動脈管壁及其分支管壁內(nèi)膜和內(nèi)膜下出現(xiàn)脂質(zhì)、碳水化合物及血液成分的灶狀沉積，結(jié)締組織和鈣沉積所致，同時出現(xiàn)大量中層平滑肌細胞向內(nèi)膜移動、增殖，導(dǎo)致內(nèi)膜增厚，逐漸形成粥樣病灶或纖維脂質(zhì)斑塊病灶的一種炎癥性疾病，炎癥反應(yīng)貫穿于AS發(fā)生發(fā)展的全過程。研究表明，AS是一種炎癥反應(yīng)性疾病，炎癥反應(yīng)貫穿于AS發(fā)生和發(fā)展的全過程〔1〕，動脈管壁內(nèi)大量炎癥因子的形成和釋放與AS斑塊的形成關(guān)系密切〔2〕。在AS早期，當不穩(wěn)定斑塊出現(xiàn)破裂時，即伴隨炎癥信號通路的激活。因此，及早識別不穩(wěn)定的AS斑塊，探尋敏感而特異的血清學(xué)標志物及相關(guān)炎癥靶點，通過采用調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂、抗炎等治療，減少或阻止AS等血管事件的發(fā)生是現(xiàn)階段研究的熱點之一。目前，防治AS的藥物研究相對較少，臨床常用他汀類藥物，其對AS的防治有一定的作用，但長期服用易導(dǎo)致肝損害等不良反應(yīng)的發(fā)生〔3～5〕。中藥和中藥復(fù)方具有整體調(diào)節(jié)，適應(yīng)證廣泛，毒副作用小等優(yōu)點，在AS的預(yù)防和治療上具有自身獨到的特點。通瘀煎(《景岳全書》)具有活血祛瘀，行氣止痛的功效，臨床主要用于氣滯血積，經(jīng)脈不利，痛極拒按等癥。研究表明，通瘀煎具有治療高脂血癥、改善血液流變學(xué)、抗炎等多種藥理活性〔6〕，提示其可能通過改善脂質(zhì)代謝紊亂及脂質(zhì)沉積、改善血液流變學(xué)等作用對血管壁起到較好的保護作用。本研究擬探討通瘀煎的抗AS作用及其作用機制。

1 材料及方法

1.1實驗動物 8周齡健康雄性SPF級載脂蛋白(Apo)E基因敲除小鼠50只，體重(25.0±2.0)g，購自北京微通利華實驗動物技術(shù)有限公司〔許可證號SCXK(京)2012-0001〕；8周齡SPF級雄性C57BL/6雄性小鼠10只，體重(20.0±2.0)g，購自廣東省動物實驗中心〔許可證號SCXK(粵)2015-0109〕。

1.2通瘀煎藥材組方 當歸尾15.0 g，山楂6.0 g，香附6.0 g，紅花6.0 g，烏藥6.0 g，青皮4.5 g，澤瀉4.5 g，木香2.1 g，均購自康美藥業(yè)。阿托伐他汀鈣片(立普妥，規(guī)格：20 mg×7片)購自輝瑞制藥有限公司；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)購自上海博湖生物科技有限公司。高脂飼料(3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%豬油、81.3%基礎(chǔ)飼料均勻混合而成，以鈷60輻照-輻照劑量25.0 kGy)由廣東省實驗動物中心加工。

1.3儀器及試劑 LBY-N6B型全自動模塊式血液流變儀；生物組織包埋機(TB-718D型)；智能程控生物組織自動脫水機(TC-120S型)；Zeiss-Axioskop20顯微鏡電子顯微鏡、透射電鏡；E-選擇素(E-selectin)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、血管細胞黏附分子(ICAM)-1 ELISA試劑盒、血管內(nèi)皮細胞黏附分子(VCAM)-1 ELISA試劑盒、白細胞介素(IL)-6 ELISA試劑盒、干擾素(IFN)-γ ELISA試劑盒均購自上海拜力生物科技有限公司?？?細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制蛋白(SOCS)1單抗、抗-細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化子(STAT)3單抗、抗-phospho-STAT3(Tyr701)單抗均購自廣州浩瑪生物科技有限公司。

1.4動物分組及給藥 采用隨機數(shù)字表法，50只ApoE基因敲除小鼠隨機分為5組各10只，模型組、陽性藥物組(立普妥組)、通瘀煎低、中、高劑量組均以高脂飼料飼養(yǎng)；C57BL/6雄性小鼠10只為空白組，以普通飼料喂養(yǎng)。實驗第1天起，通瘀煎高、中、低劑量組分別給予通瘀煎26.0、13.0、6.5 g/(kg·d)灌胃給藥；立普妥組給予立普妥5 mg/(kg·d)灌胃給藥(藥物均用0.5% CMC-Na配成混懸溶液后給藥)，空白組、模型組給予等量0.5% CMC-Na灌胃，均持續(xù)給藥12 w。通瘀煎常規(guī)中藥煎煮，經(jīng)減壓旋轉(zhuǎn)濃縮成每毫升相當于1 g生藥的混懸液。

1.5指標檢測 ①小鼠主動脈石蠟冰凍切片，以蘇木素-伊紅(HE)染色，Zeiss-Axioskop20顯微鏡下觀察主動脈管壁形態(tài)學(xué)變化情況。②AxiocanHRc相機拍攝主動脈HE染色切片，用Leica Qwin Image Processing and Analysis軟件分析切片上顯示的AS和血管橫截面管腔面積。③主動脈超薄切片，采用JEM-1200EX型透射電鏡觀察管壁超微結(jié)構(gòu)變化。④血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量的測定； ⑤ELISA檢測血液中黏附分子E-selectin、ICAM-1、VCAM-1的含量及主動脈組織內(nèi)IL-6、IFN-γ、腫瘤壞死因子(TNF)-α的含量； ⑥Western印跡法分析主動脈STAT3、磷酸化(p)STAT3、SOCS1蛋白表達水平。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件進行正態(tài)性檢驗、單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組主動脈組織形態(tài)學(xué) 空白組主動脈形態(tài)規(guī)則完整，內(nèi)膜光滑，沒有出現(xiàn)局部缺損或增厚，內(nèi)彈力層連續(xù)規(guī)整、無斷裂現(xiàn)象，平滑肌細胞呈整齊有序排列，未見炎性細胞浸潤，管腔內(nèi)無贅生物形成。模型組主動脈形態(tài)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯改變，內(nèi)膜明顯增生、增厚，連續(xù)性結(jié)構(gòu)破壞，大量泡沫細胞積聚在管腔內(nèi)、大量膽固醇結(jié)晶堆積，內(nèi)膜增生處明顯的缺損及間斷性鈣化灶和無結(jié)構(gòu)樣壞死物，明顯的AS斑塊纖維帽；中膜亦出現(xiàn)增厚、變形，內(nèi)膜層可見大量的平滑肌細胞堆聚。與模型組比較，各給藥組主動脈根部粥樣斑塊的形成明顯受到抑制，病變程度明顯減輕，其中通瘀煎低劑量組主動脈根部斑塊內(nèi)的脂質(zhì)中心面積相對變小，斷續(xù)性鈣化灶和無結(jié)構(gòu)樣壞死物；通瘀煎高劑量組AS病變程度最輕，僅少量鈣化灶和無結(jié)構(gòu)樣壞死物。見圖1。

圖1 各組主動脈組織病理(HE染色,×200)

2.2各組主動脈粥樣硬化病變相對面積 與空白組〔(0.76±0.11)%〕相比，模型組主動脈病變相對面積〔(26.37±4.59)%〕顯著增加(P<0.01)。與模型組相比，立普妥組〔(9.51±1.68)%〕、通瘀煎低、中、高劑量組主動脈病變相對面積〔(13.68±2.27)%,(12.87±2.55)%,(9.83±1.81)%〕均有明顯減少(P<0.01,P<0.05)。與通瘀煎中、低劑量組相比，立普妥組及通瘀煎高劑量組主動脈病變相對面積較少(P<0.05)。

2.3主動脈電鏡觀察 空白組主動脈內(nèi)皮細胞排列整齊、形態(tài)正常，細胞核完整，內(nèi)彈力膜連續(xù)完整無缺損、厚薄均勻，未發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)空泡形成及膠原纖維增生。模型組主動脈出現(xiàn)一定程度的病理改變，內(nèi)皮細胞出現(xiàn)大量脫落、壞死，壞死處的內(nèi)皮細胞基本消失，出現(xiàn)大量細胞碎片及纖維樣物質(zhì)，大量脂質(zhì)沉積于內(nèi)皮下方，間質(zhì)內(nèi)亦可見大量膠原纖維附著，內(nèi)彈力膜出現(xiàn)連續(xù)性破壞，部分區(qū)域有灶性溶解，大量泡沫細胞浸潤，膠原纖維顯著增多。與模型組比較，各給藥組主動脈超微結(jié)構(gòu)病理改變均有不同程度減輕，其中通瘀煎低濃度組主動脈內(nèi)皮細胞出現(xiàn)少部分脫離，有少量壞死內(nèi)皮細胞，彈力膜呈間斷性破壞，局部可見溶解，散在性脂滴浸潤于內(nèi)皮下層，有少量泡沫細胞堆積及膠原纖維增生出現(xiàn)在中膜內(nèi)；通瘀煎高劑量組內(nèi)彈力膜結(jié)構(gòu)基本完整，AS超微結(jié)構(gòu)改變最少，內(nèi)皮下僅觀察到少許膠原纖維沉積及脂質(zhì)空泡浸潤。見圖2。

圖2 各組主動脈超微結(jié)構(gòu)(透射電鏡，×12 500)

2.4各組血清TC、TG、HDL-C、LDL-C含量比較 與空白組相比，模型組TC、TG及LDL-C顯著升高、HDL-C顯著降低(P<0.01)。與模型組相比，立普妥組與通瘀煎中、高劑量組TC、TG及LDL-C含量明顯降低，HDL-C含量明顯升高(P<0.05,P<0.01)。與模型組相比，通瘀煎低劑量組血脂改善并不明顯(P>0.05)，但有下降的趨勢。與通瘀煎中、低劑量組相比，立普妥組和通瘀煎高劑量組TC、TG及LDL-C含量明顯降低，HDL-C含量明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組血清TC、TG、HDL-C、LDL-C含量比較

與空白組比較：1)P<0.01;與模型組比較：2)P<0.01，3)P<0.05;與通瘀煎中、低劑量組比較：4)P<0.05；表2、3同

2.5各組血清黏附分子含量比較 與空白組相比，模型組血清E-selectin、ICAM-1、VCAM-1含量顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，立普妥組、通瘀煎中、高劑量組血清E-selectin、ICAM-1、VCAM-1含量明顯降低(P<0.01,P<0.05)，通瘀煎低劑量組E-selectin含量顯著降低(P<0.05)，VCAM-1、ICAM-1有下降趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。通瘀煎中、低劑量組ICAM-1、VCAM-1顯著高于立普妥組和通瘀煎高劑量組(P<0.05)，見表2。

2.6各組主動脈內(nèi)炎癥因子的含量比較 與空白組相比，模型組主動脈組織IL-6、IFN-γ、TNF-α含量顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，立普妥組與通瘀煎高劑量組主動脈組織IL-6、IFN-γ、TNF-α含量明顯降低(P<0.01)。通瘀煎中、低劑量組主動脈組織IL-6、TNF-α含量顯著低于模型組且高于立普妥組和通瘀煎高組(P<0.05,P<0.01)。見表3。

2.7各組主動脈STAT3、p-STAT3、SOCS1蛋白表達比較 與空白組相比，模型組主動脈組織STAT3、SOCS1含量顯著降低(P<0.01)，p-STAT3顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，立普妥組、通瘀煎高、中劑量組主動脈組織STAT3、SOCS1含量明顯增高(P<0.05,P<0.01)，p-STAT3含量明顯降低(P<0.01)，通瘀煎低劑量組主動脈組織p-STAT3含量明顯降低(P<0.05)，SOCS1含量明顯增高(P<0.05)。通瘀煎高劑量組p-STAT3含量降低及SOCS1增高顯著優(yōu)于各給藥組(P<0.05)。見表4。

表2 各組血清E-selectin、ICAM-1、VCAM-1含量比較

表3 各組主動脈內(nèi)炎癥因子IL-6、IFN-γ、TNF-α含量比較

表4 各組主動脈組織STAT3信號通路相關(guān)蛋白表達水平比較

與空白組比較：1)P<0.01;與模型組比較：2)P<0.01，3)P<0.05;與通瘀煎中、低劑量組比較：4)P<0.05;與立普妥組比較：5)P<0.05

3 討 論

AS是臨床常見的一種血管病變，是現(xiàn)階段威脅人類健康最為嚴重的心血管疾病之一。目前，人類對AS的研究已經(jīng)由最初單一的血脂變化逐漸發(fā)展到管壁細胞學(xué)、內(nèi)皮功能紊亂、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等多個方面。AS是一種炎癥性疾病，血管內(nèi)、外的炎癥反應(yīng)貫穿于AS發(fā)生發(fā)展的前過程。IL-6是炎癥反應(yīng)瀑布的源頭所在，發(fā)揮著極為重要的介導(dǎo)作用，參與AS的形成和發(fā)展過程，與AS病變程度呈正相關(guān)。IL-6通過與其受體緊密結(jié)合后，可誘導(dǎo)STAT3得以活化，活化后的STAT3(p-STAT3)可參與激活多種基因表達。研究證實，IL-6/STAT3信號傳導(dǎo)通路在AS中可被激活〔7〕，IL-6為源頭所在，其過度表達可激活STAT3信號通路，從而表現(xiàn)出促AS作用〔8〕。事實上，這種慢性炎癥反應(yīng)的發(fā)生，是由VCAM-1、ICAM-1和E-selectin等黏附分子所介導(dǎo)的。AS的形成過程中ICAM-1、VCAM-1、E-selectin等黏附分子介導(dǎo)的炎癥過程，在AS的發(fā)生發(fā)展全程中起著非常重要的作用，可明顯增強聚集反應(yīng)，導(dǎo)致斑塊的形成，并影響粥樣斑塊的穩(wěn)定性〔9，10〕。

本研究中AS小鼠血脂、黏附分子及炎癥因子的各項指標趨勢與主動脈組織病理學(xué)變化大致相符?？梢?，AS模型小鼠存在嚴重的脂質(zhì)代謝紊亂、血清黏附分子及炎癥因子大量生成，這一結(jié)果也進一步驗證實了AS是一種炎癥反應(yīng)，AS的過程伴隨有大量炎癥因子的釋放。本研究提示AS模型主動脈組織中STAT3被活化，主動脈組織及血液中IL-6、IFN-γ、TNF-α等炎癥因子大量表達。通過藥物干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，通瘀煎可糾正或改善AS小鼠脂質(zhì)代謝紊亂，減少血液中黏附分子E-selectin、VCAM-1、ICAM-1及主動脈組織中IL-6、IFN-γ、TNF-α等炎癥因子的含量，誘導(dǎo)SOCS1的蛋白含量表達，減少STAT3的磷酸化，從而抑制增生信號通路IL-6/STAT3的活化，從而顯著抑制或改善AS小鼠血液黏、凝、稠、聚的“血瘀”證狀態(tài)。因此認為，通瘀煎的抗AS作用可能通過抑制IL-6/STAT3信號通路，發(fā)揮其抗炎、抗增生效應(yīng)，從而有效抑制AS斑塊的形成。

綜上，AS狀態(tài)下，主動脈組織中大量IL-6、IFN-γ、TNF-α等炎癥因子的生成，可刺激STAT3增生信號通路的激活，相關(guān)的基因及蛋白表達均呈現(xiàn)出高水平表達。通瘀煎低、中、高劑量均表現(xiàn)出一定的抗AS作用，以高劑量組效果最佳。其可能通過降脂、減少炎癥因子的釋放、抑制主動脈內(nèi)炎癥及增生反應(yīng)的發(fā)生，從而表現(xiàn)出較好的抗AS斑塊形成的作用。此外，在本實驗周期范圍內(nèi)，低劑量的通瘀煎具有一定的抗AS作用，但其對AS小鼠并未呈現(xiàn)出明顯的降脂作用。因此推測，低劑量通瘀煎可能不在其降脂最小有效劑量范圍，其降脂效應(yīng)在一定范圍內(nèi)可能呈劑量依賴性。但通瘀煎低劑量組主動脈根組織病理形態(tài)改變明顯優(yōu)于模型組，未發(fā)現(xiàn)有明顯粥樣斑塊的形成，提示通瘀煎可能有獨立于降脂之外的抗AS作用，這一作用可能是通過其良好的抗炎作用得以實現(xiàn)。