腦得生片中非法染色劑檸檬黃的檢測

逯雯潔，喬亞玲，海平

腦得生片是由三七、川芎、紅花、葛根、山楂五味飲片組成的中藥復(fù)方制劑，具活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)之功效。用于淤血阻絡(luò)導(dǎo)致的眩暈、中風(fēng)，肢體不用、言語不利及頭暈?zāi)垦５劝Y狀；腦動脈硬化、缺血性中風(fēng)及腦出血后遺癥見上述癥候者。處方中紅花藥材被檢出染色劑已有許多的報道［1］，檸檬黃為其常用的染色劑之一。檸檬黃又名酒石黃、酸性淡黃、肼黃等。化學(xué)名稱為1-（4-磺酸苯基）-4-（4-磺酸苯基偶氮）-5-吡唑啉酮-3-羧酸三鈉鹽，為水溶性合成色素。由于部分企業(yè)紅花原藥材的采購、質(zhì)量控制環(huán)節(jié)相對薄弱，未對紅花染色情況加以關(guān)注，造成腦得生片中含有微量檸檬黃。本品為中藥復(fù)方制劑，其他藥味對檢測存在一定的干擾，因此有必要對腦得生片中非法染色物檢測方法進(jìn)行系統(tǒng)的研究，從而更好地控制藥品內(nèi)在質(zhì)量。本研究自2017 年10 月至

2018年10月在查閱相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上［2-5］，建立了腦得生片中檸檬黃的高效液相色譜法全波長掃描紫外檢測（HPLC_DAD）方法，并采用液相-質(zhì)譜聯(lián)用（LCMS）法對陽性結(jié)果加以確認(rèn)，為打擊腦得生片中非法染色提供技術(shù)依據(jù)，保證人民用藥安全有效。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Sartorius BSA 224S-CW 電子天平（德國Sartorius公司）、KQ3200DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、Agilent 1260 型高效液相色譜儀（二極管陣列檢測器，美國安捷倫公司）、Waters 2695 型高效液相色譜儀（二極管陳列檢測器，美國沃特世公司）AB SCIEX Triple Quad 5500 液質(zhì)聯(lián)用色譜儀（三重四級桿，美國AB公司）。

1.2 試劑與藥品 檸檬黃對照試劑（批號30117，純度90.0%購自德國Dr.公司）；乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水（Milli-Q），其他試劑均為分析純。

腦 得 生 片（A 廠，批 號160102；B 廠，批 號160701；C 廠，批號20170101；D 廠，批號160201；E廠，批號160301；F 廠，批號20160403；G 廠，批號170329；H 廠，批號151101；I 廠，批號20170301；J廠，批號20150201；K 廠，批號20151001；L 廠，批號160101；M廠，批號150202、150101、160101；N廠，批號160102；O廠，批號C1610012）。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 Phenomenex Luna C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；流動相A 為乙腈；流動相B 為0.05 mol/L 醋酸銨溶液；梯度洗脫（0～45 min，5%A→45%A）；DAD 檢測器，檢測波長：432 nm；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10μL。理論板數(shù)按檸檬黃峰計算應(yīng)不低于3 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照試劑溶液 稱取檸檬黃對照試劑適量，加70%乙醇制成25μg/mL的對照試劑溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取腦得生片20 片，除去包衣，稱定重量，研細(xì)，取約5 g，精密稱定，精密加入70%乙醇10 mL，稱定重量，超聲處理20 min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，濾過，即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 取檢測未添加檸檬黃的紅花和其他原料藥材，按處方制得陰性樣品。稱取5 g，同供試品溶液制備法，制成陰性溶液。

2.3 專屬性實(shí)驗(yàn) 精密吸取對照試劑溶液與供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀。結(jié)果陽性樣品呈現(xiàn)與對照試劑保留時間相一致的色譜峰，陰性樣品在同一保留時間無相應(yīng)色譜峰出現(xiàn)，見圖1。陽性樣品中，與檸檬黃對照試劑保留時間相一致色譜峰的紫外吸收光譜與檸檬黃對照試劑一致，見圖2。

2.3.1 質(zhì)譜確認(rèn)

2.3.1.1 質(zhì)譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（1.8 μm，50 mm×2.1 mm）；流動相：乙腈（A）一0.02 mol/L 醋酸銨溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，2%A～45%A）；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃。質(zhì)譜檢測參數(shù)：電噴霧負(fù)離子模式（ESI-），檢測方式：一級質(zhì)譜全掃描、多反應(yīng)檢測（MRM）方式；去簇電壓100 V，入口電壓10 V，碰撞能量16～31 V，源溫度450 ℃，碰撞室出口電壓3～12 V。

2.3.1.2 檢測結(jié)果 檸檬黃屬吡唑啉酮類合成色素，檸檬黃在環(huán)上有羧基，較小的碰撞能量就能脫羧釋出CO2，接著同時發(fā)生吡唑啉酮環(huán)的開裂（C-C鍵，N-C鍵）和N-C鍵環(huán)合，生成大量離子。

圖1 HPLC色譜圖：A為對照試劑；B為陽性樣品；C為陰性樣品

圖2 光譜圖：A為對照試劑，B為陽性樣品

檸檬黃精確質(zhì)量為533.950 4，在負(fù)離子模式丟失特點(diǎn)為-3Na+2H，形成m/z 為467 的分子離子峰。以467m/z為母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，選取豐度較強(qiáng)，干擾較小的兩對子離子，進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式檢測。在檸檬黃染色樣品色譜中，相應(yīng)的色譜峰具有與檸檬黃相同的質(zhì)譜特征。見圖3、圖4。

圖3 檸檬黃對照試劑的選擇離子色譜圖：A為m/z 198.1，B為m/z 171.0

圖4 陽性樣品的選擇離子色譜圖：A為m/z 198.1，B為m/z 171.0

2.4 精密度 精密吸取檸檬黃對照試劑溶液（濃度約為25μg/mL），連續(xù)進(jìn)樣5 次，進(jìn)樣量10μL，測得檸檬黃保留時間及峰面積，保留時間RSD為0.20%，峰面積RSD為0.30%。結(jié)果表明精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，室溫下放置，在0、1、2、4、6、12、24 h分別進(jìn)樣10μL進(jìn)行分析，測定峰面積積分值，檸檬黃峰面積積分值的RSD為0.98%。結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，精密稱取6份，按上述方法制成供試品溶液，測定檸檬黃峰面積，結(jié)果檸檬黃色譜峰重現(xiàn)性良好，見圖5。

圖5 腦得生片HPLC色譜圖

2.7 不同儀器及色譜柱的考察 由于不同生產(chǎn)廠家的高效液相色譜儀和色譜柱存在性能上的差異，為考察方法的可行性及通用性，對樣品還進(jìn)行了以下耐用性試驗(yàn)，①采用不同廠家生產(chǎn)的色譜柱。②在不同的儀器上測定。結(jié)果表明耐用性較好。見圖6、圖7，為用Waters 2695 型高效液相色譜儀，Boston Boscherom ODS C18（5μm，250 mm×4.6mm）色譜柱所得色譜圖。

圖6 對照試劑HPLC色譜圖：Waters2695，Boston Boscherom ODS C18

2.8 檢測限 取檸檬黃對照試劑一定量配制一定濃度的對照溶液，按上述液相色譜條件，進(jìn)樣測定，以信噪比法（S/N＝3）測得檸檬黃的檢出限為0.002μg。

2.9 樣品測定 分別對上述15家企業(yè)17批腦得生片樣品進(jìn)行了檢測，判定3 個生產(chǎn)企業(yè)的3 個批號腦得生片檢出有摻偽染色現(xiàn)象：B 廠，批號160701；H 廠，批號151101；L 廠，批號160101。染色物為檸檬黃，且符合上述方法中視為陽性檢出的規(guī)定。

3 討論

圖7 腦得生片HPLC色譜圖：Waters2695，Boston Boscherom ODS C18

紅花染色目的主要為，通過染色增重、摻偽；染色樣品以次充好等。本研究重點(diǎn)考察項目紅花藥材為加水煎煮兩次（共2.5 h）后取清膏入藥。試驗(yàn)中模擬上述生產(chǎn)工藝制成檸檬黃陽性添加模擬制劑進(jìn)行了研究，旨在考察染色劑的熱穩(wěn)定性、配伍穩(wěn)定性等因素。結(jié)果表明：檸檬黃染色劑在生產(chǎn)工藝條件下穩(wěn)定性良好。

檸檬黃作為一類常用染色劑，并非天然產(chǎn)物，非法染色系人為作假行為。采用本研究建立的方法，對腦得生片樣品進(jìn)行了篩查。陽性樣品的檢出，說明中成藥還是存在一定的被化工染料污染情況。針對這種情況后續(xù)還需開展進(jìn)一步的研究，以保證中成藥的安全有效。