黃連-大黃-肉桂復(fù)方及其組分對(duì)人肝癌SMMC-7721及HepG2細(xì)胞增殖的影響

錢(qián)楊楊 吳中華 張靜 潘志強(qiáng) 劉小美

摘要：目的? 觀察黃連-大黃-肉桂復(fù)方及其組分配伍對(duì)人肝癌SMMC-7721及HepG2細(xì)胞增殖的影響，并從PI3K/AKT-FOXO3a通路探討其作用的分子機(jī)制。方法? 體外培養(yǎng)人肝癌SMMC-7721及HepG2細(xì)胞，采用MTT法分別檢測(cè)復(fù)方和復(fù)方中黃連、大黃、肉桂各自主要有效成分小檗堿、大黃素和桂皮醛不同配伍的肝癌細(xì)胞增殖;進(jìn)一步以復(fù)方及有效組分最佳配伍（簡(jiǎn)稱(chēng)“組分”）作用肝癌細(xì)胞24 h，RT-qPCR檢測(cè)PI3K、AKT和FOXO3a mRNA表達(dá)，Western blot檢測(cè)PI3K p110、AKT、p-AKT、FOXO3a和p-FOXO3a蛋白表達(dá)。結(jié)果? 復(fù)方、小檗堿、大黃素和桂皮醛對(duì)肝癌細(xì)胞增殖具有抑制作用，并有較明顯的量效和時(shí)效關(guān)系，小檗堿、大黃素和桂皮醛最佳配伍比例分別為44、23、46 μmol/L;與對(duì)照組比較，復(fù)方和組分均能顯著上調(diào)人肝癌SMMC-7721及HepG2細(xì)胞FOXO3a mRNA表達(dá)，PI3K mRNA表達(dá)也呈上調(diào)趨勢(shì)，SMMC-7721細(xì)胞AKT mRNA表達(dá)顯著下調(diào)，但組分使HepG2細(xì)胞AKT mRNA表達(dá)顯著上調(diào);復(fù)方和組分均可抑制PI3K p110、AKT及p-AKT蛋白表達(dá)，顯著促進(jìn)FOXO3a蛋白表達(dá)，對(duì)p-FOXO3a蛋白表達(dá)有抑制趨勢(shì)。結(jié)論? 復(fù)方和組分均能抑制SMMC-7721、HepG2細(xì)胞增殖，其抗肝癌作用可能與PI3K/AKT的抑制和FOXO3a的激活有關(guān)。

關(guān)鍵詞：黃連-大黃-肉桂復(fù)方;組分配伍;肝癌細(xì)胞;PI3K/AKT-FOXO3a通路

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? 文章編號(hào)：1005-5304（2020）04-0052-07

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201909365

Effects of Coptidis Rhizoma - Rhei Radix et Rhizoma - Cinnamomi Cortex Compound and Its Component on Proliferation of Hepatoma SMMC-7721 and HepG2 Cells

QIAN Yangyang1， WU Zhonghua2， ZHANG Jing3， PAN Zhiqiang1， LIU Xiaomei1

1. School of Basic Medicine， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China;

2. Science and Technology Experiment Center， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine ，

Shanghai 201203， China; 3. College of Acupuncture and Tuina， Shanghai University of

Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China

Abstract： Objective To observe the effects of Coptidis Rhizoma - Rhei Radix et Rhizoma - Cinnamomi Cortex compound and its component compatibility on proliferation of hepatoma SMMC-7721 and HepG2 cells; To explore the action mechanism in the phosphatidylinositol 3-kinase （PI3K） -protein kinase B （AKT） -forkhead factor 3 （FOXO3a） pathway. Methods The SMMC-7721 and HepG2 cells were cultured in vitro. MTT assay was used to determine the effect of Coptidis Rhizoma - Rhei Radix et Rhizoma - Cinnamomi Cortex compound and its main active component compatibility of berberine， emodin and cinnamaldehyde on the proliferation hepatoma cells， respectively. Furthermore， hepatoma cells were treated with the compound and the best compatibility for 24 hours. The mRNA expressions of PI3K， AKT and FOXO3a were detected by RTqPCR， and the protein expressions of PI3K p110， AKT， p-AKT， FOXO3a and p-FOXO3a were measured by Western Blot. Results The inhibitory effects of the compound， berberine， emodin and cinnamaldehyde on the proliferation of hepatoma cells were significant， with obvious dose-effect and time-effect relationship. The optimal compatibility ratio of berberine， emodin and?cinnamaldehyde was 44， 23， 46 μmol/L. Compared with the control group， both compound and component compatibility could significantly up-regulate the mRNA expression of FOXO3a in SMMC-7721 and HepG2 cells， and also up-regulate the mRNA expression of PI3K; the mRNA expression of AKT in SMMC-7721 cells was significantly down-regulated. However， the component compatibility made the mRNA expression of AKT remarkably up-regulated in HepG2 cells; Compared with the control group， compound and component compatibility could inhibit the protein expressions of PI3K p110， AKT and p-AKT， notably promote the protein expression of FOXO3a， and reduce the protein expression of p-FOXO3a. Conclusion Both compound and component compatibility can inhibit the proliferation of SMMC-7721 cells and HepG2 cells. The anti-hepatocarcinoma effect may be related to the inhibition of PI3K/AKT and the activation of FOXO3a.

Keywords： Coptidis Rhizoma - Rhei Radix et Rhizoma - Cinnamomi Cortex compound; component compatibility; hepatoma cells; PI3K/AKT-FOXO3a pathway

肝癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居全球第6位，由于起病隱匿，早期癥狀不明顯，進(jìn)展迅速，侵襲性強(qiáng)，死亡率在全球惡性腫瘤中排第4位[1]。盡管目前肝癌診療技術(shù)已有很大進(jìn)展，但大多患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已至中晚期，治療效果不佳，治愈率仍有限，且常伴有不同程度的毒副作用。因此，從分子和基因出發(fā)，探索新的治療靶點(diǎn)，尋找效果顯著且毒副作用低的藥物尤為關(guān)鍵。中醫(yī)藥對(duì)肝癌有一定療效[2]，在改善癥狀、提高生存質(zhì)量方面有著獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[3]。在肝癌的發(fā)生發(fā)展中，熱、毒、瘀是常見(jiàn)的病理因素[4-6]。本研究選用的黃連-大黃-肉桂復(fù)方，以清熱解毒為主，又兼活血化瘀之功，原方是上海中醫(yī)藥大學(xué)柯雪帆教授治療早期熱盛陰未虛糖尿病患者經(jīng)驗(yàn)方，后期發(fā)現(xiàn)其不僅能有效降低血糖，亦能顯著抑制肝癌細(xì)胞增殖[7]，但作用機(jī)制尚不清楚;同時(shí)有文獻(xiàn)報(bào)道，復(fù)方中3味中藥各自的主要有效成分——黃連有效成分小檗堿、大黃有效成分大黃素、肉桂有效成分桂皮醛單獨(dú)使用時(shí)，均具有抗肝癌的作用[8-10]。鑒于有效成分單獨(dú)應(yīng)用難以體現(xiàn)中藥方劑配伍理論，以及方劑有效組分配伍模式常為闡明復(fù)方起效成分的重要方法，本研究同步觀察復(fù)方及其3味中藥主要有效成分配伍對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用及其作用機(jī)制，以觀察組分配伍能否重現(xiàn)復(fù)方的抗肝癌作用，并基于磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（PKB，又稱(chēng)AKT）-叉頭框轉(zhuǎn)錄因子3（FOXO3，又稱(chēng)FOXO3a）通路比較兩者作用機(jī)理，為復(fù)方及其組分配伍治療肝癌提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1? 實(shí)驗(yàn)材料

1.1? 細(xì)胞株

人肝癌SMMC-7721細(xì)胞及HepG2細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所，為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞株。

1.2? 藥物

黃連-大黃-肉桂復(fù)方由黃連、大黃和肉桂（黃連∶大黃∶肉桂=9∶3∶1）組成，飲片均購(gòu)自上海養(yǎng)和堂張江店，按文獻(xiàn)[7]方法，將三藥粉碎，按比例混合后加入8倍量70%乙醇浸泡30 min，80 ℃加熱回流1 h，過(guò)濾，濾渣加8倍量70%乙醇，80 ℃加熱回流1 h，過(guò)濾，合并濾液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇并將藥物濃縮至1 g原藥材/mL，以氫氧化鈉顆粒調(diào)節(jié)pH值達(dá)7.2，抽濾滅菌，分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂们坝门囵B(yǎng)液和DMSO（終濃度為0.1%）稀釋至所需濃度。

小檗堿和大黃素均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，桂皮醛購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。配制方法：將小檗堿溶解為5 mmol/L母液（水溶），大黃素溶解為40 mmol/L母液（DMSO溶），桂皮醛溶解為5 mmol/L母液（DMSO溶），使用時(shí)再以培養(yǎng)液和DMSO（終濃度為0.1%）稀釋至所需濃度。

1.3? 主要試劑與儀器

胎牛血清（美國(guó)Corning公司），RPMI 1640培養(yǎng)液、胰酶、青霉素-鏈霉素（美國(guó)Gibco公司），Trizol試劑（美國(guó)Ambion公司），Prime Script RT reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqTM（TliRNaseH Plus）Ⅱ（日本Takara公司），PI3K p110、AKT、p-AKT、FOXO3a、p-FOXO3a、GAPDH一抗、Anti-rabbit IgG二抗（美國(guó)CST公司），RIPA裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（增強(qiáng)型）、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、極超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（上海碧云天生物科技公司）。5424R型Eppendorf臺(tái)式離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），NanoDrop2000（美國(guó)Thermo公司），Applied Biosystems實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)Thermo Fisher公司），Elx800型酶標(biāo)儀（Biotek公司），F(xiàn)C-M型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國(guó)ProteinSimple公司）。

2? 實(shí)驗(yàn)方法

2.1? 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌SMMC-7721、HepG2細(xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)在RPMI1640培養(yǎng)液中，置于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2 d換液1次，待細(xì)胞融合率達(dá)90%時(shí)，按1∶2傳代，待傳代3次后用于實(shí)驗(yàn)。

2.2? 分組及給藥

選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SMMC-7721細(xì)胞，常規(guī)消化接種至96孔板，每孔5×103個(gè)細(xì)胞，鋪板過(guò)夜后分別加入不同濃度復(fù)方（0.25、0.5、1.0 mg/mL）及小檗堿（20、40、80 μmol/L）、大黃素（10、20、40 μmol/L）和桂皮醛（45、90、180 μmol/L），同時(shí)設(shè)空白孔和對(duì)照孔，用藥24、48 h后，吸棄培養(yǎng)液，每孔加0.5 mg/mL MTT溶液100 μL，置于37 ℃培養(yǎng)箱4 h后吸棄，再加150 μL/孔DMSO溶液，避光緩慢振搖10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處各孔吸光度（OD值），計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)孔OD值-空白孔OD值）÷（對(duì)照孔OD值-空白孔OD值）×100%，再根據(jù)用藥48 h數(shù)據(jù)，計(jì)算每種藥物半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2.3? 優(yōu)化小檗堿、大黃素和桂皮醛最佳配伍

選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人肝癌SMMC-7721細(xì)胞，常規(guī)消化后接種至96孔板，每孔5×103個(gè)細(xì)胞，鋪板過(guò)夜后，基于小檗堿、大黃素和桂皮醛的IC50，采用U6（64）均勻設(shè)計(jì)表安排小檗堿、大黃素和桂皮醛的用藥劑量，劑量為各藥物的1/6 IC50～I(xiàn)C50，同時(shí)設(shè)空白孔和對(duì)照孔。用藥48 h后，吸棄培養(yǎng)液，MTT法檢測(cè)并計(jì)算各組藥物對(duì)細(xì)胞存活率的影響，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行逐步回歸分析，得回歸方程，確定最佳組分配伍（簡(jiǎn)稱(chēng)“組分”）。

2.4? 肝癌HepG2細(xì)胞增殖測(cè)定

以抑制SMMC-7721細(xì)胞增殖的復(fù)方IC50和組分作用于HepG2細(xì)胞24、48 h，MTT法檢測(cè)其對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用。

2.5? 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)

選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SMMC-7721和HepG2細(xì)胞，常規(guī)消化后接種至6孔板，每孔3×105個(gè)細(xì)胞。按處理因素不同，設(shè)置對(duì)照組、復(fù)方組、組分組，分別給予0.1%DMSO、復(fù)方（0.86 mg/mL，含0.1%DMSO）和組分（小檗堿、大黃素、桂皮醛終濃度分別為44、23、46 μmol/L，含0.1%DMSO）。給藥24 h后，吸棄培養(yǎng)液，收集細(xì)胞，Trizol法提取總RNA，并用Prime Script RT reagent Kit將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s。cDNA用SYBR Premix試劑進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，擴(kuò)增條件：95 ℃、3 min;95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，40個(gè)循環(huán);95 ℃、15 s，55 ℃、15 s，95 ℃、15 s。檢測(cè)基因及引物由Primer3（v.0.4.0）在線(xiàn)軟件設(shè)計(jì)并委托Sangon Biotech公司合成（見(jiàn)表1）。以GAPDH作為內(nèi)參，用2-ΔΔCt表示mRNA相對(duì)表達(dá)量。

2.6? Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)

細(xì)胞鋪板、組別設(shè)置及用藥與“2.5”項(xiàng)下方法相同。用藥24 h后，用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細(xì)胞，BCA法測(cè)定蛋白濃度，將提取的蛋白上樣25 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳，之后將凝膠取下，將蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，封閉，分別加入PI3K p110、AKT、p-AKT、FOXO3a、p-FOXO3a和內(nèi)參GAPDH一抗抗體（p-FOXO3a為1∶250，其余均為1∶1000），4 ℃搖床輕搖孵育過(guò)夜，TBST洗滌，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗，室溫孵育1.5 h，ECL試劑顯色，化學(xué)發(fā)光成像儀曝光顯影并記錄。結(jié)果用Image J分析，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值，作為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

3? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以—x±s表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4? 結(jié)果

4.1? 復(fù)方、小檗堿、大黃素和桂皮醛對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響

復(fù)方、小檗堿、大黃素和桂皮醛作用SMMC-7721細(xì)胞24、48 h后，其細(xì)胞增殖抑制作用見(jiàn)圖1。與對(duì)照組比較，不同濃度復(fù)方（圖1A）、小檗堿（圖1B）、大黃素（圖1C）和桂皮醛（圖1D）對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖抑制有明顯的量效和時(shí)效關(guān)系?；?8 h作用數(shù)據(jù)，計(jì)算各藥物抑制SMMC-7721細(xì)胞增殖IC50分別為黃連-大黃-肉桂復(fù)方0.86 mg/mL、小檗堿62 μmol/L、大黃素33 μmol/L和桂皮醛65 μmol/L。

4.2? 優(yōu)化小檗堿、大黃素和桂皮醛最佳配伍

U6（64）均勻設(shè)計(jì)小檗堿（X1）、大黃素（X2）和桂皮醛（X3）各自濃度，見(jiàn)表2。三者不同比例配伍作用于SMMC-7721細(xì)胞48 h，均可抑制細(xì)胞增殖，細(xì)胞存活率為40%～60%，以各配伍組細(xì)胞存活率（Y）進(jìn)行逐步回歸分析，得多元回歸方程Y=82.486-0.348X1-0.502X2-0.229X3，其中r=0.932，F(xiàn)=149.556，<0.001。根據(jù)該方程，當(dāng)SMMC-7721細(xì)胞達(dá)半數(shù)抑制時(shí)，計(jì)算得小檗堿、大黃素和桂皮醛的濃度分別為44、23、46 μmol/L，以此為最佳組分配伍，作為后續(xù)研究組分組。

4.3? 復(fù)方和組分對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響

復(fù)方和組分作用于HepG2細(xì)胞24、48 h后對(duì)其增殖的抑制作用見(jiàn)圖2。與對(duì)照組比較，復(fù)方和組分對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制有明顯的時(shí)效關(guān)系，藥物作用24 h后，復(fù)方與組分均可抑制細(xì)胞增殖，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001，P<0.05），藥物作用48 h，復(fù)方和組分抑制細(xì)胞增殖效果更明顯（P<0.001）。此濃度對(duì)HepG2細(xì)胞抑制作用與SMMC-7721細(xì)胞近似，后續(xù)將采用該濃度作用于細(xì)胞，進(jìn)行機(jī)制方面的研究。

4.4? 復(fù)方和組分對(duì)人肝癌SMMC-7721及HepG2細(xì)胞PI3K/AKT-FOXO3a相關(guān)基因表達(dá)的影響

SMMC-7721細(xì)胞中，與對(duì)照組比較，復(fù)方組和組分組均可上調(diào)PI3K p110的mRNA表達(dá)，其中復(fù)方組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），復(fù)方組和組分組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;同時(shí)復(fù)方組和組分組均能顯著下調(diào)AKT和上調(diào)FOXO3a的mRNA表達(dá)（P<0.001）。見(jiàn)圖3。HepG2細(xì)胞中，與對(duì)照組比較，復(fù)方組和組分組均顯著上調(diào)PI3K p110和FOXO3a的mRNA表達(dá)，組分組AKT mRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照組和復(fù)方組（P<0.01）。見(jiàn)圖4。

4.5? 復(fù)方和組分對(duì)人肝癌SMMC-7721及HepG2細(xì)胞PI3K/AKT-FOXO3a相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

SMMC-7721細(xì)胞中，與對(duì)照組比較，復(fù)方組和組分組PI3K p110、AKT及p-AKT蛋白表達(dá)顯著降低，組分組下降更明顯;復(fù)方組和組分組FOXO3a蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.05），組分組作用更明顯，p-FOXO3a表達(dá)幾乎無(wú)變化。見(jiàn)圖5。

HepG2細(xì)胞中，與對(duì)照組比較，復(fù)方組和組分組PI3K p110、AKT及p-AKT蛋白表達(dá)有降低的趨勢(shì)，其中組分組AKT蛋白表達(dá)下降明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;復(fù)方組和組分組FOXO3a蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）;復(fù)方組和組分組p-FOXO3a蛋白表達(dá)有下降趨勢(shì)。見(jiàn)圖6。

5? 討論

目前用于肝癌防治的中藥包括復(fù)方及單體或單味藥，復(fù)方因其基于中醫(yī)基礎(chǔ)理論進(jìn)行辨證論治而廣泛使用，但復(fù)方用藥多以飲片湯劑為主，其成分復(fù)雜、質(zhì)量難控、機(jī)理難以闡明等限制了其現(xiàn)代化和標(biāo)準(zhǔn)化的進(jìn)程;而單味藥或單體，特別是單體，其成分清晰，靶點(diǎn)明確，現(xiàn)階段研究日益增多，但使用中缺乏相應(yīng)的中醫(yī)理論支持。本世紀(jì)初興起的基于方劑配伍理論和藥理機(jī)制開(kāi)展的中藥有效組分配伍研究模式，因其質(zhì)量可控、安全有效、機(jī)理清楚，且符合中醫(yī)整體觀、辨證論治用藥的原則，成為目前方劑配伍研究新的發(fā)展趨勢(shì)[11]。值得注意的是，方劑配伍用藥大多通過(guò)提取有效成分或靶向分子構(gòu)成，而忽略了對(duì)機(jī)體整體狀態(tài)的影響，因此在研究組分配伍時(shí)，關(guān)注藥效研究的同時(shí)，也要關(guān)注藥性對(duì)機(jī)體整體的調(diào)節(jié)作用。黃連-大黃-肉桂復(fù)方中，黃連、大黃均屬大寒之品，佐以少量熱性藥肉桂以制之，藥性平緩，發(fā)揮清熱解毒之功，從而達(dá)到抗肝癌效果。組分是將復(fù)方中具有抗肝癌作用的有效組分——小檗堿、大黃素、桂皮醛組合配伍使用，已有研究報(bào)道，三者均與其飲片具有相似的寒熱屬性[12-13]。因此，探索和優(yōu)化有效復(fù)方來(lái)源的組分配伍中藥，有望實(shí)現(xiàn)基于中醫(yī)辨證論治和方劑配伍理論，開(kāi)發(fā)成分清晰、質(zhì)量可控、機(jī)制易于闡明的組分配伍新藥，對(duì)發(fā)揮中藥治療優(yōu)勢(shì)及中醫(yī)藥客觀化和標(biāo)準(zhǔn)化有重要的理論意義，對(duì)臨床也有應(yīng)用價(jià)值。

PI3K/AKT信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)非常重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一，在調(diào)控細(xì)胞代謝、蛋白合成等方面發(fā)揮重要作用[14]。研究發(fā)現(xiàn)，抑制PI3K/AKT通路能抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15-16]。FOXO3a是PI3K/AKT通路下游的一個(gè)重要分子，是FOXO叉頭轉(zhuǎn)錄因子亞家族的成員，也是腫瘤細(xì)胞凋亡周期調(diào)控的關(guān)鍵因子[17]。被AKT磷酸化后，F(xiàn)OXO3a從細(xì)胞核移至細(xì)胞質(zhì)，導(dǎo)致其失活。研究表明，激活FOXO3a可上調(diào)細(xì)胞凋亡因子，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡和周期阻滯，抑制腫瘤發(fā)生和發(fā)展[18]。因此，抑制PI3K/AKT和激活FOXO3a是治療肝癌的有效途徑。

本研究發(fā)現(xiàn)，藥物對(duì)不同細(xì)胞系的作用強(qiáng)度存在差異：復(fù)方及組分均能有效抑制人肝癌SMMC-7721和HepG2細(xì)胞的增殖;同等濃度下藥物對(duì)SMMC-7721細(xì)胞抑制作用強(qiáng)于HepG2細(xì)胞，由此導(dǎo)致藥物對(duì)2個(gè)不同細(xì)胞系PI3K p110-AKT-FOXO3a通路中關(guān)鍵分子mRNA和蛋白表達(dá)的影響趨勢(shì)一致，但以SMMC-7721細(xì)胞各分子變化程度更明顯，提示藥物敏感性存在個(gè)體差異。藥物對(duì)部分分子mRNA和蛋白表達(dá)的調(diào)控不同步：復(fù)方和組分均可致2個(gè)細(xì)胞系PI3K p110的mRNA表達(dá)及HepG2細(xì)胞AKT的mRNA表達(dá)升高，卻能使同一樣本這些分子的蛋白表達(dá)明顯降低，提示藥物雖然能激活這些分子的轉(zhuǎn)錄，卻抑制其翻譯過(guò)程，使其作用功能降低，抑制翻譯的具體環(huán)節(jié)還有待進(jìn)一步研究。復(fù)方與組分部分作用存在差異：在濃度設(shè)置中，復(fù)方和組分均取自致SMMC-7721細(xì)胞半數(shù)抑制的濃度，即對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的抑制作用相當(dāng)，此濃度下組分對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用稍低于復(fù)方，但有關(guān)分子的蛋白表達(dá)變化顯示，組分作用均優(yōu)于復(fù)方。提示除小檗堿、大黃素和桂皮醛外，復(fù)方中其他成分也有抑制肝癌細(xì)胞增殖作用，其機(jī)制除PI3K p110-AKT-FOXO3a通路參與外，可能還有其他途徑，這與復(fù)方多途徑、多靶點(diǎn)發(fā)揮作用的理論相一致;而成分清晰的組分雖然作用強(qiáng)度稍低于復(fù)方，但在靶點(diǎn)選擇上可能更集中，作用強(qiáng)度更大。

綜上，復(fù)方和組分均能抑制人肝癌SMMC-7721及HepG2細(xì)胞的增殖，其機(jī)制可能與PI3K/AKT的抑制和FOXO3a活化有關(guān)，以FOXO3a活化最明顯，兩藥的作用及其機(jī)制存在一定差異。當(dāng)然，肝癌的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，影響因素較多，復(fù)方及組分發(fā)揮抗肝癌作用是否存在其他的靶點(diǎn)，還需進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2019-09-25）

（修回日期：2019-10-15;編輯：華強(qiáng)）

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81503481）;上海中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)基礎(chǔ)理論學(xué)科能力提升項(xiàng)目（A1-Z193020110）

通訊作者：劉小美，E-mail：wfjlxm2005@126.com