載芬維A銨脂質(zhì)體抑制A375黑素瘤細胞裸鼠皮下移植瘤的初步研究

崔艾麗 金玟言 金哲虎

延邊大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，吉林延吉 133000

惡性黑素瘤是惡性度很高的腫瘤之一，好發(fā)于皮膚，盡管在皮膚腫瘤中發(fā)病率較低［1］，但是致死率很高，80%以上的皮膚癌死亡病例由黑素瘤導(dǎo)致［2］。目前手術(shù)仍是治療黑素瘤的主要手段，然而對于無法手術(shù)的患者，目前能使用的化療藥物效果十分有限。因此，亟待尋找新型有效且無毒的抗黑素瘤化療藥物。本課題組在前期實驗中已成功制備載芬維A 銨脂質(zhì)體（4?HPR?L），并在體外實驗中證明 4?HPR?L 能有效抑制黑素瘤 A375 細胞、B16F10細胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡［3?4］。為了進一步驗證4?HPR?L 的安全性和有效性，我們建立黑素瘤荷瘤裸鼠模型，研究其在體內(nèi)對黑素瘤的抑制作用。

材料與方法

一、材料

1.細胞來源：人黑素瘤細胞A375 來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞中心。

2.動物來源：SPF 級BABL/c 健康裸鼠（雌性，4～6 周齡，14～16 g），產(chǎn)自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司［生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016?0006］，于層流架中飼養(yǎng)，2016—2017 年在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所動物房屏障環(huán)境動物實驗室進行實驗，動物實驗許可證號SYXK（京）2014?0023。實驗開始前所有動物在動物房適應(yīng)1 周。實驗過程均按照國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局聯(lián)合中國國家標準化管理委員會發(fā)布的《實驗動物、動物實驗通用要求》進行。

3.試劑與儀器：4?HPR 產(chǎn)自美國 Sigma?aldrich公司，純度98%；細胞膜近紅外熒光探針（DiR）產(chǎn)自海德創(chuàng)業(yè)（北京）生物科技有限公司。脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標記法（TUNEL）檢測試劑盒來自美國羅氏公司。Heppar?1 抗體、Melan?A 抗體產(chǎn)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（R?210）產(chǎn)自瑞士BUCHI 公司，超聲波細胞粉碎機（JY92?IIN）產(chǎn)自寧波新芝生物科技股份有限公司，小動物活體成像儀（IVIS live imaging system 100）產(chǎn)自美國Xenogen公司。

二、方法

1.制備4?HPR?L：采用薄膜-超聲分散法，具體步驟參考文獻［3］。

2.A375 黑素瘤細胞裸鼠皮下移植瘤模型的建立：取對數(shù)生長期A375 細胞，胰酶常規(guī)消化離心，用冷PBS重懸、計數(shù)細胞，最后用不含胎牛血清的高糖 DMEM 培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞為 1.0 × 107/ml。每只裸鼠右腋窩下接種0.2 ml 細胞懸液，每天觀察腫瘤生長情況，用游標卡尺動態(tài)測量并記錄瘤塊大小，稱取體重并記錄。腫瘤體積（V）=0.5×L×D2，其中L為腫瘤長徑，D為腫瘤短徑。

3.DiR和DiR脂質(zhì)體（DiR?L）在體內(nèi)的分布：腫瘤體積達到500 mm3時，選出瘤塊體積均等的荷瘤裸鼠 10 只，隨機分為 DiR 組和 DiR?L 組，每組 5只。藥物制備過程：將DiR 溶于二甲基亞砜，配制0.1 g/L DiR 溶液；采用薄膜-超聲分散法包裹DiR制備DiR?L，避光、低溫保存。通過尾靜脈單次給予 DiR 和 DiR?L，劑量為 10 μg/kg，注射量為 0.2ml。應(yīng)用成像儀于注射后第6、12、24 h觀察DiR和DiR?L在腫瘤及組織中的熒光信號，拍照并記錄。給藥24 h 后，頸椎離斷法處死荷瘤裸鼠，解剖分離心、肝、脾、肺、腎、腫瘤，置于6 孔板中，用成像儀觀察離體器官和腫瘤中的熒光信號強度，拍照并記錄。小動物成像相關(guān)參數(shù)設(shè)置如下：激光濾光片745 nm，發(fā)射濾光片800 nm，曝光時間0.2 s，Bin值為4。圖像處理軟件為Living Imaging Software（Version 4.3.1）。

4.4?HPR?L 體內(nèi)抑制黑素瘤生長實驗：待荷瘤裸鼠腫瘤生長至100 mm3時（接種后第8 天），選出瘤塊體積均等的30 只，隨機分為對照組、4?HPR 組和 4?HPR?L 組，每組10 只，分別經(jīng)尾靜脈每次注射5%（質(zhì)量分數(shù)）葡萄糖注射液0.2 ml、25 mg/kg 4?HPR和4?HPR?L，共給藥8次，分別于接種后第8、10、12、14、16、18、20、22 天給藥，每次給藥前測量體重和腫瘤長徑、短徑，計算體積。末次給藥后第2 天測定體重和腫瘤體積，然后頸椎離斷法處死荷瘤裸鼠，解剖取出心、肝、脾、肺、腎及腫瘤組織，稱取腫瘤重量后浸泡于4%中性甲醛溶液中固定72 h，常規(guī)石蠟包埋、切片，進行后續(xù)檢測。另取30 只同等情況荷瘤裸鼠按同樣方法分組及給藥，飼養(yǎng)至全部死亡，統(tǒng)計、繪制裸鼠生存率曲線。

5.病理檢查：

（1）HE 染色及 TUNEL 檢測：按照常規(guī)方法對心、肝、脾、肺、腎、黑素瘤組織進行HE 染色。黑素瘤組織石蠟切片脫蠟至水，修復(fù)，破膜，按照TUNEL試劑盒說明書步驟檢測。蘇木素染色后細胞核為藍色，DAB 顯現(xiàn)出來的凋亡細胞核為棕黃色顆粒，即為TUNEL 陽性細胞。每張切片隨機選取5 個不重疊高倍視野，采用Image pro plus 6.0 圖像分析軟件分析。計算每個視野的凋亡指數(shù)，然后取平均值。凋亡指數(shù)=陽性細胞面積/整個視野面積×100%。

（2）免疫組化檢測Heppar?1 和 Melan?A 在荷瘤裸鼠肝臟組織的表達：將裸鼠肝臟組織石蠟切片脫蠟至水，30%過氧化氫溶液暴露抗原決定簇，微波修復(fù)，冷卻至室溫，用5%牛白蛋白封閉后加入一抗（Heppar?1 和 Melan?A 抗體）4 ℃過夜。次日清洗一抗，滴加二抗（山羊抗小鼠IgG 聚合物）37 ℃孵育30 min，充分洗滌后DAB 顯色，蘇木素復(fù)染2 min，自來水沖洗，脫水，樹膠封片，顯微鏡下檢查，細胞質(zhì)著色為棕黃色或黃褐色為陽性表達。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié)果

一、A375黑素瘤細胞裸鼠皮下移植瘤模型的建立

裸鼠右腋下接種A375 細胞后第8 天，皮下長出體積為100 mm3的瘤塊，經(jīng)組織病理檢查證實為黑素瘤。

二、DiR和DiR?L在體內(nèi)的分布

荷瘤裸鼠給藥后藥物在體內(nèi)的分布見圖1、2。DiR?L 組在相同時間點吸收藥物較快，在移植腫瘤部位的熒光較強，并且在給藥24 h后腫瘤部位仍可以看到較強的熒光信號。兩組離體器官和腫瘤組織內(nèi)熒光信號分布見圖3。在所有離體組織和腫瘤中，肉眼可見10 只小鼠腫瘤和肝臟組織內(nèi)均有較強的熒光信號，而心、脾、肺、腎組織未見明顯熒光信號。熒光定量分析顯示，DiR?L 組腫瘤組織內(nèi)的熒光強度（22.85 ± 1.66）顯著高于DiR 組（8.45 ±0.97，t= 12.96，P＜ 0.01），與在體小動物成像的結(jié)果一致。

三、4?HPR?L體內(nèi)抑制黑素瘤生長的作用

1.體重變化：見圖4。對照組和4?HPR 組在給藥后早期體重變化不十分明顯，但在后期出現(xiàn)下降，4?HPR?L組體重呈穩(wěn)定上升趨勢。

2.腫瘤體積變化以及離體瘤塊重量：見圖5、6。與對照組和 4?HPR 組相比，4?HPR?L 組腫瘤體積生長曲線比較平緩，增長緩慢。4?HPR?L 組離體瘤重為（0.69 ± 0.12）g，對照組為（1.55 ± 0.19）g，4?HPR 組為（1.12 ± 0.11）g，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=27.055，P＜ 0.05），4?HPR?L 組與后兩組比較，t值分別為4.77、6.64，均P＜ 0.05。

3.4?HPR?L 對荷瘤裸鼠生存率的影響：見圖 7。對照組裸鼠于接種后 56 d 內(nèi)、4?HPR 組在59 d 內(nèi)全部死亡，而 4?HPR?L 組全部死亡時間最長，為76 d。

四、病理檢查結(jié)果

圖1 DiR 組和 DiR?L 組荷瘤裸鼠同時給藥后 6、12、24 h 體內(nèi)藥物分布 DiR?L 組腫瘤部位熒光信號強度在相同時間點明顯高于DiR 組。右側(cè)標尺顏色越淺代表熒光強度越強。DiR：細胞膜近紅外熒光探針；DiR?L：DiR脂質(zhì)體

圖2 DiR 組和DiR?L 組荷瘤裸鼠給藥后6 h 藥物在體內(nèi)分布的三維立體圖 DiR?L 組腫瘤可見明顯熒光，DiR 組腫瘤未見明顯熒光。右側(cè)標尺顏色越淺代表熒光強度越強。DiR：細胞膜近紅外熒光探針；DiR?L：DiR脂質(zhì)體

圖3 DiR 組和DiR?L 組離體器官和腫瘤組織內(nèi)熒光信號比較 DiR?L 組離體腫瘤部位熒光信號強度明顯高于DiR 組。DiR：細胞膜近紅外熒光探針；DiR?L：DiR脂質(zhì)體

圖4 不同給藥組荷瘤裸鼠的體重-時間變化曲線 4?HPR：芬維A銨；4?HPR?L：載芬維A銨脂質(zhì)體

1.HE 染色觀察黑素瘤轉(zhuǎn)移情況：3 組裸鼠心、脾、肺、腎組織均未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶，但在肝臟中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶。對照組10只和4?HPR組10只裸鼠全部發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，而 4?HPR?L 組 10 只中只有 2 只發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，且轉(zhuǎn)移灶的面積、數(shù)量明顯少于其他兩組。各組裸鼠肝臟HE 染色結(jié)果見圖8。對照組和4?HPR組裸鼠肝臟內(nèi)可見多處單個、巢狀排列及分布不規(guī)則的腫瘤細胞團，腫瘤細胞呈圓形或卵圓形，核深染，細胞異形性明顯，可見病理性核分裂象；4?HPR?L組肝細胞核呈紅色，未見腫瘤細胞。

圖5 不同給藥組荷瘤裸鼠腫瘤體積-時間變化曲線 4?HPR：芬維A銨；4?HPR?L：載芬維A銨脂質(zhì)體

圖6 不同給藥組荷瘤裸鼠離體腫瘤體積比較 4?HPR?L 組腫瘤體積明顯小于對照組和4?HPR組。4?HPR：芬維A銨；4?HPR?L：載芬維A銨脂質(zhì)體

圖7 不同組黑素瘤荷瘤裸鼠生存曲線 3組中4?HPR?L組裸鼠全部死亡時間最長。4?HPR：芬維 A 銨；4?HPR?L：載芬維 A 銨脂質(zhì)體

圖8 各組裸鼠黑素瘤肝臟轉(zhuǎn)移情況 對照組和4?HPR 組肝臟內(nèi)可見腫瘤細胞團，腫瘤細胞呈圓形或卵圓形，核深染，細胞異形性明顯，可見病理性核分裂象；4?HPR組未見明顯的核分裂象。4?HPR：芬維A銨；4?HPR?L：載芬維A銨脂質(zhì)體

2.免疫組化法驗證黑素瘤的肝轉(zhuǎn)移情況：Heppar?1 在荷瘤裸鼠轉(zhuǎn)移瘤周圍的正常肝組織中彌漫表達，而腫瘤細胞團中未表達，見圖9A。而Melan?A 在肝組織中黑素瘤轉(zhuǎn)移灶中彌漫陽性，在周圍正常肝組織中未表達，見圖9B。

3.TUNEL 法檢測結(jié)果：對照組凋亡指數(shù)為（12.14 ± 1.33）‰，4?HPR 組為（67.17 ± 15.18）‰，4?HPR?L 組為（152.73 ± 11.27）‰，3 組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F= 167.59，P＜ 0.05），4?HPR?L 組與對照組和 4?HPR 組相比，t值分別為 18.16、11.07，均P＜ 0.05。

討論

圖9 免疫組化染色檢測荷瘤裸鼠黑素瘤肝轉(zhuǎn)移情況 9A：Heppar?1 在周圍正常肝組織中彌漫表達（箭頭示肝臟組織），而腫瘤細胞團中未表達；9B：Melan?A 在肝組織中的惡性黑素瘤轉(zhuǎn)移灶中彌漫陽性（箭頭示黑素瘤組織），在周圍正常肝組織中未表達

4?HPR 是一種維A 酸類衍生物，研究發(fā)現(xiàn)4?HPR 與傳統(tǒng)的維A 酸類化合物不同，其誘導(dǎo)分化作用較弱，促進腫瘤細胞凋亡的作用較強，毒性遠較其他維A 酸類化合物低，可長期使用，耐藥發(fā)生率低，并可單獨或聯(lián)用其他化療藥物抗腫瘤。近年國外一些研究顯示，4?HPR 對多種實體瘤如鱗狀細胞癌、肺癌、膀胱癌、白血病等［5?8］均有直接抑制作用。體外實驗表明，4?HPR 能夠干擾上述多種腫瘤細胞的生物學(xué)行為，發(fā)揮調(diào)節(jié)分化、抗侵襲、抑制生長、誘導(dǎo)凋亡的作用，有較好的治療前景［9?10］。但是，水溶性低及靶向性差等缺點導(dǎo)致4?HPR生物利用度低，限制其在臨床上的進一步應(yīng)用。脂質(zhì)體包載后的藥物具有毒性低、有助于減少用藥劑量等優(yōu)點，并且能有效避免耐藥性，使被包封藥物得到有效保護，藥物釋放控制更有效。

我們成功建立黑素瘤A375細胞裸鼠皮下移植瘤模型，并對4?HPR?L 對黑素瘤的治療效果進行評估。先以親脂性的熒光染料DiR 為探針［11］，通過小動物活體成像儀觀察DiR 和DiR?L 進入裸鼠體內(nèi)后不同時間點各臟器和腫瘤組織對藥物的攝取情況。因DiR 為脂溶性熒光染料，其疏水性及其他理化性質(zhì)與4?HPR類似，而4?HPR本身不具備熒光性質(zhì)［11］，因此選擇 DiR 替代 4?HPR 進行藥物靶向性觀察。結(jié)果顯示，熒光在肝臟中含量較高，即脂質(zhì)體有肝、脾網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的靶向性；而DiR?L 組腫瘤部位的高熒光強度則說明，通過腫瘤的高通透性和滯留效應(yīng)，藥物被動靶向地聚集在腫瘤部位，從而可更好地發(fā)揮藥效，并減少對其他組織細胞的損傷。

對不同給藥組荷瘤裸鼠體重的動態(tài)監(jiān)測顯示，對照組和4?HPR組裸鼠體重增加不明顯，且后期開始下降，可能是腫瘤的惡病質(zhì)和原料藥物本身對機體的系統(tǒng)毒性導(dǎo)致［12］。從給藥后各組裸鼠的腫瘤體積-時間曲線圖可以看出，4?HPR?L 對 A375 黑素瘤具有較強的生長抑制作用，且離體瘤塊重量與在體瘤塊體積數(shù)據(jù)也相一致。在末次給藥后第2 天，對照組和4?HPR 組所有裸鼠均發(fā)生了肝轉(zhuǎn)移，而4?HPR?L組只有2只發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，其他臟器均正常，免疫組化顯示轉(zhuǎn)移灶Melan?A陽性，Heppar?1陰性，說明4?HPR?L 不僅抑制原發(fā)性腫瘤細胞效果良好，而且對預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移同樣有良好的作用。TUNEL檢測結(jié)果證明，4?HPR?L 抑制腫瘤增殖的作用可能與誘導(dǎo)細胞凋亡作用有關(guān)。4?HPR?L 組荷瘤裸鼠生存期最長，說明4?HPR?L 較原料藥可以更有效地延長荷瘤裸鼠的生存期。

綜上所述，4?HPR?L 能夠有效抑制裸鼠皮下黑素瘤體積增長和黑素瘤細胞的轉(zhuǎn)移，并能延長裸鼠的生存周期，且未見動物體重明顯下降、重要臟器損傷等明顯不良反應(yīng)，有望成為臨床上治療黑素瘤的一種新型藥物。但是本文只是通過被動靶向來治療黑素瘤，今后將進一步嘗試連接適當?shù)陌邢虿牧?，??HPR?L 發(fā)揮主動靶向作用殺傷腫瘤細胞，從而起到更好地抑制腫瘤的作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突