類葉升麻苷對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠行為學(xué)和激素變化的影響

陳嘉媛 高莉 羅嘉楠

[摘要] 目的 探討類葉升麻苷對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠行為學(xué)和激素變化的影響。 方法 選取C57 BL/6J小鼠10只作為對照（A組），選取健康A(chǔ)PP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠50只，以體重隨機(jī)分為B組（模型）、C組（多奈哌齊）、D組（類葉升麻苷低劑量）、E組（類葉升麻苷中劑量）、F組（類葉升麻苷高劑量），每組10只。連續(xù)給藥120 d后，進(jìn)行O迷宮實(shí)驗(yàn)，測定小鼠海馬Aβ1-40含量和血清、垂體中各激素含量。 結(jié)果 與A組比較，B組在O迷宮中進(jìn)入開臂距離、時(shí)間均顯著縮短（P < 0.05）;與B組比較，D組在O迷宮中進(jìn)入開臂距離、時(shí)間均顯著延長（P < 0.01），E組在O迷宮中進(jìn)入開臂距離延長（P < 0.05）。與A組比較，B組海馬Aβ1-40含量顯著升高（P < 0.01）;與B組比較，E組海馬Aβ1-40含量顯著降低（P < 0.01）。與A組比較，B組血清促腎上腺皮質(zhì)激素含量顯著升高（P < 0.05）;與B組比較，C組和F組血清促腎上腺皮質(zhì)激素含量顯著降低，F(xiàn)組血清皮質(zhì)醇含量顯著降低（P < 0.05）。與B組比較，D組垂體中促卵泡激素含量顯著降低（P < 0.05）。與A組比較，B組促甲狀腺激素含量顯著降低（P < 0.05）;與B組比較，C組、E組及F組促甲狀腺激素含量顯著升高（P < 0.05或P < 0.01）。與A組比較，B組垂體中生長激素含量顯著降低（P < 0.05）;與B組比較，C組、E組及F組生長激素含量均顯著升高（P < 0.05或P < 0.01）。 結(jié)論 類葉升麻苷可通過調(diào)節(jié)Aβ1-40含量及激素分泌，改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠焦慮情緒，保護(hù)腦神經(jīng)回路，提高記憶能力。

[關(guān)鍵詞] 類葉升麻苷;阿爾茨海默病;行為學(xué);激素變化

[中圖分類號] R-332? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）03（b）-0009-04

[Abstract] Objective To investigate the effects of acteoside on behavior and hormone changes of APP/PS1 double transgenic mice. Methods Ten mice of C57 BL/6J were selected as control （group A）. 50 healthy APP/PS1 double transgenic mice were randomly divided into group B （model）， group C （Donepezil）， group D （low dose of acteoside）， group E （medium dose of acteoside）， group F （high dose of acteoside）， 10 mice in each group. After 120 days of continuous administration， O maze test was carried out， and Aβ1-40 content in hippocampus of mice and the hormone content in serum and pituitary gland were determined. Results Compared with group A， the distance and time of arm opening in group B were significantly shortened （P < 0.05）; compared with group B， the distance and time of arm opening in group D were significantly lengthened （P < 0.01）， and the distance of arm opening in group E was lengthened （P < 0.05）. Compared with group A， the content of Aβ1-40 in group B increased significantly （P < 0.01）; compared with group B， the content of Aβ1-40 in group E decreased significantly （P < 0.01）. Compared with group A， the content of adrenocorticotropic hormone in group B was significantly increased （P < 0.05）; compared with group B， the content of adrenocorticotropic hormone in group C and group F was significantly decreased， and the content of cortisol in group F was significantly decreased （P < 0.05）. Compared with group B， follicle-stimulating hormone content in pituitary gland of group D decreased significantly （P < 0.05）. Compared with group A， thyroid-stimulating hormone content of group B was significantly decreased （P < 0.05）; compared with group B， thyroid-stimulating hormone content of group C， group E and group F was significantly increased （P < 0.05 or P < 0.01）. Compared with group A， growth hormone content in pituitary of group B decreased significantly （P < 0.05）; compared with group B， growth hormone content of group C， group E and group F increased significantly （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Acteoside can improve the anxiety emotion of APP/PS1 double transgenic mice， protect the cerebral neural circuit and improve the memory ability by regulating the content of Aβ1-40 and the hormone secretion.

[Key words] Acteoside; Alzheimer disease; Behavioristics; Hormonal change

阿爾茨海默?。ˋD）是頻發(fā)于老年早期及老年期的一種相當(dāng)復(fù)雜、嚴(yán)重并難以逆轉(zhuǎn)的神經(jīng)退行性疾病[1-2]，其臨床研究結(jié)果指出，下丘腦-垂體-性腺（HPG）軸激素與認(rèn)知、衰老之間存在關(guān)聯(lián)性，提示HPG軸激素的變化與AD的神經(jīng)病理學(xué)有關(guān)[3]。此外，下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸與AD之間也存在一定的關(guān)聯(lián)。這一現(xiàn)象直觀體現(xiàn)在AD女性患者多于男性上，女性對慢性壓力的敏感性增加可能會(huì)增加AD的風(fēng)險(xiǎn)。壓力誘導(dǎo)持續(xù)數(shù)年后易產(chǎn)生淀粉樣斑塊，應(yīng)激激活HPA軸，從下丘腦和外周系統(tǒng)釋放促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CORH），增加了Aβ、tau蛋白高磷酸化和血腦屏障的形成[4]。

類葉升麻苷具多種藥理活性，如抗氧化損傷、神經(jīng)保護(hù)、肝臟保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)、抗AD活性等。新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所新疆維吾爾醫(yī)方劑學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（以下簡稱“本實(shí)驗(yàn)室”）前期研究表明，類葉升麻苷能夠改善AD小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙、焦慮情緒，以及抑制淀粉樣蛋白聚集的作用[5-10]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究類葉升麻苷對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠行為學(xué)和激素變化的影響，以期為類葉升麻苷可通過調(diào)節(jié)激素分泌改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠焦慮情緒提出佐證。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

O迷宮（XR-XZR209，上海欣軟信息科技有限公司）;Luminex分析儀（Lumi-nex-200，USA，Ensprie）;類葉升麻苷（本實(shí)驗(yàn)室自制提取，純度≥98%，201510）;多奈哌齊（北京偶合科技有限公司，純度≥99%，150825）;氯化鈉注射液（石家莊四藥有限公司，1601093103）;烏拉坦（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，T20111110）;酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（上海江萊生物有限公司，批號：JL11386）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)組使用6月齡SPF級APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠50只。對照組選用同月齡同背景的C57 BL/6J小鼠10只。出售單位：南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院，許可證號：SCXK（蘇）2015-0001，合格證號：201802110，由動(dòng)物出售單位提供基因型鑒定報(bào)告。本實(shí)驗(yàn)遵循了單位、地區(qū)或國家所制訂的有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用指南，并經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 分組及給藥

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用EXCEL軟件以SOP隨機(jī)分組法（根據(jù)體重和筑巢實(shí)驗(yàn)結(jié)果）分為A組（C57 BL/6J小鼠，對照組）、B組（模型）、C組（多奈哌齊，2 mg/kg）、D組（類葉升麻苷低劑量，45 mg/kg）、E組（類葉升麻苷中劑量，60 mg/kg）;F組（類葉升麻苷高劑量，90 mg/kg），各10只。連續(xù)給藥120 d。

1.4 O迷宮

將小鼠放置在開、閉臂區(qū)間接點(diǎn)處，面向閉臂區(qū)間。迷宮設(shè)置選擇重心跟蹤法跟蹤識(shí)別，識(shí)別算法中選擇灰度法，調(diào)整灰度值。記錄5 min內(nèi)小鼠穿越開臂區(qū)間的次數(shù)和停留在開臂區(qū)間的時(shí)間。

1.5 測定小鼠海馬中Aβ1-40含量

取處理好的海馬樣品上清，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書測試Aβ1-40的含量。

1.6 血清中促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）及皮質(zhì)醇（CORT）含量測定

取處理好的血清樣本待測。使用“方法分析緩沖液”配置抗體固定珠，用純凈水或去離子水配制質(zhì)量控制，血漿基質(zhì)和“方法洗滌緩沖液”，使用Luminex 200測定血清中ACTH、CORT含量。

1.7 垂體中促甲狀腺激素（TSH）、促卵泡激素（FSH）及生長激素（GH）含量測定

取待測垂體，處理后用Luminnex 200測定TSH、FSH、GH的含量，具體檢測步驟同“1.6”中血清ACTH、CORT含量的測定。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠在O迷宮中進(jìn)入開臂距離及時(shí)間比較

與A組比較，B組在O迷宮中進(jìn)入開臂距離、時(shí)間均顯著縮短（P < 0.05）;與B組比較，D組在O迷宮中進(jìn)入開臂距離、時(shí)間均顯著延長（P < 0.01），E組在O迷宮中進(jìn)入開臂距離延長（P < 0.05）。見圖1。

2.2 各組小鼠海馬Aβ1-40含量比較

與A組比較，B組海馬Aβ1-40含量顯著升高（P < 0.01）;與B組比較，E組海馬Aβ1-40含量顯著降低（P < 0.01）。見圖2。

2.3 各組小鼠血清ACTH及CORT含量比較

與A組比較，B組血清ACTH含量顯著升高（P < 0.05）;與B組比較，C組和F組血清ACTH含量顯著降低，F(xiàn)組血清CORT含量顯著降低（P < 0.05）。見圖3。

2.4 各組小鼠垂體中FSH含量比較

與B組比較，D組垂體中FSH含量顯著降低（P < 0.05）。見圖4。

2.5 各組小鼠垂體中TSH含量比較

與A組比較，B組TSH含量顯著降低（P < 0.05）;與B組比較，C組、E組及F組TSH含量顯著升高（P < 0.05或P < 0.01）。見圖5。

2.6 各組小鼠垂體中GH含量比較

與A組比較，B組垂體中GH含量顯著降低（P < 0.05）;與B組比較，C組、E組及F組GH含量均顯著升高（P < 0.05或P < 0.01）。見圖6。

3 討論

焦慮是AD的重要表現(xiàn)之一[11]。O迷宮可判斷動(dòng)物的焦慮狀態(tài)[12]。本實(shí)驗(yàn)O迷宮結(jié)果提示類葉升麻苷可以緩解APP/PS1模型小鼠由于癡呆造成焦慮的情緒。Aβ為APP中較為重要的一個(gè)片段，現(xiàn)下大部分學(xué)者認(rèn)為，AD發(fā)病過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是APP基因異常代謝產(chǎn)生Aβ沉淀[13-14]。本實(shí)驗(yàn)中ELISA數(shù)據(jù)提示類葉升麻苷可以降低APP/PS1小鼠海馬中Aβ1-40的含量。

CORH在調(diào)節(jié)HPA中起著重要作用[15]。CORH對ACTH釋放的作用被加壓素強(qiáng)烈增強(qiáng)，當(dāng)下丘腦室旁神經(jīng)元被慢性激活時(shí)，加壓素的共同分泌量會(huì)增加。ACTH的釋放導(dǎo)致CORT的釋放，隨后，通過礦皮質(zhì)激素和糖皮質(zhì)激素受體，對海馬體、垂體和下丘腦等施加負(fù)反饋[16-17]。此外，HPA軸與HPG軸之間存在密切的相互作用，兩者均與老年癡呆癥密切相關(guān)[18]。

目前甲狀腺功能異常明顯影響到老年人認(rèn)知功能障礙，其在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)功能調(diào)節(jié)等方面的重要性也日益受到關(guān)注[19]。正常狀況下，垂體分泌TSH，TSH則刺激甲狀腺細(xì)胞分泌甲狀腺素和三碘甲腺原氨酸，以保證HPT軸的穩(wěn)定[20-21]。本實(shí)驗(yàn)中B組實(shí)驗(yàn)鼠體內(nèi)TSH含量明顯降低，打破了甲狀腺激素分泌的穩(wěn)定性，類葉升麻苷則能通過影響HPT軸有效改善甲狀腺激素的分泌，從而達(dá)到防治老年癡呆的目的。

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，類葉升麻苷不同劑量的藥物對不同激素的影響也不盡相同，聯(lián)系行為學(xué)數(shù)據(jù)可知，F(xiàn)組的類葉升麻苷對腦神經(jīng)回路影響較大，且能通過影響激素達(dá)到這一目的，如HPG軸的變化，而D組對小鼠焦慮情緒的緩解有更大幫助。類葉升麻苷對于HPA軸、HPG軸與HPT軸中所含激素的分泌均有良好的改善效果，這無疑為類葉升麻苷在AD中的治療研究打了一劑強(qiáng)心針。

綜上所述，類葉升麻苷能緩解APP/PS1小鼠的躁狂情緒，降低APP/PS1小鼠海馬中Aβ1-40的含量;可有效改善APP/PS1小鼠血液中HPA軸亢進(jìn)的現(xiàn)象;能作用于HPG軸，抑制FSH的分泌;亦能作用于HPT軸，有效地升高TSH、GH。初步提示類葉升麻苷可通過改善焦慮情緒、影響激素變化等途徑起到治防老年癡呆的作用，其作用機(jī)制有待于進(jìn)一步的深入研究。

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（收稿日期：2019-09-24? 本文編輯：李亞聰）