探討TGFβ1、PDGF、VEGF 對特發(fā)性肺纖維化診斷及病情評估的臨床意義

孫 瑩 宋曉萍 孫 偉

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是間質(zhì)性肺病中常見類型，因缺乏有效的治療藥物，導(dǎo)致了診斷后的平均生存時間不足5 年，其醫(yī)療費(fèi)用昂貴，給國家、社會、家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［1-3］。IPF 從早期干咳到進(jìn)行性活動后呼吸困難需經(jīng)歷一個慢性發(fā)展的疾病過程［4］。當(dāng)出現(xiàn)典型的影像學(xué)征象（雙側(cè)胸膜下對稱的蜂窩影）、肺功能改變時，往往已經(jīng)進(jìn)展到中晚期［5］。

特發(fā)性肺纖維化進(jìn)展的主要病理表現(xiàn)為肺間質(zhì)中肌成纖維細(xì)胞的聚集活化后，形成細(xì)胞外基質(zhì)的沉積［6-7］。新近的研究表明，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞反復(fù)損傷是肌成纖維細(xì)胞聚集活化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［8］。肺泡上皮細(xì)胞損傷后通過分泌轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、血小板衍生生長因子（PDGF）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等大量的細(xì)胞因子，過度激活多條纖維化信號通路，如TGFβ／Smad2／3、PDGF／Erk、VEGF／p-Junk 等，一方面致成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，形成細(xì)胞外基質(zhì)沉積；另一方面血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生腫脹，影響換氣功能［9-11］。由此可見，在特發(fā)性肺纖維化病情進(jìn)展過程中，TGFβ1、PDGF、VEGF 細(xì)胞因子扮演重要角色。

資料與方法

一、一般資料

選取2014 年1 月至2018 年12 月在我院住院診斷為IPF 并進(jìn)行治療的35 例患者作為觀察組，18 例Ⅰ期結(jié)節(jié)病患者作為對照組。其中觀察組男性22 例，女13 例，年齡47 ～70 歲，中位年齡57.76 歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①入組患者存在不同程度的呼吸困難及干咳等臨床表現(xiàn)；②診斷標(biāo)準(zhǔn)均符合美國胸科協(xié)會、歐洲呼吸協(xié)會制定的特發(fā)性肺纖維化診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①除IPF 之外的其他間質(zhì)性肺疾病、急性感染、慢性阻塞性肺疾病、惡性腫瘤及自身免疫性疾病患者；②入組患者在治療之前均未經(jīng)過糖皮質(zhì)激素治療。對照組男10 例，女8 例，年齡50～72 歲，中位年齡56.66 歲。對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：①入組患者經(jīng)胸部CT 診斷為肺結(jié)節(jié)?。á衿冢?；②均存在不同程度的呼吸困難、干咳等癥狀。對照組排除標(biāo)準(zhǔn)：①除結(jié)節(jié)病之外的其他肉芽腫性疾病，如：肺結(jié)核、淋巴瘤等；②診斷之前有糖皮質(zhì)激素治療史；③存在肺泡灌洗液檢查禁忌證。

二、檢測方法

1.免疫印跡檢測IPF 患者血清中細(xì)胞因子的表達(dá)：3 000×g 離心IPF 患者血液10 min，收集上清液。制備分離膠及濃縮膠后，每孔加樣50 ～100 μg蛋白，計(jì)算每孔中蛋白質(zhì)樣品的體積，1×PBS 調(diào)整體積為15 μl，再向每個樣品管中加5 μl 4×上樣緩沖液，操作均在冰上進(jìn)行。將制好的膠放在電泳槽中，加滿電泳緩沖液，輕拔梳子，左側(cè)第一個孔道為蛋白Marker，依次在各個孔道中加入樣品。安裝好系統(tǒng)后，4 ℃，110 V 電壓下開始電泳，90 min 后開始轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后PVDF 膜進(jìn)行封閉，封閉結(jié)束后4 ℃孵育過夜孵育一抗；次日PBST 洗膜3 次后孵育二抗2 h，PBST 洗膜3 次，每次10 min，進(jìn)行顯色及圖像分析。

2.支氣管肺泡灌洗（BALF）與血清樣本留?。撼Ｒ?guī)吸入麻醉后行電子纖維支氣管鏡檢查，選擇右肺中葉（B4 或B5）或左肺舌葉作為灌洗部位，注入100 ml 生理鹽水后，經(jīng)紗布過濾回收至離心管（回收率＞40%）。支氣管鏡檢查結(jié)束后立即靜脈采血5 ml。BALF 液于4 ℃，以離心半徑8 cm，1 200 r／min 離心10 min，取上清液。將上清液注入無菌透析袋，在50%聚乙二醇溶液中進(jìn)行濃縮。24 h 后加入生理鹽水，樣本放置-80 ℃冰箱保存。復(fù)溶1／10體積樣本參照《中華醫(yī)學(xué)會呼吸學(xué)分會支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞學(xué)檢測技術(shù)規(guī)范（草案）》進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。離心靜脈血的方法同前），取上清后放置-80 ℃冰箱保存。

3.TGFβ1、PDGF、VEGF 表達(dá)水平測定：雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附（ELISA，購于上海通蔚科技有限公司，生產(chǎn)編號為TWp628035）檢測觀察組和對照組患者血液及支氣管肺泡灌洗液中TGFβ1、PDGF、VEGF 的表達(dá)水平。標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算上述細(xì)胞因子的濃度（U／ml）。

4.肺功能測定：采用意大利MIR 米爾Ⅲ型肺功能儀，記錄第1 秒用力呼氣容積占預(yù)計(jì)值百分比（FEV1%）、用力肺活量占預(yù)計(jì)值百分比（FVC%）、一氧化碳彌散量占預(yù)計(jì)值百分比（DLCO%）。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、兩組患者胸部CT 影像學(xué)比較

影像學(xué)CT 檢查可見兩組之間的差異，觀察組可見雙肺胸膜下對稱的蜂窩或網(wǎng)格樣改變，符合IPF 表現(xiàn)。對照組可見雙側(cè)肺門淋巴結(jié)腫大，肺部未見明顯浸潤影，見圖1。

圖1 結(jié)節(jié)病與IPF 的CT 影像學(xué)表現(xiàn)

二、TGFβ1、PDGF、VEGF 在特發(fā)性肺纖維化患者血清中表達(dá)上調(diào)

在IPF 患者血清中TGFβ1、PDGF、VEGF 是否存在表達(dá)尚不清楚。本研究首次采用免疫印跡的方法檢測患者血清。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，觀察組患者血清中TGFβ1、PDGF、VEGF 表達(dá)明顯升高（P＜0.05），見圖2。

圖2 免疫印跡檢測各組TGFβ1、PDGF、VEGF 的表達(dá)水平

三、TGFβ1、PDGF、VEGF 在特發(fā)性肺纖維化患者BALF 和血清中存在差異性表達(dá)

ELISA 檢測兩組患者的 BALF 及血清中TGFβ1、PDGF、VEGF 細(xì)胞因子的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)IPF 患者BALF 中TGFβ1、PDGF、VEGF 細(xì)胞因子的表達(dá)水平高于對照組（P＜0.05）；IPF 患者血液中上述細(xì)胞因子的表達(dá)水平明顯高于對照組（P ＜0.05）。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示了上述細(xì)胞因子可能參與了肺間質(zhì)纖維化的進(jìn)程，見表1，2。

表1 兩組患者BALF 液中TGFβ1、PDGF、VEGF 的表達(dá)變化

表2 兩組患者血清中TGFβ1、PDGF、VEGF 的表達(dá)變化

四、TGFβ1、PDGF、VEGF 細(xì)胞因子的表達(dá)水平與肺功能及血氧分壓的相關(guān)性

IPF 組患者BALF 及血清中TGFβ1、PDGF、VEGF 細(xì)胞因子的表達(dá)與FEV1%、FVC%、DLCO%pred 呈負(fù)性相關(guān)（P＜0.05）；IPF 組患者BALF 及血清中上述細(xì)胞因子與血氧飽和度呈負(fù)性相關(guān)（P＜0.05）。這說明TGFβ1、PDGF、VEGF 的表達(dá)水平的升高可作為評估IPF 患者的診斷及病情評估，見表3。

討 論

IPF 是間質(zhì)性肺病中常見的疾病類型［12］。目前尚無有效的治療手段阻止其進(jìn)展?，F(xiàn)今診斷IPF患者的主要檢查手段為胸部CT，但當(dāng)胸部CT 確診后多數(shù)病情已進(jìn)展到晚期［13］。因此如何通過無創(chuàng)性檢查對IPF 的病情進(jìn)展盡早評估是目前臨床醫(yī)生面臨的挑戰(zhàn)。

表3 IPF 患者TGFβ1、PDGF、VEGF 與肺功能檢查及血氧分壓的相關(guān)性

IPF 進(jìn)展機(jī)制不明，已有的研究證實(shí)肌成纖維細(xì)胞在肺間質(zhì)中的聚集活化進(jìn)而產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)沉積是IPF 病情進(jìn)展的關(guān)鍵分子機(jī)制［14］。研究表明，肺泡上皮細(xì)胞的反復(fù)損傷后會發(fā)生異常修復(fù)，TGFβ1、PDGF、VEGF 過度分泌，上述細(xì)胞因子可過度活化多條致纖維化信號通路［9-11］。TGFβ／Smad2／3、PDGF／Erk 信號通路的活化使間質(zhì)中的成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞活化［9-10］；VEGF／p-Junk 信號通路的活化使血管通透性增加，間質(zhì)中的炎癥細(xì)胞增加，影響換氣功能［11］。本研究推測：TGFβ1、PDGF、VEGF 細(xì)胞因子的水平變化可作為評估IPF 病情進(jìn)展的指標(biāo)。目前胸部影像學(xué)是診斷IPF 的主要手段，主要表現(xiàn)為沿胸膜下、基底部分布為主的蜂窩影。除了影像學(xué)可作為評估病情進(jìn)展之外，我們猜測TGFβ1、PDGF、VEGF 在血液中的表達(dá)可作為評估疾病進(jìn)展的無創(chuàng)性血清標(biāo)志物。為了驗(yàn)證最初的設(shè)想，本研究發(fā)現(xiàn)TGFβ1、PDGF、VEGF 在IPD 患者血清中表達(dá)水平明顯上調(diào)，這也與國外的研究報(bào)道是相一致。

對IPF 患者進(jìn)行肺泡灌洗液分類有助于治療方案的選擇［15］。因此本研究除采集IPF 患者血液樣本外，也搜集了患者的BALF。研究結(jié)果顯示IPF患者血液及BALF 液中TGFβ1、PDGF、VEGF 表達(dá)水平均明顯升高。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果均說明TGFβ1、PDGF、VEGF 與IPF 患者的病情進(jìn)展有密切關(guān)系。因此，本項(xiàng)目將上述細(xì)胞因子的表達(dá)情況與肺功能檢查及血氧飽和度監(jiān)測具有相關(guān)性進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。

IPF 從診斷到病情評估會涉及多學(xué)科協(xié)作，如病理科、影像科、免疫風(fēng)濕科等［16-17］。目前胸部CT可作為診斷IPF 的主要工具，但在疾病早期因缺乏特異性影像學(xué)表現(xiàn)而無法精準(zhǔn)的評估病情［18］。雖然肺組織病理檢查是確診IPF 的金標(biāo)準(zhǔn)，但是實(shí)際可行性及可操作性非常低，臨床開展十分困難，對病情的評估也缺乏一定的準(zhǔn)確性［19］。目前評估IPF患者病情進(jìn)展的主要癥狀為進(jìn)行性呼吸困難，臨床中主要依靠肺功能及血?dú)夥治觯?0］。 為了檢測TGFβ1、PDGF、VEGF 是否與肺功能檢查及血氧飽和度的相關(guān)性，本實(shí)驗(yàn)將ELISA 檢測IPF 患者中TGFβ1、PDGF、VEGF 表達(dá)水平與肺功能及血氧飽和度的數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以驗(yàn)證上述細(xì)胞因子是否可作為無創(chuàng)性評估IPF 病情進(jìn)展的有效指標(biāo)。通過對IPF 患者的BALF 液及血清中TGFβ1、PDGF、VEGF與肺功能的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：上述細(xì)胞因子的表達(dá)水平與FEV1%、FVC%及一氧化碳彌散呈明顯的負(fù)性相關(guān)。有趣的是上述細(xì)胞因子的表達(dá)水平與血氧飽和度也呈負(fù)性相關(guān)，其中以TGFβ1 最為顯著。TGFβ1 目前也是公認(rèn)的強(qiáng)烈致器官纖維化細(xì)胞因子。

本文分別從分析TGFβ1、PDGF、VEGF 表達(dá)水平與肺功能及血氧飽和度的相關(guān)性分析可看出，無論血液還是BALF 液指標(biāo)均與上述細(xì)胞因子呈明顯的負(fù)性相關(guān)。故本研究認(rèn)為血液中上述細(xì)胞因子檢測可作為診斷IPF 患者及監(jiān)測病情進(jìn)展的客觀指標(biāo)。但是本研究仍有不足之處，比如時間較短，樣本病例數(shù)較少，且未對患者進(jìn)行治療前后及全程隨訪的動態(tài)觀察，因此仍需深入研究。