叢生蛋白異常表達(dá)對(duì)子宮內(nèi)膜癌早期診斷的意義

胡慶偉 鄧再興 吳雯君 王培麗

子宮內(nèi)膜癌是在無(wú)孕激素拮抗的雌激素長(zhǎng)期作用下，子宮內(nèi)膜發(fā)生增生、不典型增生繼而癌變，這是一個(gè)長(zhǎng)期的細(xì)胞生物學(xué)行為由正常演變?yōu)楫惓５倪^(guò)程。子宮內(nèi)膜癌除了有年輕化的趨勢(shì)，2008 年后更已成為發(fā)病率最高的女性生殖道惡性腫瘤[1]。早期的子宮內(nèi)膜癌預(yù)后較好，晚期則出現(xiàn)貧血、消瘦及惡病質(zhì)，對(duì)各種治療不能滿意。叢生蛋白（clusterin，CLU）與多種腫瘤關(guān)系密切，參與一些腫瘤的形成，但在子宮內(nèi)膜癌前病變特別是早期癌變方面研究較少[2]。本研究檢測(cè)CLU 在子宮內(nèi)膜各種病變組織表達(dá)，探討其在預(yù)警子宮內(nèi)膜癌前病變和早期癌變的價(jià)值，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2016 年6 月—2017 年12 月浙江省湖州市婦幼保健院就診婦科病患者的子宮內(nèi)膜作為研究對(duì)象，經(jīng)病理診斷分兩組。研究組53 例，其中子宮內(nèi)膜不典型增生28 例，子宮內(nèi)膜癌25 例；對(duì)照組57 例，其中正常子宮內(nèi)膜28 例，子宮內(nèi)膜非不典型增生29 例。子宮內(nèi)膜不典型增生根據(jù)顯微鏡下病變的范圍分為局限型16 例和彌漫型12 例（局限型病變≤子宮內(nèi)膜的1/3，彌漫型病變范圍鏡下＞子宮內(nèi)膜的1/3）[3]。子宮內(nèi)膜癌均為子宮內(nèi)膜樣腺癌，根據(jù)2009 年FIGO 分期[4]分別為Ia 期14 例，Ib期7 例，II 期4 例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)（批號(hào)2016-008），患者及家屬均知情同意。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)《女性生殖道病理學(xué)》（第6 版）[5]和WHO Classification of Tumours of Female Reproductive Organs[6]為診斷依據(jù)進(jìn)行病理診斷。

1.3 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本均經(jīng)手術(shù)治療而獲得，且病理符合研究要求；（2）在接受治療前6 個(gè)月內(nèi)未使用雌、孕激素或促性腺激素釋放激素類似物等的激素類治療；（3）心、肝、腎等重要器官無(wú)嚴(yán)重疾病，無(wú)血液系統(tǒng)疾??；（4）簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）具有嚴(yán)重的家族遺傳病史；（2）近6 個(gè)月有妊娠史或哺乳史；（3）放置宮內(nèi)節(jié)育器者。

1.4 研究方法 受體蛋白表達(dá)的測(cè)定采用MaxVision一步法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。原液試劑購(gòu)自Abcam 香港公司。免疫組化操作嚴(yán)格按使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，具體操作如下：組織蠟塊4μm 連續(xù)切片，脫蠟，新配制的3%過(guò)氧化氫滅活內(nèi)源性酶15min，微波爐加熱15min，修復(fù)抗原，自然冷卻。然后滴加非免疫羊血清以阻斷組織中的非特異性結(jié)合，接著依次滴加一抗（clustein 單抗，稀釋度clustein 單抗1：200）、二抗（羊抗鼠IgG）、DAB 顯色3～5min。蘇木精復(fù)染，脫水，透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察。用PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.5 染色陽(yáng)性結(jié)果判斷[7]免疫組化切片嚴(yán)格質(zhì)量控制，判讀采用雙盲法，由2 位高年資醫(yī)生單獨(dú)閱片。CLU 陽(yáng)性為在腺上皮細(xì)胞的胞膜及胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃褐色顆粒，按染色深淺及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)多少，分為：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞（-）、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%或染色極淡（±），評(píng)分為0 分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)10%～50%或染成淺棕色（+），評(píng)分為1 分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)50%～75%或介于深淺棕色之間（++），評(píng)分為2 分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞75%或深棕色（+++），評(píng)分為3 分。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t 檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 研究組年齡（51.15±1.49）歲，體質(zhì)指數(shù)（BMI）（23.16±0.28）kg/m2，對(duì)照組年齡（50.77±1.41）歲，BMI（22.41±0.29）kg/m2，兩組一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），具有可比性。

2.2 子宮內(nèi)膜各種病變組織CLU 染色情況 正常子宮內(nèi)膜增殖期，腺體排列規(guī)則，稀疏，腺上皮無(wú)異型，腺上皮未著色（見(jiàn)圖1A）。子宮內(nèi)膜非不典型增生，腺體排列較規(guī)則、稀疏，腺上皮輕度異型，腺上皮未著色（見(jiàn)圖1B）；子宮內(nèi)膜不典型增生，腺體排列較子宮內(nèi)膜非不典型增生不規(guī)則、相對(duì)密集，腺上皮中度異型，腺上皮細(xì)胞質(zhì)均呈輕度黃褐色著色，判定為（+）（見(jiàn)圖1C）。子宮內(nèi)膜癌，腺體排列不規(guī)則、密集，部分呈篩狀、乳頭狀、實(shí)性，腺上皮重度異型，腺上皮細(xì)胞質(zhì)均呈中度彌漫性黃褐色著色，判定為（++）（見(jiàn)圖1D）。染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及強(qiáng)度子宮內(nèi)膜癌比子宮內(nèi)膜不典型增生更多、更強(qiáng)。

圖1 叢生蛋白在子宮內(nèi)膜各種組織表達(dá)（MaxVision 一步法染色DAB 顯色，200 倍）

2.3 研究組和對(duì)照組子宮內(nèi)膜組織CLU 表達(dá) CLU在研究組與對(duì)照組表達(dá)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)差異有顯著性（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 研究組和對(duì)照組子宮內(nèi)膜組織CLU 表達(dá)比較（例）

2.4 子宮內(nèi)膜不典型增生和子宮內(nèi)膜癌組織CLU表達(dá) CLU 在子宮內(nèi)膜不典型增生和子宮內(nèi)膜癌各亞組組織表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。CLU 在子宮內(nèi)膜不典型增生的局限性與彌漫性組織表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在子宮內(nèi)膜癌組的組織中，無(wú)論是Ia 期、Ib 期與II 期三者比較，抑或是Ia 期和Ia 期以上期別兩組進(jìn)行比較，CLU 表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 子宮內(nèi)膜病變各亞組組織CLU 表達(dá)（例）

3 討論

CLU 最早在綿羊睪丸膜體液中被提取分離，是一個(gè)單拷貝基因，定位于8p21-p12，由高度保守的基因編碼，也稱異二聚體硫酸糖蛋白（SGP-2）[8]。CLU主要有兩個(gè)蛋白亞型，分泌型叢生蛋白（sCLU）和核型叢生蛋白（nCLU），在特定情況下nCLU 會(huì)向sCLU轉(zhuǎn)化[9]，而電離輻射或轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）治療可以誘導(dǎo)nCLU 的產(chǎn)生[8]。CLU 廣泛分布于各種組織和器官，許多生物效能逐步被發(fā)現(xiàn)，如細(xì)胞相互作用、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞保護(hù)、促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、陪伴分子功能等[10]。

CLU 分布廣泛，不同組織均存在CLU 受體，而且研究發(fā)現(xiàn)最可能通過(guò)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子b 受體Ⅰ型和Ⅱ型（TbR1 and TbR2）而存在[10]。另外，在細(xì)胞內(nèi)激酶區(qū)域發(fā)現(xiàn)有CLU 結(jié)合；盡管TGF-bs 定位在子宮內(nèi)膜，但只有TbR2 在子宮內(nèi)膜腺體、平滑肌細(xì)胞和免疫細(xì)胞顯示存在，說(shuō)明子宮上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞是CLU 的主要來(lái)源，腺體、脈管和平滑肌細(xì)胞存在不同的選擇性CLU 受體復(fù)合物。Brown 等[11]認(rèn)為，晚分泌期CLU 的表達(dá)與此時(shí)孕酮水平下降、組織再生有關(guān)，上皮細(xì)胞可能促使CLU 增多。本研究發(fā)現(xiàn)CLU 在研究組組織表達(dá)明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）。子宮內(nèi)膜的持續(xù)增生繼而發(fā)生癌變是內(nèi)膜缺乏孕激素拮抗的后果，CLU 這種隨著子宮內(nèi)膜疾病進(jìn)展而表達(dá)增多增強(qiáng)提示它的異常表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌前病變甚至癌變存在一定的相關(guān)性。

CLU 與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切。CLU 敲除的小鼠對(duì)化學(xué)方法誘導(dǎo)更敏感，更易誘發(fā)皮膚腫瘤；組織特異性敲除還可使前列腺上皮細(xì)胞很高比率地轉(zhuǎn)化為前列腺上皮腫瘤或分化成熟的腺癌[12-13]。Lee等[14]發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌細(xì)胞系中通過(guò)PACAP 下調(diào)CLU的表達(dá)和分泌，可抑制裸鼠異種嫁接腫瘤的生長(zhǎng)。CLU 在不同的腫瘤表達(dá)存在差異，除了少數(shù)腫瘤低表達(dá)外，大多數(shù)腫瘤均高表達(dá)。Won 等[15]在子宮內(nèi)膜癌ECC-1 和KLE 細(xì)胞系檢測(cè)到CLU 的表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)雌激素通過(guò)CLU 的高表達(dá)提高子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系對(duì)紫杉醇的耐藥性。本研究結(jié)果顯示，隨著病變的范圍和嚴(yán)重程度的增加，子宮內(nèi)膜從不典型增生進(jìn)展到癌癥，CLU 的表達(dá)增強(qiáng)（P<0.05），這提示CLU早期預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜的癌變，可作為子宮內(nèi)膜癌早期診斷的重要標(biāo)志物。臨床研究顯示，sCLU 與腫瘤轉(zhuǎn)移、再發(fā)相關(guān)，是預(yù)后不良的指標(biāo)[8]。本研究結(jié)果還顯示，無(wú)論是Ia 期、Ib 期與II 期三者的比較，抑或是Ia期和Ia 期以上期別兩組進(jìn)行比較，CLU 的表達(dá)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），沒(méi)有得出相類結(jié)論可能與本研究的樣本量尚不足有關(guān)。Zheng 等[16]研究肝細(xì)胞癌時(shí)發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌與非癌組織相比，無(wú)論mRNA 還是蛋白水平sCLU 表達(dá)均明顯增高，與腫瘤的分化、分級(jí)有關(guān)；而且沉默sCLU 的基因轉(zhuǎn)錄可抑制肝癌細(xì)胞的集落形成和增殖，降低試管內(nèi)AKT 和GSK-3β 磷酸化水平，明顯抑制活體肝細(xì)胞癌異種移植。這些都提示致瘤性的sCLU 不僅是早期指標(biāo)，還是新型的潛在的分子靶向療法。

綜上所述，CLU 的異常表達(dá)不僅與許多疾病相關(guān)，而且還與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密不可分。本研究結(jié)果提示，CLU 的高表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌前病變及早期內(nèi)膜癌存在相關(guān)性，可作為早期診斷子宮內(nèi)膜癌的重要標(biāo)志物。