陸地棉蔗糖磷酸合成酶基因家族的鑒定及表達(dá)分析

晁毛妮，胡海燕，付麗娜，溫青玉，胡根海，駱雨鋒，李婭楠，王清連*

（1.河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院/ 現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南新鄉(xiāng)453003；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，鄭州450002）

蔗糖是植物光合作用的主要產(chǎn)物，對(duì)于植物的生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量形成至關(guān)重要[1]。 蔗糖磷酸合成酶（Sucrose phosphate synthase, SPS）是調(diào)控植物葉片中蔗糖合成的關(guān)鍵限速酶，在植物光合產(chǎn)物的積累與分配方面發(fā)揮著重要作用[2-3]。 鑒定和克隆植物的SPS基因，并通過(guò)分子手段調(diào)控SPS的表達(dá)或活性，可能是提高植物蔗糖含量，實(shí)現(xiàn)植物高產(chǎn)目標(biāo)的1 條重要途徑。

在植物中，蔗糖磷酸合成酶是1 個(gè)多基因家族，不同物種中家族成員數(shù)量差異很大[4]。 目前，已從擬南芥[5]、玉米[4]、甘藍(lán)型油菜[6]和蘋(píng)果[7]等物種中分別鑒定到 4、7、11 和 8 個(gè)SPS基因。 對(duì)已鑒定和克隆的SPS基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，高等植物的SPS基因家族大致可分為 A、B 和C 三個(gè)亞族[5]，而禾本科植物還有 1 個(gè) D 亞族[4,8]。 不同亞族間，SPS基因的表達(dá)特性差異很大。 例如，玉米SPS 基因家族的 7 個(gè)基因中，ZmSPS1、ZmSPS6和ZmSPS7 主要在葉片中表達(dá)，ZmSPS2 在葉片和 花 粉 中 高 表 達(dá) ， 而ZmSPS3、ZmSPS4 和ZmSPS5 在各個(gè)組織均表達(dá)量很高[4]。 植物SPS家族成員不同的組織表達(dá)模式，暗示著它們?cè)谥参锷L(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中可能起著不同的作用。

目前，在多個(gè)物種中開(kāi)展關(guān)于SPS基因功能的研究發(fā)現(xiàn)，SPS基因在植物蔗糖的合成和積累、生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)的形成，以及光合產(chǎn)物的分配等多個(gè)方面均起著重要作用。 例如，抑制水稻OsSPS1 基因的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致其株高降低，且控制株高的數(shù)量性狀位點(diǎn) （Quantitative trait locus,QTL） 與蔗糖磷酸合成酶基因OsSPS1 共定位[9]，表明OsSPS1 基因在調(diào)控水稻株高方面起著重要作用。 在煙草和馬鈴薯中，過(guò)表達(dá)來(lái)自玉米的ZmSPS基因， 轉(zhuǎn)基因植株的產(chǎn)量和干物質(zhì)質(zhì)量均顯著提高[10-11]。 此外，SPS 的活性與植物體內(nèi)蔗糖含量也密切相關(guān)。 SPS 活性常常作為高粱蔗糖含量的重要標(biāo)記[12]。 對(duì)菜用大豆籽粒蔗糖變化規(guī)律進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，較高的SPS 活性有利于大豆籽粒中蔗糖的積累，且蔗糖含量高的材料SPS 活性顯著高于蔗糖含量低的材料[13]。 對(duì)SPS 活性與光合產(chǎn)物淀粉和蔗糖含量之間的關(guān)系進(jìn)行進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SPS 活性與淀粉含量之間存在負(fù)相關(guān)，與蔗糖含量之間存在正相關(guān)[14]，且SPS 活性的高低會(huì)影響植物蔗糖/ 淀粉比值[15-16]，表明SPS在光合產(chǎn)物的分配方面也起著重要作用。

棉花是重要的經(jīng)濟(jì)作物，提高棉花的產(chǎn)量和纖維品質(zhì)一直是棉花育種的主要目標(biāo)[17-18]。 在棉花中，過(guò)表達(dá)菠菜SPS基因可促進(jìn)棉花葉片中蔗糖的合成，改善纖維品質(zhì)[15]，表明SPS基因在改善棉纖維品質(zhì)方面具有很大潛力。 然而，關(guān)于棉花蔗糖代謝關(guān)鍵基因挖掘及功能研究的工作較少，目前還未對(duì)棉花SPS基因家族進(jìn)行系統(tǒng)鑒定和表達(dá)特性分析。 本研究基于最新公布的陸地棉基因組序列[19]，對(duì)陸地棉SPS基因家族進(jìn)行全基因組鑒定，并對(duì)SPS基因的編碼蛋白結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系和表達(dá)特性等進(jìn)行了深入研究，為今后深入研究SPS基因的功能及棉花產(chǎn)量的提高提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料為陸地棉品種百棉1 號(hào)，種植于河南科技學(xué)院?jiǎn)讨x試驗(yàn)田（河南省新鄉(xiāng)市紅旗區(qū)洪門(mén)鎮(zhèn)），常規(guī)田間管理。 取開(kāi)花期棉株的根、莖、葉片、花瓣和初鈴期的纖維，立即速凍于液氮中，并保存于–80 ℃冰箱， 用于GhSPS基因的表達(dá)特性分析。

1.2 陸地棉SPS家族基因的全基因組鑒定

從http://ibi.zju.edu.cn/cotton 網(wǎng)站下載最新公布的陸地棉基因組數(shù)據(jù)（TM-1_V2.1）[19]，并建立本地Blast 數(shù)據(jù)庫(kù)。 擬南芥SPS 家族成員At-SPSA1 （At5g20280）、AtSPSA2 （At5g11110）、At-SPSB（At1g04920）和AtSPSC（At4g10120）的蛋白序列[20]從擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站（https：//www.arabidopsis.org/）下載。以擬南芥SPS 家族成員的蛋白序列作為目標(biāo)序列， 運(yùn)行BLASTP 檢索程序（e value＜1e－10），初步獲得候選基因。 然后將這些候選基因的蛋白序列提交到Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)域 （Pfam ID：PF00534 和PF05116）驗(yàn)證[21]，最終鑒定出陸地棉 SPS 基因家族的成員。

1.3 序列分析

利用BioXM 2.6 軟件分析陸地棉SPS 家族成員的蛋白序列長(zhǎng)度及理化性質(zhì)（分子量和等電點(diǎn)）；利用ClustalX 軟件進(jìn)行蛋白的多序列比對(duì)，比對(duì)后的序列用GeneDoc 進(jìn)行編輯。

1.4 進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建及基因結(jié)構(gòu)示意圖的繪制

擬南芥、水稻、煙草和高粱SPS 家族成員的蛋白序列從NCBI 網(wǎng)站進(jìn)行下載； 從Cottongen網(wǎng)站（https://www.cottongen.org/）下載海島棉、雷蒙德氏棉和亞洲棉SPS 家族成員的蛋白序列。利用Mega 5.02 軟件中的鄰近法（Neighbor joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[22]，其中校驗(yàn)參數(shù)bootstrap 值設(shè)置為 1 000，選擇 p 距離（p-distance）模型，空位缺失數(shù)據(jù)的處理為成對(duì)刪除（Pairwise deletion）。 利用 GSDS 在 線 工 具 （http://gsds.cbi.pku.edu.cn/），根據(jù)基因的編碼區(qū)序列和基因組序列，繪制基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)示意圖。

1.5 染色體定位和基因復(fù)制分析

根據(jù)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)提供的陸地棉SPS 家族基因的染色體位置信息，利用MapInspect 軟件繪制陸地棉SPS 家族基因的染色體位置圖。 根據(jù)2個(gè)基因序列相互匹配部分的長(zhǎng)度大于較長(zhǎng)序列長(zhǎng)度的80%，且相互匹配部分的相似性大于80%來(lái)判定基因復(fù)制事件；同時(shí)，結(jié)合基因在染色體上的位置來(lái)確定基因復(fù)制的類(lèi)別是串聯(lián)復(fù)制還是片段復(fù)制[23-24]。

1.6 基因表達(dá)特性的轉(zhuǎn)錄組分析

棉花根、莖、葉片、花瓣和20 d 纖維的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)從NCBI 網(wǎng)站SRA 數(shù)據(jù)庫(kù)下載[19]?；虮磉_(dá)量的FPKM（Fragments per kilobase of exon model per million mapped reads） 值使用 cufflinks 2.1.1進(jìn)行計(jì)算[25]。 利用MeV 4.9 軟件繪制陸地棉SPS家族基因表達(dá)的熱圖[26]。

1.7 RNA的提取和cDNA反轉(zhuǎn)錄

使用RNA 提取試劑盒 （TIANGEN,DP441）提取棉花根、莖、葉片、花瓣和纖維的總RNA，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 的提取質(zhì)量。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒 （TaKaRa,6210B） 將約 2 μg RNA 反轉(zhuǎn)錄形成cDNA， 并保存于－20 ℃冰箱備用。

1.8 基因表達(dá)特性的熒光定量PCR分析

使用Premier 5.0 軟件， 根據(jù)基因的CDS 序列設(shè)計(jì)特異性引物，內(nèi)參基因Actin（GenBank 登錄號(hào)為AY907703.1） 和GhSPS基因的引物序列見(jiàn)表1。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板，于BIOER熒光定量PCR 儀上進(jìn)行熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （Quantitative real-time polymerase chain reac tion,qRT-PCR）分析。反應(yīng)總體系為20μL，包括2×SYBR Premix ExTaq（TaKaRa,RR420A）10 μL、10 mmol·L－1正向引物 0.8 μL、10 mmol·L－1反向引物 0.8 μL、cDNA 模板 1 μL 和 ddH2O 7.4 μL，共計(jì) 20 μL。 PCR 擴(kuò)增條件的設(shè)置為 95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40 個(gè)循環(huán)后增加熔解曲線。每個(gè)樣品進(jìn)行 3 次重復(fù)，采用 2－ΔΔCt法[27]進(jìn)行基因表達(dá)量的相對(duì)定量分析。

表1 本研究所用引物Table1 Primer used in this study

2 結(jié)果分析

2.1 陸地棉SPS基因家族成員的鑒定

通過(guò)BLASTP 分析，在陸地棉基因組中共鑒定到10 個(gè)蔗糖磷酸合成酶基因， 按照它們?cè)谌旧w上位置和順序， 分別將其命名為GhSPS1～GhSPS10（表2）。 10 個(gè)GhSPS的基因組大小在5 039 bp（GhSPS3）～6 580 bp（GhSPS5）之間，編碼區(qū)序列長(zhǎng)度 3 108 bp（GhSPS1）～3 189 bp（Gh-SPS2）之間。 對(duì)GhSPS基因編碼的蛋白進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，GhSPS 蛋白的氨基酸長(zhǎng)度在1 035 aa（Gh-SPS1）到 1 062 aa（GhSPS2）之間，蛋白分子量在116.83 kDa（GhSPS6）到 119.73 kDa（GhSPS2）之間，等電點(diǎn)從 6.429（GhSPS8）到 7.201（GhSPS1）不等，其中等電點(diǎn)小于7 的GhSPS 蛋白有8 個(gè)，占80%，表明陸地棉SPS 蛋白主要以弱酸性蛋白存在（表2）。

表2 陸地棉蔗糖磷酸合成酶基因家族成員Table2 Members of sucrose phosphate synthase gene family in G.hirsutum

2.2 陸地棉SPS家族成員的蛋白序列分析

先前研究表明植物SPS 蛋白普遍具有2 個(gè)保守的蛋白結(jié)構(gòu)域，分別是位于N 端的葡糖基轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域 （glycosyltransferase domain） 和位于C端的 SPP-like 結(jié)構(gòu)域（SPP-like domain）[28-29]，且存在3 個(gè)相對(duì)保守的蛋白磷酸化位點(diǎn)， 分別為光/暗調(diào)控位點(diǎn)（Ser-158），14-3-3 調(diào)控蛋白結(jié)合位點(diǎn)（Ser-229）和滲透壓調(diào)控位點(diǎn)（Ser-424）[28,30-31]。 對(duì)陸地棉SPS 家族成員的蛋白結(jié)構(gòu)域和磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，10 個(gè)GhSPS 蛋白均具有保守的葡糖基轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域和 SPP-like 結(jié)構(gòu)域 （圖1）；蛋白磷酸位點(diǎn)在陸地棉SPS 蛋白間相對(duì)保守，4 個(gè) GhSPS 蛋白不具有 Ser-158 磷酸化位點(diǎn)，6 個(gè) GhSPS 蛋白不具有 Ser-229 磷酸化位點(diǎn)，4 個(gè)GhSPS 蛋白不具有Ser-424 磷酸化位點(diǎn)（圖1）。

圖1 陸地棉GhSPS 蛋白的多序列比對(duì)Fig.1 Multiple sequence alignment of GhSPS proteins in G.hirsutum

2.3 陸地棉SPS家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化分析

先前研究表明， 植物SPS 基因家族的A、B和C 亞族廣泛存在于單子葉植物和雙子葉植物，而D 家族僅存在于單子葉植物中[32]。 為了了解陸地棉SPS 家族基因在進(jìn)化上的位置及親緣關(guān)系，本研究對(duì)擬南芥、水稻、煙草、高粱、雷蒙德氏棉、亞洲棉、海島棉和陸地棉共8 個(gè)物種的46 條蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。 結(jié)果表明， 植物的SPS 蛋白在進(jìn)化上聚為 A、B、C 和 D 共 4 個(gè)亞族 ， 其 中 陸 地 棉 GhSPS2、GhSPS3、GhSPS5、GhSPS7、GhSPS8 和 GhSPS10 屬 于 A 亞 族 ，GhSPS4 和 GhSPS9 屬 于 B 亞 族 ，GhSPS1 和GhSPS6 屬于C 亞族，不存在 D 亞族成員，且陸地棉SPS 蛋白與來(lái)源于同源染色體A 亞組和D亞組的SPS 蛋白聚于同一分支（圖2）。 進(jìn)一步對(duì)SPS 蛋白在不同亞族的分布情況進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，A 亞族包含較多的成員，包含6 個(gè)陸地棉GhSPS蛋白，2 個(gè)擬南芥 AtSPS 蛋白，1 個(gè)水稻 OsSPS蛋白，1 個(gè)煙草 NtSPS 蛋白、1 個(gè)高粱 SoSPS 蛋白、6 個(gè)海島棉 GbSPS 蛋白、3 個(gè)雷蒙德氏棉GrSPS 蛋白和 3 個(gè)亞洲棉 GaSPS 蛋白；B 亞族包含的成員數(shù)次之，包含2 個(gè)陸地棉GhSPS 蛋白，1個(gè)擬南芥 AtSPS 蛋白，2 個(gè)水稻 OsSPS 蛋白，1個(gè)高粱 SoSPS 蛋白、1 個(gè)煙草 NtSPS 蛋白、2 個(gè)海島棉GbSPS 蛋白、1 個(gè)雷蒙德氏棉GrSPS 蛋白和1 個(gè)亞洲棉GaSPS 蛋白；C 亞族包含的成員數(shù)最少， 包含 2 個(gè)陸地棉 GhSPS 蛋白，1 個(gè)擬南芥At SPS 蛋 白 ，1 個(gè) 水 稻 OsSPS 蛋 白 、1 個(gè) 煙 草NtSPS 蛋白、2 個(gè)海島棉 GbSPS 蛋白、1 個(gè)雷蒙德氏棉 GrSPS 蛋白和 1 個(gè)亞洲棉 GaSPS 蛋白；D亞族僅包含單子葉植物的SPS 蛋白，包含2 個(gè)水稻 OsSPS 蛋白和 1 個(gè)高粱 SoSPS 蛋白（圖 2）。

圖2 陸地棉與其它物種SPS 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic relationship between the SPS proteins in G.hirsutum and other species

2.4 陸地棉SPS家族成員的基因結(jié)構(gòu)分析

基因結(jié)構(gòu)分析表明，10 個(gè)GhSPS基因均含有內(nèi)含子和外顯子，且位于同一亞族的GhSPS基因具有相似的外顯子- 內(nèi)含子分布模式 （圖3）；不同亞族間GhSPS基因的外顯子/ 內(nèi)含子數(shù)目差異較大， 其中A 亞族成員的GhSPS基因具有13 個(gè)外顯子和 12 個(gè)內(nèi)含子；B 亞族成員的GhSPS基因均具有12 個(gè)外顯子和11 個(gè)內(nèi)含子；C 亞族成員的GhSPS基因均具有13 個(gè)外顯子和12 個(gè)內(nèi)含子（圖3）；陸地棉不同亞族成員基因外顯子和內(nèi)含子數(shù)目的差異，表明不同的陸地棉SPS基因在進(jìn)化過(guò)程中其結(jié)構(gòu)或功能已經(jīng)發(fā)生了分化。

2.5 陸地棉SPS家族成員的染色體分布

陸地棉SPS 基因家族的10 個(gè)成員分別分布在A 亞組和D 亞組的5 條染色上， 且每條染色體各包含1 個(gè)GhSPS基因（圖4）；基因復(fù)制分析表明，該家族成員無(wú)串聯(lián)復(fù)制，存在兩個(gè)片段復(fù)制事件GhSPS2/GhSPS3 和GhSPS7/GhSPS8，表明片段復(fù)制可能導(dǎo)致了GhSPS基因在陸地棉基因組中的擴(kuò)增。

圖3 陸地棉SPS 家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)和基因結(jié)構(gòu)示意圖Fig.3 Phylogenetic relationship and gene structure of SPS family numbers in G.hirsutum

2.6 陸地棉SPS基因家族表達(dá)特性的轉(zhuǎn)錄組分析

轉(zhuǎn)錄組分析表明，不同亞族的GhSPS基因具有不同的組織表達(dá)特性（圖5）。B 亞族的GhSPS4和GhSPS9 主要在葉片中表達(dá)量最高，在其它組織表達(dá)量很低或者不表達(dá)，表明該亞族基因可能參與源器官中蔗糖的合成與積累。 C 亞族的GhSPS1 和GhSPS6 在纖維中表達(dá)量最高， 其次是葉片和花瓣，在莖和根中表達(dá)量較低，表明該家族基因可能主要參與棉纖維的發(fā)育和形成。 A亞 族 的GhSPS2、GhSPS3、GhSPS5、GhSPS7、GhSPS8 和GhSPS10 在被檢測(cè)的組織均具有較高的表達(dá)，表明該家族基因可能參與棉花生長(zhǎng)發(fā)育的多個(gè)過(guò)程。 進(jìn)一步對(duì)GhSPS基因的表達(dá)特性進(jìn)行聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)，陸地棉SPS 家族基因的表達(dá)模式可分為2 類(lèi)， 一類(lèi)是組織特異性表達(dá)基因，包括B 亞族全部基因成員，另一類(lèi)是非組織特異性表達(dá)基因， 包括A 亞族和C 亞族的全部基因成員（圖5）。陸地棉不同亞族GhSPS基因的不同組織表達(dá)特性，表明它們的功能在進(jìn)化過(guò)程中可能受到了選擇作用。

2.7 陸地棉SPS基因組織表達(dá)特性的qRTPCR分析

為了驗(yàn)證陸地棉SPS 基因家族的組織表達(dá)特性， 本研究進(jìn)一步通過(guò)熒光定量PCR 的方法分析了GhSPS4（亞族 B）、GhSPS1（亞族 C）、Gh-SPS7（亞族 A）和GhSPS10（亞族 A）的組織表達(dá)特性。 結(jié)果表明，GhSPS4 在葉片中表達(dá)量很高，葉片是植物進(jìn)行光合作用的主要位置，在其它組織表達(dá)量很低或者不表達(dá)（圖6A），表明該基因在源器官中光合產(chǎn)物的積累方面可能起著重要作用，該結(jié)果與B 亞族基因的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致。GhSPS1 在葉片中表達(dá)量較高，其次是花瓣，在纖維中表達(dá)量較低（圖6B）。轉(zhuǎn)錄組分析表明C亞族SPS基因在纖維中有較高的表達(dá)，GhSPS1在纖維中較低的表達(dá)可能跟所檢測(cè)的纖維發(fā)育時(shí)期不同有關(guān)。GhSPS7 和GhSPS10 在被檢測(cè)的各個(gè)組織均有較高的表達(dá)（圖6C、6D），該結(jié)果與A 亞族SPS基因的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果較一致。

圖4 陸地棉SPS 家族基因的染色體分布和基因復(fù)制分析Fig.4 Chromosomal distribution and gene duplication analysis of SPS family genes in G.hirsutum

圖5 陸地棉GhSPS 基因組織表達(dá)特性的轉(zhuǎn)錄組分析Fig.5 Transcriptome analysis of tissue expression pattern of%GhSPS genes in G.hirsutum

圖6 陸地棉GhSPS 基因組織表達(dá)特性的熒光定量PCR 分析Fig.6 Quantitative real-time PCR analysis of tissue expression pattern of GhSPS genes in G.hirsutum

3 討論

蔗糖磷酸合成酶是調(diào)控蔗糖合成的關(guān)鍵酶，自1975 年在小麥胚芽中被發(fā)現(xiàn)以來(lái)[33]，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)SPS 在植物的光合組織和非光合組織中均廣泛存在[34]，暗示著SPS 可能參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的多個(gè)過(guò)程。 有證據(jù)表明，高等植物的基因組中至少含有1 個(gè)SPS基因[5,35]，隨著更多物種基因組測(cè)序的完成，人們發(fā)現(xiàn)植物SPS基因主要以基因家族的形式存在，其成員數(shù)量因物種不同而異[32]。 本研究利用新公布的陸地棉基因組數(shù)據(jù)，對(duì)陸地棉SPS 基因家族進(jìn)行了全基因組鑒定和系統(tǒng)分析。

3.1 陸地棉SPS基因家族的進(jìn)化

在陸地棉基因組中共鑒定到10 個(gè)SPS基因（表2），然而，大多數(shù)植物的基因組中存在3～5個(gè)SPS基因，玉米和大豆的基因組至少存在7 個(gè)SPS基因[21]。 不同植物SPS 家族基因數(shù)量的差異，主要是進(jìn)化過(guò)程中的基因擴(kuò)增導(dǎo)致的，其中基因組加倍扮演著重要的角色。 陸地棉是由兩個(gè)祖先種雜交形成的異源四倍體（AADD），雜交導(dǎo)致的基因組加倍會(huì)增加基因的拷貝數(shù)，因此，陸地棉基因組中數(shù)量較多的SPS基因可能與其經(jīng)歷的基因組加倍事件有關(guān)。 另外，在本研究中，陸地棉SPS 基因家族可分為 A、B 和 C 三個(gè)亞族， 不存在 D 亞族（圖 2）。 前人研究表明，A、B 和 C 亞族廣泛存在于單子葉植物和雙子葉植物，D 亞族僅存在于單子葉植物中[32]，本研究結(jié)果與該研究相一致。

3.2 陸地棉SPS基因家族的差異表達(dá)

對(duì)于植物的SPS 基因家族而言，不同亞族間SPS基因的表達(dá)特性和功能差別很大[36]。 在本研究中， 陸地棉不同亞族GhSPS基因具有不同的組織表達(dá)特性（圖5）。 B 亞族GhSPS基因在葉片中表達(dá)量很高，表明其可能主要參與源器官中蔗糖的合成。在水稻中，B 亞族的OsSPS1 基因在源器官葉片中高表達(dá)，且其表達(dá)不受發(fā)育時(shí)期的影響，因此，OsSPS1 被認(rèn)為是水稻源器官特異性表達(dá)的基因[37]。 在荔枝中，B 亞族LcSPS3 基因在成熟的葉片中表達(dá)量很高[28]。 B 亞族SPS基因在葉片中的特異性高表達(dá)，暗示著它們?cè)谠雌鞴俟夂袭a(chǎn)物的積累方面可能起著重要作用。 在許多植物中，A 亞族SPS基因常被認(rèn)為是植物重要的看家基因[38]，該亞族SPS基因在各個(gè)被檢測(cè)的組織均有較高的表達(dá)，例如在甘蔗[39]、柑橘[35]和煙草[38]中。 此外，過(guò)表達(dá)擬南芥A 亞族SPS基因，可以顯著增加棉花庫(kù)器官的蔗糖水平，而不改變?cè)雌鞴俚恼崽撬?，提高?kù)器官纖維的長(zhǎng)度[40]。本研究中， 陸地棉A 亞族SPS基因在被檢測(cè)的各個(gè)組織均表達(dá)量很高（圖5），但是它們的表達(dá)是否會(huì)影響棉花庫(kù)器官的強(qiáng)度和生長(zhǎng)發(fā)育仍需進(jìn)一步地研究。 研究表明，C 亞族SPS基因與淀粉降解后蔗糖的合成密切相關(guān)， 其表達(dá)具有生物鐘特性，在晚上表達(dá)量很高[38]。 在煙草中，通過(guò)RNA干擾技術(shù)抑制C 亞族NtSPSC的表達(dá)，可抑制淀粉降解的過(guò)程， 使其葉片中淀粉含量增加3～8倍[38]。 在本研究中，陸地棉 C 亞族GhSPS基因在纖維中表達(dá)量很高，表明它們的功能可能與棉纖維的發(fā)育有關(guān)，這為通過(guò)分子育種提高棉纖維品質(zhì)提供了基因信息。

3.3 SPS基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控

目前認(rèn)為，SPS 活性不僅受基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控， 還受蛋白磷酸化的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[41]。Ser-158 是植物SPS 蛋白響應(yīng)光/ 暗信號(hào)的磷酸化修飾位點(diǎn)[42]，該位點(diǎn)在植物中高度保守[43]，表明植物的SPS 活性受光/暗信號(hào)調(diào)控。 此外，SPS活性還受14-3-3 蛋白的磷酸化調(diào)控[44]，14-3-3 蛋白可與SPS 蛋白磷酸化位點(diǎn)Ser-229 發(fā)生互作[45]，抑制14-3-3 蛋白的表達(dá)可以導(dǎo)致SPS 活性升高和蔗糖積累的改善[46]。Ser-424 是菠菜響應(yīng)滲透壓的磷酸化修飾位點(diǎn)[47]，該位點(diǎn)在植物中相對(duì)保守。在本研究中， 對(duì)3 個(gè)蛋白磷酸化位點(diǎn)在陸地棉GhSPS 蛋白間相對(duì)保守（圖1），說(shuō)明轉(zhuǎn)錄后調(diào)控可能也參與了陸地棉SPS 蛋白活性的調(diào)控。 因此，在今后的研究中，一方面要繼續(xù)深入研究棉花SPS基因的功能， 另一方面， 還要深入研究SPS 表達(dá)/ 活性調(diào)控的分子機(jī)制，為今后通過(guò)調(diào)控SPS 活性，實(shí)現(xiàn)棉花產(chǎn)量和品質(zhì)的提高提供新途徑。

4 結(jié)論

本研究在陸地棉基因組中共鑒定到10 個(gè)GhSPS基因， 它們均勻地分布在A 亞組和D 亞組的5 條染色體上，且具有SPS 家族特有的蛋白結(jié)構(gòu)域和磷酸化位點(diǎn)。陸地棉SPS 家族成員可分為3 個(gè)亞族，同一亞族的SPS基因具有相似地外顯子-內(nèi)含子分布模式。 轉(zhuǎn)錄組和熒光定量PCR分析表明， 不同亞族GhSPS基因具有不同的組織表達(dá)模式， 其中A 亞族GhSPS基因在被檢測(cè)的各個(gè)組織均有較高的表達(dá)，B 亞族GhSPS基因在葉片中高表達(dá)，C 亞族GhSPS基因在纖維、葉片和花瓣中高表達(dá)。 這些研究結(jié)果為深入解析陸地棉SPS 家族基因的功能奠定理論基礎(chǔ)。