利用馬克隆值差異顯著的BILs鑒定棉纖維品質(zhì)相關(guān)基因

吳嫚，李龍?jiān)?，裴文鋒，Zhang Jinfa，于霽雯*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/ 棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鄭州大學(xué)研究基地，河南安陽455000；2.Department of Plant and Environmental Science,New Mexico State University,Las Cruces,NM 88003,USA）

棉花是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，棉纖維是重要的天然植物纖維[1]。 馬克隆值是衡量棉纖維品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，它綜合反映了纖維的粗細(xì)程度和成熟度， 三者與棉紡工藝設(shè)備的清雜效率、棉紗外觀品質(zhì)、棉紗強(qiáng)力和可紡性有密切關(guān)系[1-3]。因此，合理的原棉馬克隆值是提高紡紗質(zhì)量的基礎(chǔ)[4]。因此，從分子水平篩選并鑒定調(diào)控棉纖維發(fā)育的關(guān)鍵因子，對(duì)棉花品質(zhì)分子育種和解析棉纖維發(fā)育的分子機(jī)制具有重要的理論價(jià)值。

棉纖維細(xì)胞由胚珠外珠被單個(gè)細(xì)胞分化而來，是高等植物中伸長(zhǎng)最快、合成纖維素最多的模式單細(xì)胞[5]。 其分化和發(fā)育過程可分為4 個(gè)時(shí)期：纖維發(fā)育的起始期、伸長(zhǎng)期、次生壁增厚期和成熟期。 棉纖維細(xì)度、成熟度和馬克隆值主要受纖維次生壁形成特性的影響。 棉纖維細(xì)胞的次生壁增厚是1 個(gè)復(fù)雜的生理過程，涉及細(xì)胞壁的松弛，液泡膨壓的反作用力，膜脂、細(xì)胞壁成分和相關(guān)蛋白的生物合成及運(yùn)輸過程，受到許多基因的表達(dá)調(diào)控[6-8]。 迄今，已有一些相關(guān)的遺傳和數(shù)量性狀位點(diǎn)（Quantitative trait locus,QTL）定位的報(bào)導(dǎo)[9-16]。 Yu 等[17]以陸地棉 SG747 和海島棉 Giza75為親本，構(gòu)建回交近交系BIL 群體，在5 個(gè)環(huán)境下檢測(cè)到8 個(gè)馬克隆值QTLs， 解釋表型變異7.16%～17.57%，分布于 1、9、12、14、16、18、19 和24 號(hào)染色體。徐鵬等[18]以二倍體棉花Gossypium klotzschianumL.為供體親本，以陸地棉Simian2為輪回親本， 構(gòu)建染色體片段代換系BC2F4群體， 檢測(cè)到2 個(gè)與馬克隆值相關(guān)的穩(wěn)定的QTLqFMIC-7-1 和qFMIC-7-2， 最高解釋9.0%表型變異率。 Shang 等[19]以 GX1135 和 GX100-2g 為親本構(gòu)建了 1 個(gè) RIL 群體， 檢測(cè)到 4 個(gè)馬克隆值QTLs，其中qFM-chr19-1 在多個(gè)環(huán)境下被檢測(cè)到。但目前利用QTLs精細(xì)定位方法獲得的棉纖維發(fā)育相關(guān)基因還比較少。 基因芯片是大規(guī)模分析基因表達(dá)譜的有效手段之一， 它能夠同時(shí)檢測(cè)幾萬個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平， 由此可以檢測(cè)不同條件下差異表達(dá)的基因，了解這些基因的表達(dá)調(diào)控和功能[20-23]。近年來， 美國(guó)Affymetrix 的棉花基因組芯片已被廣泛應(yīng)用于棉花基因表達(dá)譜的分析[24-31]。Gilbert 等[32]利用Affymetrix 公司的棉花寡聚核苷酸芯片對(duì)2個(gè)Li2近等基因系Li2Li2和li2li2的纖維 （3、12 和16 DPA）進(jìn)行了基因富集和代謝途徑分析，發(fā)現(xiàn)乙烯生物合成和初生細(xì)胞壁合成過程參與了棉纖維的發(fā)育過程。 Wu 等[33]利用 Affymetrix 公司的棉花基因芯片對(duì)棉花皮棉產(chǎn)量存在顯著差異的兩組回交近交系進(jìn)行分析， 并結(jié)合QTLs 共定位和SSCP 分析獲得了3 個(gè)與皮棉相關(guān)的SNP位點(diǎn)。 Wu 等[34]利用 Affymetrix 公司的棉花基因芯片對(duì)棉纖維長(zhǎng)度性狀存在顯著差異的兩組回交近交系進(jìn)行差異表達(dá)基因分析，并結(jié)合熒光定量PCR（Polymerase chain reaction）發(fā)現(xiàn)類動(dòng)蛋白和過氧化物酶2 個(gè)基因與纖維發(fā)育存在密切關(guān)系。 Hande 等[35]利用 Affymetrix 公司的棉花基因芯片對(duì)棉花突變體Fl 和野生型0 DPA 和10 DPA進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn) AP2-EREBP、C2H2、C3H、HB 等參與了棉纖維細(xì)胞伸長(zhǎng)過程。 雖然到目前為止，已經(jīng)利用基因芯片或者RNA-seq 等技術(shù)篩選獲得了大量與纖維發(fā)育相關(guān)的基因，但利用2 個(gè)馬克隆值存在顯著差異的回交近交系研究棉纖維發(fā)育相關(guān)基因目前還比較少。

本研究選用馬克隆值差異較大的2 個(gè)回交近交系NMGA-140 和NMGA-051， 利用基因芯片比較兩者間開花后10 DPA 發(fā)育纖維中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜，旨在篩選和鑒定棉纖維發(fā)育相關(guān)的差異表達(dá)基因，為棉纖維發(fā)育關(guān)鍵候選基因的克隆和功能驗(yàn)證提供豐富的基因資源。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)

試驗(yàn)地點(diǎn)位于河南省安陽縣白璧鎮(zhèn)中棉所試驗(yàn)基地進(jìn)行（36o06'N，114o21'E），室內(nèi)試驗(yàn)在安陽市中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所棉花生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料

海陸高世代回交自交系（Backcross introgression line,BIL）群體引自 Yu 等[17]。 利用 SAS 軟件對(duì)海陸高世代BILs 群體2006―2008 年纖維品質(zhì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Duncan Grouping 顯著性分析， 從中選擇馬克隆值最大的材料NMGA-140 （馬克隆值：6.2）和馬克隆值最小的材料NMGA-051（馬克隆值：4.0）。 開花當(dāng)天對(duì)棉鈴進(jìn)行掛牌標(biāo)記，選取 5、10、15、20、25 DPA 棉鈴，剝?nèi)±w維后迅速浸入液氮速凍，保存在－80℃冰箱中備用。 同時(shí)采集了葉、花瓣和蕾，處理方法同上。 每個(gè)樣品取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1RNA 提取和質(zhì)量檢測(cè)。利用改良的CTAB法提取棉纖維樣品（5、10、15、20 和 25 DPA）及不同組織部位（葉、花、蕾）的總 RNA[36]。 每個(gè)樣品 3個(gè)生物學(xué)重復(fù)分開提取RNA。 用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總 RNA 的 28S 和 18S rRNA 比例，以評(píng)估總RNA 的完整性及純度。 利用DU800 核酸 / 蛋白質(zhì)分析儀 （Beckman Coulter，Brea，CA，USA）檢測(cè)RNA 的質(zhì)量和濃度。

1.3.2基因芯片的制備及差異表達(dá)基因的篩選。GeneChip○R棉花基因組芯片購自美國(guó) Affymetrix公司，基因芯片雜交及分析由上海晶泰生物技術(shù)有限公司完成。 每個(gè)樣品3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)混合成1 個(gè)RNA 池，反轉(zhuǎn)錄成cDNA 與芯片雜交，用高分辨率掃描儀GeneChip Scanner 3000 對(duì)染色后的芯片進(jìn)行掃描。 然后利用GeneChip Operating Software （GCOS），使用 MAS5 方法進(jìn)行數(shù)據(jù)均一化，綜合考慮PM 和MM 探針的信號(hào)值來判定基因的表達(dá)情況和變化情況[29]。

1.3.3差異表達(dá)基因的功能預(yù)測(cè)。利用COG 庫（Clusters of orthologous groups）和 COGNITOR程序（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/）對(duì)篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行功能預(yù)測(cè)分析。

1.3.4qRT-PCR。利用 AMV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 合成cDNA（普洛麥格北京生物技術(shù)有限公司）。 從差異表達(dá)基因中隨機(jī)挑選2 個(gè)上調(diào)基因和2 個(gè)下調(diào)基因， 使用Oligo 軟件設(shè)計(jì)引物 （表1），以看家基因18S rRNA 為內(nèi)參對(duì)照，利用Go-Taq qPCR Master Mix（普洛麥格北京生物技術(shù)有限公司） 在熒光定量PCR 儀Roche Light Cycler 480（Roche 公司）進(jìn)行 qRT-PCR 分析。 引物合成由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。 數(shù)據(jù)分析采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法分析2 個(gè)材料間的相對(duì)表達(dá)量：F＝（樣品1 目的基因濃度/ 樣品 1 看家基因濃度）/（樣品2 目的基因濃度/ 樣品2 看家基因濃度）。 每個(gè)樣品qRT-PCR 設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 所用基因及其引物序列Table1 Gene Primers for quantitative RT-PCR analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 田間數(shù)據(jù)分析結(jié)果

對(duì)NMGA-140 與NMGA-051 的纖維長(zhǎng)度、馬克隆值、斷裂比強(qiáng)度、伸長(zhǎng)率、整齊度指數(shù)的平均值進(jìn)行t測(cè)驗(yàn)，檢驗(yàn)材料間差異的顯著性。纖維品質(zhì)包括2006 年安陽4 個(gè)點(diǎn)和 2007 年安陽2個(gè)點(diǎn)共6 個(gè)點(diǎn)的數(shù)據(jù)。 根據(jù)雙尾t測(cè)驗(yàn)的結(jié)果，NMGA-140 與 NMGA-051 的纖維長(zhǎng)度、馬克隆值、斷裂比強(qiáng)度、整齊度指數(shù)都達(dá)到差異顯著水平，其中纖維長(zhǎng)度和馬克隆值達(dá)到了極顯著水平（表2）。 這說明以馬克隆值存在顯著差異的NMGA-140 與NMGA-051 篩選到的差異表達(dá)基因在纖維發(fā)育過程中對(duì)纖維長(zhǎng)度和纖維強(qiáng)度性狀可能也存在潛在的影響。

表2 NMGA-140 和NMGA-051 纖維品質(zhì)性狀差異Table 2 Fiber quality traits difference between NMGA-140 and NMGA-051

2.2 基因芯片數(shù)據(jù)的可靠性驗(yàn)證

本研究參考李龍?jiān)频萚29]對(duì)基因芯片數(shù)據(jù)的質(zhì)控評(píng)估驗(yàn)證方法。 從NMGA-140 與NMGA-051芯片雜交實(shí)驗(yàn)質(zhì)控評(píng)估結(jié)果來看，各項(xiàng)芯片實(shí)驗(yàn)參數(shù)滿足Affymetrix 質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。 其一，芯片平均雜交背景信號(hào)值低于50，滿足不大于100 的標(biāo)準(zhǔn)；其二，芯片上不存在大于芯片面積2.5%的痕跡；其三，RPT 文件（.rpt）所列的芯片上的內(nèi)參基因中至少有1 個(gè)基因， 其3'端的探針集合的雜交信號(hào)不超過其5'端探針集合的雜交信號(hào)的3 倍。

2.3 差異表達(dá)基因分析

從圖1 中可以看出 NMGA-140 與 NMGA-051 中基因表達(dá)量的比例信息和信號(hào)強(qiáng)度的關(guān)系。在基因表達(dá)譜的散點(diǎn)圖上，每1 個(gè)點(diǎn)表示1個(gè)基因。 散點(diǎn)圖中共有8 條斜線，平行對(duì)稱分布著 2 倍、3 倍、10 倍、30 倍 Fold change lines，它們由 上 至 下 分 別 為 30、10、3、2、－2、－3、－10和－30。 圖1 結(jié)果顯示基因表達(dá)譜中基因分布較為分散，2 和－2 線外存在大量的信號(hào)信息（NMGA-051 和 NMGA-140 信號(hào)比值為±2），表明通過分析比較2 張芯片得到了大量的差異表達(dá)基因。 棉花基因組芯片共有24 029 個(gè)探針組成，從表2 中可以看到NMGA-140 中有13 198 個(gè)探針信號(hào)檢測(cè)到（55%），NMGA-051 中有 13 736 個(gè)探針信號(hào)檢測(cè)到（57%）。NMGA-051（馬克隆值4.0）比NMGA-140（馬克隆值6.2）檢測(cè)到了更多的探針信號(hào)。 根據(jù) ratio＞2.0 和 ratio＜0.5 的標(biāo)準(zhǔn)，通過分析比較NMGA-140 和NMGA-051 共篩選得到2 655 個(gè)差異表達(dá)基因， 其中1 765 個(gè)基因在NMGA-140 中高表達(dá)， 而 890 個(gè)基因在 NM-GA-051 中高表達(dá)。

圖1 NMGA-140 與NMGA-051 基因芯片雜交信號(hào)散點(diǎn)圖Fig.1 Scatter Graph of NMGA-140 and NMGA-051

表2 芯片雜交結(jié)果Table 2 Results of Single Array Analysis

2.4 差異表達(dá)基因的功能預(yù)測(cè)

利用COG 數(shù)據(jù)庫對(duì)在NMGA-140 和 NMGA-051 的差異表達(dá)的2 655 個(gè)基因進(jìn)行了功能分類，根據(jù)所參與的代謝過程分為23 類（圖2）。這些差異表達(dá)的基因中功能預(yù)測(cè)基因（15.57%）和翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物合成相關(guān)基因（13.54%），翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、分子伴侶相關(guān)基因（9.31%）是3 個(gè)主要的分類。 在這些基因中根據(jù)P值和Signal Log2Ratio 以及前人的研究結(jié)果挑選了24 個(gè)可能在纖維發(fā)育過程中起到重要作用的基因。

2.5 差異表達(dá)基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)

為了進(jìn)一步通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR 驗(yàn)證芯片數(shù)據(jù)的可靠性， 隨機(jī)挑選了4 個(gè)差異表達(dá)顯著的基因（ΔP＜0.001；Log2ratio＞1.5 即差異表達(dá)倍數(shù)大于3）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的檢測(cè)（2 個(gè)上調(diào)基因，2 個(gè)下調(diào)基因）（表 4）。

圖2 差異表達(dá)基因的功能分類Fig.2 Functional groups of the Significantly differentially expressed genes

表3 基因芯片中差異表達(dá)倍數(shù)高以及與細(xì)度發(fā)育相關(guān)的基因Table 3 Significantly and fiber micronaire-related differentially expressed genes

從圖 3 中可以看出，β-tub1 基因在 NMGA-140 和 NMGA-051 的纖維、葉、花和蕾中的表達(dá)趨勢(shì)基本相同，都是在纖維中的表達(dá)量最高，在蕾中的表達(dá)量最低，由此可見β-tub1是纖維特異表達(dá)基因， 推測(cè)可能與纖維發(fā)育相關(guān) （圖3A）。β-tub10基因在馬克隆值較小的材料NMGA-051纖維中的表達(dá)量是最高的， 且顯著高于馬克隆值較大的材料NMGA-140（圖3B）。從圖3 中可以看出， 通過在NMGA-140 和NMGA-051 中不同組織中分析TUA7 基因的表達(dá)量， 發(fā)現(xiàn)TUA7基因不是纖維特異表達(dá)基因 （圖 3C）。Ghi.3578.1.S1_s_at是一個(gè)差異表達(dá)倍數(shù)較高的未知功能基因 （Log2 ratio=4.8）， 其在馬克隆值較大的材料NMGA-140 蕾中表達(dá)量最高， 在馬克隆值較小的材料NMGA-051 中在纖維中表達(dá)量最高 （圖3D）。

從圖 4 中可以看出，β-tub1基因在 NMGA-140 和NMGA-051 中5 DPA 時(shí)的表達(dá)量均極低，后上升至到10 DPA。 在馬克隆值較小的材料NMGA-051 中，其繼續(xù)上升，至15 DPA 達(dá)到最高點(diǎn)，至20 DPA 時(shí)持續(xù)下降；而在馬克隆值較大的材料NMGA-140 中，15 DPA 時(shí)下降到最低值，后急速上升，20 DPA 達(dá)到最高值，然后到25 DPA 持續(xù)下降。兩個(gè)材料在纖維發(fā)育10、15、20 DPA 時(shí)達(dá)到差異極顯著水平 （圖 4A）。β-tub10基因在NMGA-051 中，5 DPA 時(shí)表達(dá)量開始上升，10 DPA 時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)， 后至20 DPA 持續(xù)下降，到 25 DPA 時(shí)又有所回升； 在 NMGA-140 中，β-tub10基因表達(dá)量開始時(shí)上升，而后直至15 DPA持續(xù)下降，后持續(xù)上升，25 DPA 時(shí)達(dá)到最大值。 2個(gè)材料在纖維發(fā)育 10、15、20、25 DPA 時(shí)達(dá)到極顯著差異水平（圖 4B）。 由此可見，β-tub10基因與棉纖維發(fā)育密切相關(guān)。 對(duì)TUA7 基因進(jìn)行不同纖維發(fā)育時(shí)期表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)在NMGA-051 中，5 DPA 的表達(dá)量最高，10―25 DPA 表達(dá)量逐漸下降； 在 NMGA-140 中，5―15 DPA 表達(dá)量逐漸上升，到15DPA 時(shí)達(dá)到最高，而25 DPA 持續(xù)下降。2 個(gè)材料 10、20 DPA 達(dá)到了顯著差異水平 （圖4C）。 不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)Ghi.3578.1.S1_s_at基因 在 NMGA-140 和 NMGA-051 中均在 5 DPA 表達(dá)量最高， 10―25 DPA 在 NMGA-051 和 NMGA-140 中表達(dá)量逐漸下降 （圖4D）。

通過對(duì)β-tub1、β-tub10、TUA7和未知功能基因Ghi.3578.1.S1_s_at4 個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行不同組織部位和不同發(fā)育時(shí)期的實(shí)時(shí)熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)，β-tub1、β-tub10基因和Ghi.3578.1.S1_s_at可能參與了棉纖維發(fā)育過程， 有待進(jìn)一步進(jìn)行功能驗(yàn)證。同時(shí)，分析結(jié)果也發(fā)現(xiàn)基因芯片和實(shí)時(shí)定量PCR 的檢測(cè)結(jié)果一致，說明芯片數(shù)據(jù)具有生物學(xué)意義上的可重復(fù)性，結(jié)果可靠。

表4 基因芯片中與纖維發(fā)育相關(guān)差異表達(dá)明顯的基因Table 4 Significantly and fiber-related differentially expressed genes for qRT- PCR

3 討論

馬克隆值是評(píng)價(jià)棉花纖維品質(zhì)好壞的指標(biāo)之一，直接影響棉纖維的加工和最終產(chǎn)品的質(zhì)量。細(xì)纖維可使更多的纖維紡入紗線，從而使紗線更強(qiáng)，紡織時(shí)間更短。因此，棉纖維細(xì)度性狀的改良已經(jīng)成為當(dāng)前棉花纖維品質(zhì)遺傳改良工作的研究熱點(diǎn)。本研究在已有的回交近交系（BIL）群體中選取馬克隆值最大的材料NMGA-140 （馬克隆值6.2）和馬克隆值最小的材料NMGA-051 （馬克隆值4.0）， 利用Affymetrix 基因芯片技術(shù)分析比較了NMGA-140 和NMGA-051 的基因表達(dá)譜，通過實(shí)時(shí) 熒 光 定 量 PCR 對(duì)Ghi.3578.1.S1_s_at、TUA7、β-tub1、β-tub10進(jìn)行了不同組織部位和不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)量分析， 為以后纖維發(fā)育相關(guān)基因克隆及功能驗(yàn)證提供了重要參考。

圖3 4 個(gè)基因在不同組織器官中的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果Fig.3 qRT-PCR results of four genes in different tissues

圖4 4 個(gè)基因在棉纖維不同發(fā)育時(shí)期的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果Fig.4 qRT-PCR results of four genes in fiber development

芯片雜交試驗(yàn)的可靠性驗(yàn)證是利用芯片開展相關(guān)研究工作的重要環(huán)節(jié)之一。 本研究從基因芯片數(shù)據(jù)的質(zhì)控評(píng)估和差異表達(dá)基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)2 個(gè)方面驗(yàn)證了芯片結(jié)果的可靠性。從NMGA-140 與NMGA-051 芯片雜交實(shí)驗(yàn)的平均雜交背景信號(hào)、內(nèi)參基因等質(zhì)控評(píng)估結(jié)果來看，各項(xiàng)芯片實(shí)驗(yàn)參數(shù)滿足Affymetrix 質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。 從Ghi.3578.1.S1_s_at，TUA7，β-tub1，β-tub104 個(gè)差異表達(dá)基因纖維發(fā)育10 DPA 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 結(jié)果來看，β-tub1和TUA7在 NMGA-140中的表達(dá)量顯著高于NMGA-051，說明β-tub1和TUA7基因的表達(dá)量越高， 纖維馬克隆值越大；β-tub10和Ghi.3578.1.S1_s_at在 NMGA-051 中的表達(dá)量高于NMGA-140， 說明β-tub10和Ghi.3578.1.S1_s_at的表達(dá)量越高， 纖維馬克隆值越小。以上與基因芯片雜交試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果一致，說明本研究芯片數(shù)據(jù)具有生物學(xué)意義上的可重復(fù)性，結(jié)果可靠。

微管(microtubule)是真核細(xì)胞中幾種主要的細(xì)胞質(zhì)骨架纖絲之一， 它的主要結(jié)構(gòu)成分是微管蛋白 (tubulin)， 在纖維發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。 在棉纖維細(xì)胞中， 迄今己經(jīng)識(shí)別出了9 種α-tubulin和 7 種β-tubulin蛋白[37]。 Li 等[38]克隆了1 個(gè)β-tubulin基因GhTUB1， 在纖維發(fā)育快速伸長(zhǎng)期 8DPA 優(yōu)勢(shì)表達(dá)； 而另 1 個(gè)β-tubulin基因Gh-BTubL在酵母中過量表達(dá)可以使酵母縱向伸長(zhǎng) 1.7 倍多[38]。 劉迪秋等[39]通過分析 20 DPA 棉纖維構(gòu)建的SSH 文庫發(fā)現(xiàn)了 3 個(gè)β-tubulins， 并認(rèn)為在20DPA 以后優(yōu)勢(shì)表達(dá)的β-tubulins可能特異地調(diào)控棉纖維的纖維素沉積[39]。 本研究利用基因芯片分析比較了馬克隆值存在顯著差異的兩個(gè)陸?；亟唤幌担?并獲得了兩個(gè)微管蛋白基因β-tub1和β-tub10基因。 通過對(duì)其進(jìn)行不同組織部位和不同時(shí)期表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，β-tub1基因在 NMGA-140 和 NMGA-051 的纖維中優(yōu)勢(shì)表達(dá)， 且纖維發(fā)育10 DPA 時(shí)在馬克隆值較大的材料中表達(dá)量顯著高于馬克隆值較小的材料。 在纖維發(fā)育 10、20 和 25 DPA 時(shí)，β-tub1基因在馬克隆值較大的材料中表達(dá)量顯著高于馬克隆值較小的材料。 結(jié)果表明β-tub1基因可能在纖維發(fā)育過程中負(fù)向調(diào)節(jié)棉纖維發(fā)育。β-tub10基因在馬克隆值較小的材料NMGA-051 纖維中的表達(dá)量是最高的， 且顯著高于馬克隆值較大的材料NMGA-140。β-tub10基因在纖維發(fā)育早期 （5―15 DPA）在馬克隆值較小的材料中表達(dá)量顯著高于馬克隆值較大的材料，纖維發(fā)育后期（20―25 DPA）在馬克隆值較大的材料中的表達(dá)量顯著高于馬克隆值較小的材料。 結(jié)果表明β-tub10 基因可能在纖維發(fā)育快速伸長(zhǎng)期正向調(diào)節(jié)棉纖維發(fā)育過程。 這與前人的研究結(jié)果相似[40]。Ghi.3578.1.S1_s_at是1 個(gè)未知功能基因，在馬克隆值較小的材料纖維中表達(dá)量都最高，在NMGA-140 和NMGA-051 中均在5DPA 時(shí)的表達(dá)量最高， 從10―25 DPA 在2 個(gè)材料中表達(dá)量逐漸下降，推測(cè)該基因可能在早期對(duì)纖維發(fā)育起到一定的作用。 對(duì)以上3 個(gè)基因有待于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步進(jìn)行功能驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究利用基因芯片分析比較了2 個(gè)馬克隆值存在顯著差異的陸?；亟唤幌?， 通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)對(duì)篩選到的4 個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行了表達(dá)模式分析， 得到了與棉纖維發(fā)育密切相關(guān)的基因， 為今后棉纖維發(fā)育基因克隆和功能驗(yàn)證提供了豐富的基因資源， 也為棉纖維品質(zhì)分子育種打下了良好的基礎(chǔ)。