自制復(fù)合質(zhì)控品在α、β-地中海貧血基因檢測中的應(yīng)用價值*

汪文明，馬 玲，周 靖，陳 林△

1.重慶市南川區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，重慶 408400；2.重慶市南川區(qū)婦幼保健院檢驗科，重慶 408400

地中海貧血(以下簡稱“地貧”)是全球最大的單基因遺傳病之一，我國南方高發(fā)地區(qū)人群攜帶率為1%～23%[1]。基因檢測是診斷該病和確定基因型的準確方法[2]。目前臨床應(yīng)用最為廣泛的基因檢測方法是反向斑點雜交技術(shù)，該方法成本低，通量高，適合在基層實驗室開展，但檢測過程煩瑣，手工操作步驟多，檢測周期長，缺少陽性質(zhì)控品，是該方法不可忽視的問題。《醫(yī)學實驗室質(zhì)量與能力認可準則在基因擴增檢驗領(lǐng)域的指南》要求，基因擴增實驗室的內(nèi)部質(zhì)量控制至少需做陰陽性質(zhì)控[3]。目前，分子檢測的商品化質(zhì)控物有限，且存在檢測位點單一，無法覆蓋全部突變位點，不能參與整個檢測過程等問題，較多實驗室使用自制質(zhì)控品[4]。在病原微生物核酸檢測方面，葛燕梅等[5]使用已確認的解脲支原體陽性標本作為單一質(zhì)控物；另外，部分實驗室使用商品化試劑自制復(fù)合質(zhì)控品[6-8]。在遺傳性疾病的基因檢測項目中，自制復(fù)合質(zhì)控品的使用鮮有報道。本研究探討使用陽性標本混合制作復(fù)合質(zhì)控品，以期覆蓋更多的突變位點，并對該方法的可行性進行驗證。

1 材料與方法

1.1材料 收集2017年9月至2018年12月在南川區(qū)人民醫(yī)院行α、β-地貧檢測的陽性標本，標本類型為枸櫞酸鈉抗凝的外周全血。日常檢測工作中，選取DNA水平為20～40 ng/μL，純度A260/A280值為1.5～2.5的單一突變類型的雜合子標本，于-70 ℃冰箱保存，建立陽性標本庫。本研究經(jīng)過南川區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會批準，受檢者知情同意。

1.2儀器與試劑 α、β-地貧基因檢測試劑盒(潮州凱普公司)，NanoDrop 2000紫外-可見分光光度計(賽默飛公司)，Veriti熱循環(huán)儀(美國應(yīng)用公司)，HB-2012A型醫(yī)用核酸分子快速雜交儀(潮州凱普公司)。

1.3方法

1.3.1陽性標本的選擇 選擇陽性標本時，應(yīng)根據(jù)實驗室使用的檢測方法及檢測基因位點而定，應(yīng)盡可能覆蓋PCR產(chǎn)物的所有片段。南川區(qū)人民醫(yī)院檢驗科(以下稱“本實驗室”)采用潮州凱普公司生產(chǎn)的α、β-地貧基因檢測試劑，該試劑使用單管法，使用3對半引物擴增α-地貧的3種突變位點和3種缺失型位點(圖1)及1對引物擴增β-地貧的17個位點的19種突變類型。因此，本研究制備的復(fù)合質(zhì)控品，使用2種不同的α-地貧突變位點和2種不同的β-地貧突變位點。在制備質(zhì)控品時，可使用不同的突變位點自由組合，以達到同一批次試劑覆蓋所有常見突變位點的目的。

圖1 α-地貧基因引物位置模式圖(潮州凱普公司提供)

1.3.2復(fù)合質(zhì)控品制備 按照上述要求，從-70 ℃陽性標本庫中，選取4種不同突變類型的陽性標本，室溫充分融化。分別取1 mL加入10 mL無菌離心管內(nèi)，震蕩混勻，瞬時離心，制成復(fù)合質(zhì)控品，分別分裝200 μL于1.5 mL EP管內(nèi)，-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。每次試驗前，?支在室溫下復(fù)融20 min，充分混勻后，與待測標本一起檢測。

根據(jù)α、β-地貧基因試劑的檢測要求，全血標本加樣量為200 μL時，提取DNA的水平為20～40 ng/μL，DNA純度A260/A280的值為1.5～2.5，且試劑盒的DNA最低檢出限為2 ng/μL。通過等比例混合4種不同突變類型陽性標本的方法，制備復(fù)合質(zhì)控品，每種突變類型陽性標本的加樣量為50 μL，混合后總體積為200 μL，理論上每種突變的DNA水平為5～10 ng/μL，此水平符合弱陽性質(zhì)控品的水平要求(最低檢測量的2～5倍)[6-8]。

1.3.3自制質(zhì)控品檢測及結(jié)果判讀 自制復(fù)合質(zhì)控品與待測標本一起，按照試劑盒說明書要求，使用離心柱法提取DNA，使用NanoDrop 2000紫外-可見分光光度計檢測DNA提取液的水平和純度(試劑盒要求水平為20～40 ng/μL，純度A260/A280比值為1.5～2.5)。PCR反應(yīng)體系為50 μL，45 μL PCR混合液，5 μL DNA提取液。使用Veriti熱循環(huán)儀行基因擴增。使用HB-2012A型醫(yī)用核酸分子快速雜交儀對擴增產(chǎn)物行導(dǎo)流雜交，擴增產(chǎn)物和雜交膜條上的不同突變類型的探針雜交，通過化學顯色對結(jié)果進行判讀，見圖2。因α、β-地貧基因突變位點較多，1個復(fù)合質(zhì)控品最多可監(jiān)控4個突變位點，為監(jiān)控更多的突變位點，下次檢測可改用與上次不同的復(fù)合質(zhì)控品。

1.4統(tǒng)計學處理 采用Microsoft Excel2010對數(shù)據(jù)進行整理。

2 結(jié) 果

使用自制復(fù)合質(zhì)控品監(jiān)控126次，同時使用含有單一突變位點(-α3.7)的陽性標本進行對照。126次檢測中，使用自制復(fù)合質(zhì)控品和單一突變陽性標本提取的DNA，其水平及純度均滿足試劑盒要求，見表1。反向斑點雜交結(jié)果中，每陽性位點對應(yīng)的斑點均成功顯色，見圖2。126次檢測中，共監(jiān)測陽性位點數(shù)504次，檢出率為100.0%，陽性預(yù)測值為100.0%，陰性預(yù)測值為0。檢測陽性位點基本覆蓋本地區(qū)所有常見突變位點，見表1。

表1 自制復(fù)合質(zhì)控品檢測結(jié)果

注：k為雜交膜條上不同探針的分布示意圖，圖中每個小方格內(nèi)的含有1種探針，左下角1個小方格無探針分布，第1行和倒數(shù)第2行有“N”標記的小方格，代表野生型探針，其中 “NP”為“--SEA、-α3.7、-α4.2”共用的野生型對照點，“M”標記的小方格代表突變型探針；a～j為10種自制復(fù)合質(zhì)控品對應(yīng)的10張不同的雜交膜條，藍色斑點代表質(zhì)控品擴增產(chǎn)物與相應(yīng)的探針行反向斑點雜交的結(jié)果。

圖2 自制復(fù)合質(zhì)控品反向斑點雜交結(jié)果

3 討 論

室內(nèi)質(zhì)控的目的在于監(jiān)控檢測過程，評價檢驗結(jié)果是否可靠，以排除所有階段中導(dǎo)致不滿意的原因。分子檢測技術(shù)飛速發(fā)展，越來越多的醫(yī)院開設(shè)有分子檢測項目，然而分子檢測的室內(nèi)質(zhì)控卻未完善[9-10]，特別是室內(nèi)質(zhì)控物質(zhì)的缺少，給實驗室開展分子檢測帶來困難。呂榮鈺等[11]對反向斑點雜交法檢測為陰性的地貧疑似病例，再進一步行基因檢測，發(fā)現(xiàn)有1.8%的漏診率，對于漏診的原因，文章并未詳述，筆者認為該方法缺少陽性質(zhì)控對實驗全過程進行有效監(jiān)控，是該方法存在的缺陷。在缺乏商品化陽性質(zhì)控品情況下，實驗室多采用已確認的陽性標本進行質(zhì)控，也有部分實驗室在進行基因型檢測時，常年僅使用一個基因型室內(nèi)質(zhì)控品，未對其他有臨床決策價值的基因突變進行監(jiān)控[9]。李艷等[12]提出當同時檢測多個突變基因時，可設(shè)立2個或3個突變基因的陽性對照，下次改用與上次不同的突變基因，以便覆蓋更多突變位點。筆者受到以上研究的啟發(fā)，結(jié)合本實驗室積累的質(zhì)控經(jīng)驗，以α、β-地貧基因檢測為例，通過混合陽性標本，自制復(fù)合質(zhì)控品的方法，對檢測全過程進行監(jiān)控。結(jié)果顯示，2017年9月至2018年12月使用自制質(zhì)控品檢測126次，檢測陽性位點數(shù)504次，檢出率為100.0%，陽性預(yù)測值為100.0%，陰性預(yù)測值為0。檢測陽性位點基本覆蓋本地區(qū)所有常見突變位點。

與商品化質(zhì)控品相比，自制質(zhì)控品原料有限，且每個標本間也存在差異，不同批次質(zhì)控品間也會存在差異，因此，需要對納入陽性標本庫的標本進行嚴格的質(zhì)控，不得使用DNA水平及純度低，含有凝塊等不合格的標本。應(yīng)用過程發(fā)現(xiàn)以下缺陷：(1)質(zhì)控品4個陽性位點的顯色，有時會出現(xiàn)深淺不均一的情況，可能與某一標本產(chǎn)生微小凝塊，或凍存標本未完全融化有關(guān)。因此，在制備質(zhì)控品時，每個標本要充分融化，若遇到有較小凝塊時，可參照文獻[13]的方法，使用無菌小木棍，將凝塊搗碎，震蕩混勻，然后再與其他不同突變類型的陽性標本混合。(2)陽性標本經(jīng)凍存、室溫溶解、混勻、震蕩等操作后，標本物理性狀發(fā)生較大改變，顯微鏡下觀察，無完整細胞結(jié)構(gòu)，DNA呈游離狀態(tài)，易降解。因此，選擇陽性標本時，建議使用近1～2個月內(nèi)檢出的標本。(3)4元復(fù)合質(zhì)控品，每個陽性標本的加樣量約為常規(guī)加樣量的1/4，若某一陽性標本DNA水平較低，或者因為標本凝集等原因，導(dǎo)致DNA的提取量減少，若低于試劑盒檢測下限時，可能會遇到某一位點未檢出的情況。若同一批次同一位點多次出現(xiàn)未檢出的情況，應(yīng)屬于質(zhì)控品原因?qū)е碌氖Э?。因此，在制備質(zhì)控品時，可增加同種突變的陽性標本數(shù)，等比例混勻后，再與其他不同突變類型的陽性標本混合，以彌補因單一標本的質(zhì)量不佳造成的影響。(4)多重PCR不同引物間存在著競爭作用[14]，某些潛在擴增效率低的引物其擴增效率會有所降低，導(dǎo)致某個突變未檢出，或檢出比例降低的情況。本研究還未發(fā)現(xiàn)未檢出的情況，可能與本研究數(shù)據(jù)較少有關(guān)，有待進一步觀察。(5)與商品化質(zhì)控品相比，自制質(zhì)控品的配置過程相對比較粗糙，在穩(wěn)定性、瓶間差等方面，無法達到標準化的要求[15]，因此，在發(fā)現(xiàn)自制質(zhì)控品未檢出等情況時，應(yīng)首先排除自制質(zhì)控品本身的原因。(6)因區(qū)域性陽性標本類型的限制[16]，無法獲取一些稀有型突變的標本，本方法僅可監(jiān)控本地區(qū)常見突變類型。

我國α、β-地貧發(fā)病率較高，陽性標本易獲得，本研究制備的復(fù)合質(zhì)控品，制備方法簡單，成本低，可有效監(jiān)控更多突變位點。本實驗室使用該方法進行質(zhì)控，穩(wěn)定性良好，在商品化質(zhì)控品不太成熟的情況下，實驗室可根據(jù)實際情況自行制備。