紫草炭制前后萘醌類化合物含量變化及止血作用研究＊

牧 丹，陳永福，布 仁，白文明，蘇日娜＊

（1. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學 呼和浩特 010010；2. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 呼和浩特 010010）

紫草為常用藥材，最早見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，歷代本草均有收載。2015版中國人民共和國藥典［1］收載了紫草科植物新疆紫草Arnebia euchroma（Royle）Johnst.和內(nèi)蒙紫草Arnebia guttata Bunge 的干燥根。有著清熱涼血，活血解毒，透疹消斑的功能，用于血熱毒盛，斑疹紫黑，麻疹不透，瘡瘍，濕疹，水火燙傷的治療。

從報道中已知紫草中含有紫草萘醌類、生物堿類、單帖苯醌類及苯酚類、黃酮類、酚酸類等脂溶性化學成分及紫草多糖等水溶性化學成分。從新疆紫草根中分離獲得30 余種萘醌類化合物,其母核多為5,8-二羥基萘醌，具有異己烯邊鏈。因其旋光性差異而將此萘醌類化合物分為2 種光學異構體:R-型(命名為紫草素類,shikon)和S-型( 命名為阿卡寧類,alkannin)［2］。針對紫草中萘醌類化合物的含量研究有一些報道：郝鶴等［3］采用梯度洗脫HPLC 法測定了新疆紫草中的 7 種萘醌類成分；Min Cheng 等［4，5］采用 HPLC 法測定了新疆紫草和內(nèi)蒙紫草中的左旋紫草素和β，β′- 二甲基丙烯酰阿卡寧的含量；昝珂等［6，7］采用HPLC 法測定了新疆紫草的特征圖譜和紫草類藥材中六種萘醌成分的含量。

在中醫(yī)臨床應用中紫草主要以油、膏的形式入藥，紫草油、膏常用于治療輕度水火燙傷，但其作用絕不僅限于此［8］。而主要藥效成分紫草素可直接抑制人角質(zhì)形成細胞增殖，誘導凋亡。謝欣然等通過實驗證實，紫草素主要通過IL-17 細胞因子對角質(zhì)形成細胞進行調(diào)控，同時還可抑制角質(zhì)形成細胞內(nèi)趨化因子緩解炎性反應，治療銀屑?。?，10］。由于紫草良好的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用［11］，也經(jīng)常用于各類濕疹、皮炎的治療［12-14］。

傳統(tǒng)的蒙藥中，紫草用于治療肺熱、咳嗽、肺膿腫以及各種出血癥狀［15］，蒙醫(yī)理論［16］上，除了原藥材直接入藥外，還經(jīng)常以炮制品入藥。蒙藥的炮制學認為，紫草經(jīng)炒制后的炭制品更有利于各種出血癥的治療，而牛奶炮制后入藥其治療肺熱的療效加強。在前期研究中我們主要其奶炮制的工藝及萘醌類成分的變化采用HPLC 方法進行了定量的分析［17］，并對其藥理作用進行了一定的研究。但是蒙醫(yī)的紫草的傳統(tǒng)炭制方法的研究僅限于古籍記載，對其炭制工藝及藥理作用及機制的研究仍是空白。

本研究以傳統(tǒng)蒙藥炮制理論為基礎，將紫草原藥材經(jīng)炭制后，確定其最佳炭制工藝，測定萘醌類化合物的含量，計算炭制前后的變化，為紫草炭制品的質(zhì)量標準及今后藥理實驗提供一定的理論指導和實驗基礎。

1 材料

1.1 儀器

KH5200DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；萬用電爐（北京科偉永興儀器有限公司）；GM1651 高溫系列紅外測溫儀（深圳市聚茂源科技有限公司）；HHS-4S 電子恒溫不銹鋼水浴鍋（上海宜昌儀器紗篩廠）；電鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；JA5003N 電子天平（上海菁海儀器有限公司）；AL204 電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；Thermo U3000 高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技有限公司）。

1.2 試藥

試劑：石油醚（60～90℃）（分析純）、無水乙醇（分析純）、乙腈（色譜純）、甲酸（色譜純）、超純水

對照品：β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧（中國食品藥品檢定研究院，批號111689-201504）

動物：小鼠，內(nèi)蒙古醫(yī)科大學動物中心提供。

藥材：全部批次的藥材經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學渠弼教授鑒定為紫草科植物新疆紫草（Arnebiaeuchroma（Royle）Johnst.）的干燥根。藥材來源見下表1。

表1 藥材來源

2 方法與結果

2.1 紫草炭制工藝流程

稱取新疆紫草約30 g，加熱電爐和鐵鍋，使用紅外測溫儀測溫度，待鍋底達到指定溫度，放入紫草,在指定溫度5 個炭制溫度（200-300 ℃、350-450 ℃、400-450 ℃、450-500 ℃、500-600 ℃）下均勻翻炒一定時間（5 min、10 min、15 min、20 min），記錄溫度、時間、紫草顏色及形狀變化見表2，放涼后，放入自封袋，備用。

2.2 紫草炭制前后顏色及形狀變化比較

2.1 將批號為160301的藥材經(jīng)不同溫度下炭制不同時間后，顏色及形狀的變化如下圖1。

經(jīng)5個批次的藥材不同溫度和時間炭制后比較發(fā)現(xiàn)，350-400 ℃15 min 的炭制工藝，使藥材外部炭化、內(nèi)部保留固有性能(存性)，因此將此條件定為紫草最佳炭制工藝。

3 含量測定

3.1 羥基萘醌總色素含量測定

取本品適量，在50 °C 干燥3 h，粉碎(過40 目篩），取約0.5 g，精密稱定，置100 mL 量瓶中，加無水乙醇至刻度，4h 內(nèi)時時振搖，濾過。精密量取續(xù)濾液5 mL，置25 mL 量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻。照紫外-可見分光光度法(通則0401)，在516 nm 波長處測定吸光度，按左旋紫草素(C16H16O5)的吸收系數(shù)(E)為242 計算，即得。本品含羥基萘醌總色素以左旋紫草素（C16H16O5)計。

表2 160301批次不同炭制工藝紫草顏色變化

圖1 不同炮制溫度和時間下紫草藥材的變化A：紫草原藥材B：200-300℃20min C：350-400℃15min D：400-450℃10min E：450-500℃10min F：500-600℃5min

經(jīng)炭制后的紫草與紫草原藥材相比較，羥基萘醌總色素含量不同程度的降低。炮制工藝101B（200-300 ℃20 min）和 101C（350-400 ℃15 min）時，藥材中羥基萘醌總色素含量分別為3.464%、2.754%，比原藥材降低了20.50%和33.28%結果見表3。而當炮制溫度達到400 ℃以上的情況下，藥材中羥基萘醌總色素含量減低到70%以上，500-600 ℃左右基本檢測不到其成分。其他批次的紫草炭制品的情況基本相同，數(shù)據(jù)未列出。從以上測定發(fā)現(xiàn)，炮制溫度對紫草藥材中羥基萘醌總色素含量影響較大，高溫的炮制導致其成分的揮發(fā)，導致含量的降低。紫草炭制品中羥基萘醌總色素含量結果與我們的最佳炮制工藝的預期結果符合。

表3 160301批次藥材不同炭制工藝下羥基萘醌總色素含量

3.2 β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧含量測定

3.2.1 色譜條件

色譜柱：SinoChrom ODS-BP(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相:乙腈-0.15%甲酸水溶液（70:30）,流速：1 mL·min-1,檢測波長：275 nm,柱溫：30 ℃。

0.15%甲酸溶液的配置：精密移取色譜級甲酸溶液1.50 mL，轉移至1000 mL 的容量瓶中，加水（超純水）稀釋到刻度，搖勻，即得。

3.2.2 溶液制備

3.2.2.1 供試品溶液制備：取紫草粉末（過40 目篩）0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入石油醚（60-90 ℃）25 mL,稱定重量，超聲處理（溫度30 ℃ 功率250 W 頻率33 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用石油醚（60-90 ℃）補足減失重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液10 mL 于試管中，蒸干，殘渣加約5 mL 流動相溶解，超聲處理（溫度30 ℃功率250 W 頻率33 kHz）10 min，轉移至10 mL 容量瓶中，加流動相至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.2.2.2 標準品溶液制備：取β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧2.01 mg，精密稱定，置于10 mL 容量瓶中，加乙腈定容至刻度，搖勻，即得濃度為201.00 μg·mL-1的標準溶液。

3.2.2.3 標準品溶液的稀釋：精密量取上述201.00 μg·mL-1標準溶液 1 mL，置于 25 mL 容量瓶，加乙腈定容至刻度，搖勻，即得濃度為8.04 μg·mL-1的標準溶液。

3.2.3 專屬性考察

圖2、圖3、圖4 為對照品、紫草原藥材及炭制紫草的HPLC 色譜圖，結果表明丙烯酰阿卡寧保留時間一致，分離度良好，HPLC測定方法專屬性良好。

3.2.4 線性關系考察

精密量取按“3.2.2.2、3.2.2.3 標準品溶液制備”項下制備的標準品溶液，

用乙腈稀釋配制成濃度為301.5 μg·mL-1、201 μg·mL-1、120.6 μg·mL-1、80.4 μg·mL-1、40.2 μg·mL-1、4.02 μg·mL-1的一系列標準品溶液。濾頭過濾，按上述色譜條件測定，記錄色譜圖以峰面積積分值（Y）為縱坐標，標準品溶液濃度（X）為橫坐標，進行線性回歸，得線性方程為Y = 0.1742X - 0.5616（R2 = 0.9996）,線性范圍4.02-301.50 μg·mL-1。

圖2 HPLC圖譜A:β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧B:紫草原藥材

圖3 同一批次藥材不同炭制工藝下各組分峰面積比較

圖4 β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧標準曲線

3.2.5 方法學考察

3.2.5.1 重復性試驗 取同一批紫草炭制樣品粉末（批號：160101，炭制工藝：350-400 ℃ 15 min）6 份，按“3.2.2.1 供試品溶液制備”方法平行制備供試品溶液，自動進樣10.00 μL,按“3.2.1色譜條件”項下條件測定，記錄色譜圖，計算含量，結果如表4。

結果RSD為2.04%，表明儀器重現(xiàn)性良好。

3.2.5.2 精密度試驗 精密吸取同一紫草供試品溶液（批號：160101，炭制工藝：350-400 ℃ 15 min）10.00 μL，按“3.2.1 色譜條件”項下條件重復測定6 次，記錄色譜圖，結果見表5。

計算其RSD 值為0.52%，結果表明該方法的精密度良好，符合要求。

3.2.5.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一紫草供試品溶液（批號：160101，炭制工藝：350-400 ℃ 15 min）10.00 μL，分別于 0、1、2、4、8、10 h 后注入色譜儀，按“3.2.1 色譜條件”項下條件測定，記錄色譜圖，記錄峰面積，計算平均值，結果見表6。

計算其RSD 值為0.53%，結果表明供試品溶液在10 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.2.5.4 加樣回收率試驗 取已知含量的炭制紫草粉末（批號：160101，炭制工藝：350-400 ℃ 15 min）約0.25g，共6份，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，加入一定量的對照品，使供試品中待測定組份含有量與對照品的加入量比在1:0.5，1:1，1:1.5 左右，按“3.2.2.1供試品溶液制備”平行制備供試品溶液，自動進樣10.00 μL，分別進行測定，記錄色譜圖，計算含量，結果下表7。

表4 重復性試驗

表5 精密度試驗

表6 穩(wěn)定性試驗

結果回收率為100.5%-104.2%，平均值為102.5%，RSD為1.37%，表明此法回收率良好。

3.2.6 樣品含量測定

取各批次炭制紫草，按“3.2.2.1 供試品溶液制備”平行制備供試品溶液，自動進樣10.00 μL，按“3.2.1 色譜條件”項下條件測定，記錄色譜圖，計算含量，批號為160101、907樣品含量測定結果如下表8。

由于產(chǎn)地、藥材形狀差異，5 個不同批次產(chǎn)地紫草原藥材中β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧含量有較大差異。表1 中列出兩個原藥材中β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧含量差別比較大的批次的炮制品的含量變化，發(fā)現(xiàn)含量降低百分比基本相同。最佳炭制工藝（350-400 ℃15 min）時，各批次炭制紫草中β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧含量均有降低趨勢，但與原藥材相比，降低率不同，故炭制工藝的穩(wěn)定性有待提高。

4 不同紫草炭制品的萘醌類成分變化研究

我們通過HPLC-MS 分析及文獻［18，19］對比研究，從紫草原藥材和炮制品中共鑒定出7 個萘醌類成分，分別為β-羥基異戊酰紫草素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基-異戊酰紫草素、丁酰紫草素、β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧、異戊酰紫草素，其中保留時間8.2min 出峰的組分為未知組分。通過色譜圖的峰面積初步比較了各組分的含量變化。各組分的含量隨著炮制溫度的增加，都有所減少。

5 止血作用研究

5.1 小鼠全血凝血時間(CT)的測定(毛細管法)

小鼠 60 只,隨機分組,每組 10 只,雌雄各半,ig 給予25 mg·kg-1(干藥材量/動物體重,下同)的生理鹽水空白對照組、160101A（紫草原藥材）、160101C（350-400 ℃15 min）、160101E（450-500 ℃10 min）的混懸液,以及0.5 mg·kg-1的云南白藥混懸液作為陽性對照組,連續(xù)給藥3 天,末次給藥1 h 時每鼠眼后靜脈叢取血,以毛細管法測定凝血時間［20］。結果見表9，發(fā)現(xiàn)云南白藥陽性對照組及給藥三組均與與空白對照組比較具有顯著差異（P＜0.01），延長全血凝血時間效果明顯，且160101C炮制組的凝血時間最短，但是給藥組之間均沒有太明顯的差異。

5.2 小鼠出血時間的測定

取小鼠60 只,雌雄各半, 隨機分成6 組,分別灌胃各制品溶液、云南白藥和生理鹽水,給藥體積為20 mL·kg-1,每天 1 次,連續(xù)灌胃 5 天,末次給藥 1 h 后用解剖剪距小鼠尾尖3 mm 處橫向剪斷,待血液自行溢出計時,每30 s 用濾紙吸血1 次,直至血液自然停止,所需的時間即為出血時間［20］。結果見表9，發(fā)現(xiàn)云南白藥陽性對照組及給藥三組均與與空白對照組比較具有顯著差異（P＜0.01），延長全血凝血時間效果為明顯，且160101C 炮制組的凝血時間最短，但是給藥組之間均沒有太明顯的差異。

表7 加樣回收率試驗

表8 樣品含量測定

表9 紫草原藥材及炭制品的小鼠凝血時間和出血時間的測定（）

表9 紫草原藥材及炭制品的小鼠凝血時間和出血時間的測定（）

注：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 于空白對照組比較

?

6 結果與討論

本實驗通過不同溫度和時間，對5 個批次的新疆紫草進行炭制，發(fā)現(xiàn)350-400 ℃15 min 的炭制工藝，使藥材外部炭化、內(nèi)部保留固有性能(存性)，因此將此條件定為紫草最佳炭制工藝。通過與原藥材和不同炭制品中羥基萘醌總色素和β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧含量測定發(fā)現(xiàn)，炮制品中的含量隨著炮制溫度的提高逐漸下降，當溫度達到500-600 ℃高溫時，萘醌類成分的含量均減低到90%以上。小鼠凝血實驗表明，炭制后的藥材均有一定的止血作用，且160101C 炮制組的凝血時間和出血時間最短，但是紫草原藥材和炭制品之間沒有出現(xiàn)顯著性差異。本研究為紫草炭制品的利用和開發(fā)提供了一定的實驗數(shù)據(jù)和理論基礎。