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    塞來(lái)昔布聯(lián)合運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)人結(jié)腸癌小鼠移植瘤的影響及其機(jī)制

    2020-04-18 02:18:48趙玉琛韓娟娟張新安
    關(guān)鍵詞:塞來(lái)結(jié)腸癌生存率

    趙玉琛,韓娟娟,張新安

    (1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)體育部,沈陽(yáng) 110122;2.沈陽(yáng)體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)學(xué)院運(yùn)動(dòng)生理生化教研室,沈陽(yáng) 110102)

    結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是最常見的惡性腫瘤之一,是癌癥相關(guān)死亡的重要原因[1]。目前,CRC的主要治療方式為手術(shù)、放射治療和化學(xué)治療[2]。塞來(lái)昔布是一種高選擇性環(huán)氧化酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)抑制劑,為新型非甾體抗炎藥,是治療CRC的重要藥物[3-5]。

    血管生成在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中至關(guān)重要,抑制血管生成是一種有效的癌癥治療手段[6]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β,TGF-β1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和CD105均為重要的血管生成因子,與CRC浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[6]。腫瘤微血管密度(microvessel density,MVD)是反映血管生成的可靠指標(biāo),與腫瘤的生長(zhǎng)浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7]。CD105抗體標(biāo)記的MVD是判斷CRC血管生成的有效指標(biāo)[8]。

    研究[9-11]證實(shí),運(yùn)動(dòng)鍛煉與癌癥的發(fā)生、發(fā)展及腫瘤細(xì)胞的增殖擴(kuò)散密切相關(guān),運(yùn)動(dòng)可通過(guò)調(diào)節(jié)代謝、性激素水平、免疫抑制和炎癥反應(yīng)等途徑抑制CRC生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移,降低腫瘤復(fù)發(fā)率和死亡率。近年來(lái),對(duì)癌癥患者在藥物治療的基礎(chǔ)上聯(lián)合運(yùn)動(dòng)干預(yù)取得了較好的臨床療效[12-13]。本研究擬通過(guò)塞來(lái)昔布聯(lián)合運(yùn)動(dòng)干預(yù)人結(jié)腸癌移植瘤小鼠,探討藥物聯(lián)合運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)人結(jié)腸癌移植瘤小鼠生存率及移植瘤生長(zhǎng)相關(guān)因子的影響及其機(jī)制,為CRC的防治策略提供理論參考。

    1 材料與方法

    1.1 建模

    雌性BALB/c小鼠90只,4~5周齡,體質(zhì)量15~20 g,購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心[許可證號(hào):SCXK(遼)2017-0001]。于無(wú)特定病原體環(huán)境的層流架中使用無(wú)菌飼料及滅菌純凈水飼養(yǎng)。造模前,所有小鼠先進(jìn)行為期1周的適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練,環(huán)境溫度(26±2)℃,光照周期12∶12,濕度55%±4%。

    人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院(上海)細(xì)胞庫(kù),小牛血清購(gòu)自杭州四季青公司,胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Hyclon公司。用含10%新生牛血清、100 U/mL青鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基,在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HT-29細(xì)胞。胰蛋白酶消化并傳代后,制成細(xì)胞懸液。小鼠跑臺(tái)適應(yīng)性訓(xùn)練后24 h,于頸背部皮下接種上述細(xì)胞懸液0.2 mL。本研究嚴(yán)格按照國(guó)際倫理指南和美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理與使用指南進(jìn)行,并獲得中國(guó)醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

    1.2 分組及干預(yù)方案

    建模過(guò)程中,定期用游標(biāo)卡尺測(cè)量移植瘤長(zhǎng)徑。移植瘤最大直徑達(dá)5 mm(細(xì)胞種植15 d)時(shí),開始進(jìn)行藥物及運(yùn)動(dòng)干預(yù)。選取移植瘤直徑誤差2 mm以內(nèi)的80只小鼠,并隨機(jī)分為A、B組,每組40只。2組再分別隨機(jī)分為4組:(1)腫瘤對(duì)照(Ca)組,每天給予滅菌蒸餾水灌胃;(2)跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)(TE)組;(3)塞來(lái)昔布(Ce)組,給予塞來(lái)昔布(日本輝瑞制藥公司)50 mg·kg-1·d-1灌胃;(4)跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)+塞來(lái)昔布(TE+Ce)組,每天跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后塞來(lái)昔布灌胃。每天記錄A組小鼠的死亡情況,直至全部死亡,分析生存情況。B組于干預(yù)5周后,靜脈穿刺抽血,處死所有存活小鼠,分離腫瘤組織冷藏備用,用于測(cè)定血清TGF-β1、VEGF水平、腫瘤組織CD105標(biāo)記的MVD以及腫瘤體積變化情況。腫瘤體積估算公式:V=ab2/2。其中,a為長(zhǎng)徑,b為短徑。

    1.3 血清TGF-β1及VEGF測(cè)定

    取小鼠血樣,于4℃下,800 r/min離心30 min,3 000 r/min離心10 min,收集血清,-80 ℃保存待測(cè)。按照TGF-β1酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(武漢博士德公司)及VEGF酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(R&D Systems公司)說(shuō)明,檢測(cè)血清TGF-β1、VEGF水平。

    1.4 小鼠移植瘤組織CD105標(biāo)記的MVD計(jì)數(shù)

    采用免疫染色法測(cè)量CD105標(biāo)記的MVD。制移植瘤組織切片(厚度5 μm),常規(guī)脫蠟,孵育浸泡沖洗,用胰蛋白酶暴露胞內(nèi)抗原,滴加一抗(鼠抗人CD105單克隆抗體),PBS沖洗,滴加二抗(羊抗鼠IgG抗體),脫水封固。血管內(nèi)皮細(xì)胞膜呈棕黃色為陽(yáng)性染色。低倍(×10)視野下選取5個(gè)新生血管最密集區(qū)域,在高倍(×400)視野下觀察計(jì)數(shù)血管(單個(gè)棕色細(xì)胞或細(xì)胞叢為1個(gè)血管),計(jì)算血管均數(shù)。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    2 結(jié)果

    2.1 跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)和塞來(lái)昔布對(duì)人結(jié)腸癌小鼠生存率的影響

    經(jīng)過(guò)63 d塞來(lái)昔布和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù),小鼠生存率變化曲線如圖1所示,TE+Ce組生存率明顯高于其他組,與Ca組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P< 0.01)。提示單一塞來(lái)昔布、單一運(yùn)動(dòng)、塞來(lái)昔布聯(lián)合運(yùn)動(dòng)干預(yù)均可延長(zhǎng)人結(jié)腸癌小鼠的生存時(shí)間,提高其生存率,而塞來(lái)昔布聯(lián)合運(yùn)動(dòng)干預(yù)效果最顯著。

    2.2 塞來(lái)昔布和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)人結(jié)腸癌小鼠移植瘤體積的影響

    經(jīng)過(guò)35 d的塞來(lái)昔布和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù),如圖2所示,TE組、Ce組、TE+Ce組小鼠移植瘤體積均顯著小于Ca組(P< 0.05,P< 0.01,P< 0.01);TE+Ce組移植瘤體積小于TE組和Ce組(均P< 0.01)。提示單一塞來(lái)昔布、單一運(yùn)動(dòng)干預(yù)、塞來(lái)昔布聯(lián)合運(yùn)動(dòng)干預(yù)均可抑制人結(jié)腸癌小鼠移植瘤生長(zhǎng),而塞來(lái)昔布聯(lián)合運(yùn)動(dòng)干預(yù)效果最佳。

    圖2 不同干預(yù)條件下小鼠移植瘤的體積Fig.2 Tumor volume of mice under different intervention

    2.3 塞來(lái)昔布和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)人結(jié)腸癌小鼠TGF-β1、VEGF及CD105標(biāo)記的MVD的影響

    塞來(lái)昔布和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)35 d后,Ca與Ce組CRC移植瘤小鼠血清TGF-β1水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,TE組、TE+Ce組則顯著低于其他2組(圖3A),提示單一運(yùn)動(dòng)干預(yù)和塞來(lái)昔布聯(lián)合運(yùn)動(dòng)干預(yù)均可降低CRC小鼠血清TGF-β1水平,且塞來(lái)昔布聯(lián)合運(yùn)動(dòng)干預(yù)的抑制效果顯著優(yōu)于單一塞來(lái)昔布或跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)。

    TE組、Ce組、TE+Ce組小鼠血清VEGF水平均顯著低于Ca組,3組間比較也存在顯著差異(圖3B),提示單一塞來(lái)昔布、單一運(yùn)動(dòng)干預(yù)、塞來(lái)昔布聯(lián)合運(yùn)動(dòng)干預(yù)均可明顯降低人CRC小鼠血清VEGF水平,且塞來(lái)昔布聯(lián)合運(yùn)動(dòng)干預(yù)的效果明顯優(yōu)于單一塞來(lái)昔布或運(yùn)動(dòng)干預(yù),單一塞來(lái)昔布與單一運(yùn)動(dòng)干預(yù)效果相當(dāng)。

    圖3 不同干預(yù)條件下小鼠TGF-β1、VEGF的表達(dá)及CD105標(biāo)記的MVDFig.3 TGF-β1,VEGF expression and CD105-labeled MVD of mice under different intervention

    CD105標(biāo)記的MVD計(jì)數(shù)結(jié)果顯示,Ce組、TE組與TE+Ce組均顯著低于Ca組,TE+Ce組顯著低于Ce組和TE組,而后2組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖3C)。提示單一塞來(lái)昔布、單一運(yùn)動(dòng)干預(yù)、塞來(lái)昔布聯(lián)合運(yùn)動(dòng)干預(yù)均可顯著降低人CRC小鼠移植瘤組織CD105標(biāo)記的MVD計(jì)數(shù),塞來(lái)昔布聯(lián)合運(yùn)動(dòng)干預(yù)的效果明顯優(yōu)于單一的塞來(lái)昔布或運(yùn)動(dòng)干預(yù),且單一塞來(lái)昔布與單一運(yùn)動(dòng)干預(yù)效果相當(dāng)。

    2.4 人結(jié)腸癌小鼠血清TGF-β1、VEGF水平與CD105標(biāo)記的MVD計(jì)數(shù)的相互關(guān)系

    人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29種植50 d后,對(duì)Ca組小鼠血清TGF-β1、VEGF水平和CD105標(biāo)記的MVD計(jì)數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果顯示,TGF-β1水平與VEGF水平及CD105標(biāo)記的MVD計(jì)數(shù)均呈中度正相關(guān)(r=0.688 5,P=0.013 3;r=0.629 1,P=0.028 2),VEGF水平與CD105標(biāo)記的MVD計(jì)數(shù)呈高度正相關(guān)(r=0.915 0,P< 0.001)。

    3 討論

    血管生成是癌細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)展的典型特征,是判斷腫瘤預(yù)后的重要標(biāo)志之一[14]。TGF-β1、VEGF、CD105是血管生長(zhǎng)的重要標(biāo)記因子[15]。TGF-β1是一種具有調(diào)控血管形成與腫瘤細(xì)胞增殖分化的多肽鏈,它在腫瘤組織中高表達(dá)提示腫瘤更具侵襲性且預(yù)后不良[16]。VEGF是一種血管內(nèi)皮細(xì)胞刺激因子,可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、分裂以及血管生成,為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供必需的營(yíng)養(yǎng)和氧氣[17]。VEGF在直腸癌中高表達(dá),與腫瘤生長(zhǎng)侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān),是評(píng)價(jià)CRC預(yù)后的參考指標(biāo)之一[10]。CD105是TGF-β1受體復(fù)合物之一,主要存在于血清中,在新生的內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá),是檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和腫瘤新生血管的特異性標(biāo)志物[10];MVD是衡量和評(píng)價(jià)腫瘤血管生成的可靠指標(biāo),與腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有關(guān)。CD105標(biāo)記的MVD與CRC的發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān),是判斷預(yù)后的重要指標(biāo)[10,18-19]。研究[19-20]表明,TGF-β1能夠誘導(dǎo)VEGF表達(dá),VEGF表達(dá)與CD105標(biāo)記的MVD呈顯著正相關(guān)。SAITO等[8]發(fā)現(xiàn)胃癌組織中TGF-β1可上調(diào)VEGF表達(dá),刺激腫瘤血管形成,使腫瘤組織MVD增多,促使腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示,人結(jié)腸癌小鼠血清TGF-β1、VEGF水平和CD105標(biāo)記的MVD計(jì)數(shù)呈正相關(guān),提示三者共同參與了結(jié)腸腫瘤新生血管形成,共同調(diào)節(jié)腫瘤的生長(zhǎng)發(fā)展。

    非甾體抗炎藥昔布類選擇性COX-2抑制劑在CRC的防治中發(fā)揮著重要作用。研究[3]表明,塞來(lái)昔布可抑制結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞增殖分化,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,抑制腫瘤新生血管生成,其機(jī)制尚未完全明確,可能與塞來(lái)昔布激活了調(diào)控細(xì)胞周期的因子、提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、抑制COX-2通路等有關(guān)[4-5]。越來(lái)越多的證據(jù)表明,運(yùn)動(dòng)不但可以降低不同類型惡性腫瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn),還能抑制腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移,延長(zhǎng)生存時(shí)間[21]。運(yùn)動(dòng)可以參與癌癥治療的全過(guò)程,被證實(shí)是一種安全有效的干預(yù)方式,具有很好的耐受性[22]。研究[13,23]發(fā)現(xiàn),塞來(lái)昔布和運(yùn)動(dòng)可能直接作用于某些血管標(biāo)志物,抑制腫瘤血管生成,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn),塞來(lái)昔布聯(lián)合運(yùn)動(dòng)干預(yù)可顯著提高人結(jié)腸癌小鼠生存率,抑制移植瘤體積增長(zhǎng),降低血清TGF-β1、VEGF水平及移植瘤組織CD105標(biāo)記的MVD計(jì)數(shù),且效果顯著優(yōu)于單一塞來(lái)昔布或運(yùn)動(dòng)干預(yù)。提示塞來(lái)昔布和運(yùn)動(dòng)干預(yù)能抑制腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展,提高生存率,二者均可通過(guò)抑制TGF-β1、VEGF、CD105標(biāo)記的MVD水平,抑制新生血管的形成,并可能存在協(xié)同效應(yīng)。

    研究[19]表明,VEGF和CD105標(biāo)記的MVD是預(yù)測(cè)患者預(yù)后的可靠指標(biāo),VEGF、CD105高表達(dá)的CRC患者預(yù)后較差。本研究發(fā)現(xiàn),TGF-β1表達(dá)水平也同樣與CRC小鼠生存率有關(guān),它可能是預(yù)測(cè)患者預(yù)后的另一指標(biāo),聯(lián)合檢測(cè)TGF-β1、VEGF、CD105標(biāo)記的MVD水平是否會(huì)提高判斷CRC預(yù)后的可靠性和精確性,有待進(jìn)一步研究。研究[24]發(fā)現(xiàn),塞來(lái)昔布在誘導(dǎo)CRC細(xì)胞凋亡時(shí),可通過(guò)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(與COX-2無(wú)關(guān)的途徑)提高VEGF水平,從而削弱塞來(lái)昔布對(duì)腫瘤的抑制作用,容易帶來(lái)耐藥性。本研究中,塞來(lái)昔布聯(lián)合運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)VEGF的抑制作用優(yōu)于單一的塞來(lái)昔布治療,其原因可能與運(yùn)動(dòng)抑制了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激這一負(fù)面效應(yīng)有關(guān)。

    綜上所述,塞來(lái)昔布聯(lián)合運(yùn)動(dòng)干預(yù)可有效抑制人結(jié)腸癌小鼠移植瘤的生長(zhǎng),提高小鼠生存率,其效果優(yōu)于單一的塞來(lái)昔布或運(yùn)動(dòng)干預(yù),是一種有效的CRC防治手段。二者可能是通過(guò)抑制TGF-β1、VEGF表達(dá)及CD105標(biāo)記的MVD,從而抑制腫瘤血管形成,而且可能在抗腫瘤血管生成、抑制CRC發(fā)展中存在協(xié)同作用。

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