強(qiáng)制性運(yùn)動療法對腦缺血大鼠認(rèn)知功能的影響及其作用機(jī)制

李美璇，董炳超，王曉銀，程希，趙傳勝，趙珊珊

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽 110001）

強(qiáng)制性運(yùn)動療法（constraint-induced movement therapy，CIMT）是在生活環(huán)境中一定程度上限制患者使用健側(cè)的肢體，從而強(qiáng)制其反復(fù)使用患肢的療法。CIMT已被廣泛地應(yīng)用于康復(fù)領(lǐng)域，并在臨床試驗中被證實能夠有效地促進(jìn)腦卒中后患者的肢體功能恢復(fù)［1-2］。前期腦缺血動物實驗［3-6］發(fā)現(xiàn)，CIMT除了能夠促進(jìn)腦缺血后大鼠的運(yùn)動功能恢復(fù)，還能夠顯著地增加腦缺血后的神經(jīng)再生與軸突再生，并促進(jìn)腦缺血后認(rèn)知功能的恢復(fù)。目前對于CIMT改善腦缺血后大鼠認(rèn)知功能的作用機(jī)制尚無相關(guān)研究報道。已有許多研究［7-10］表明，沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）在改善腦缺血后認(rèn)知功能方面具有重要的作用，本研究通過檢測CIMT對腦缺血后大鼠海馬區(qū)域SIRT1及BDNF表達(dá)的影響來探討其改善腦缺血后大鼠認(rèn)知功能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑及分組

成年雄性Wistar大鼠（200～250 g）購自北京維通利華實驗技術(shù)有限公司，維持飼養(yǎng)環(huán)境室溫25 ℃左右，術(shù)前12 h禁食，自由飲水。內(nèi)皮素1（endothelin-1，ET-1）購自美國Sigma公司；SIRT1以及BDNF抗體購自美國Abcam公司；Alexa 568、Alexa488 免疫熒光二抗購自美國Invitrogen公司。將大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組（Sham組）、缺血組（ISC組）、缺血后給予CIMT組（ISC+CIMT組），每組8只。

1.2 方法

1.2.1 大鼠局灶性腦缺血模型制備［5］：參照大鼠腦解剖圖譜，使用立體定位儀將ET-1注射到大鼠大腦皮質(zhì)運(yùn)動區(qū)及紋狀體區(qū)域以制作局灶性腦缺血模型。使用微量注射器將ET-1（0.5 μL/min）注入以下3個位點(diǎn)［2 μL/點(diǎn)，前囟為中心向側(cè)方（mediolateral，ML）、前囟為中心向前方（anteroposterior，AP）、前囟為中心向下方（dorsoventral，DV）］［11］，（1）AP=0.7 mm，ML=2.2 mm，DV=-2.0 mm；（2）AP=2.3 mm，ML=2.5 mm，DV=-2.3 mm；（3）AP=0.7 mm，ML=3.8 mm，DV=-5.8 mm。每個位點(diǎn)注射 2次，每次1 μL，間隔1 min。每位點(diǎn)注射完畢將注射器針頭在針道內(nèi)停留3 min，然后緩慢拔出。Sham組在相同的位點(diǎn)注射等量的生理鹽水。注射ET-1大鼠清醒后，若大鼠出現(xiàn)提尾倒懸時右上肢向胸前屈曲或行走時向右側(cè)傾倒或者向右側(cè)轉(zhuǎn)圈，且癥狀持續(xù)超過24 h，則可判定為腦缺血模型制作成功。

1.2.2 大鼠腦缺血后CIMT模型：參照以往實驗［5］，術(shù)后1周開始將大鼠上部軀干及梗死病灶同側(cè)前肢緊靠胸骨置于自然回縮姿勢，采用石膏繃帶進(jìn)行固定，以此來限制大鼠健側(cè)前肢的活動，建立CIMT模型，持續(xù)3周。

1.2.3 免疫熒光染色：采用免疫熒光染色方法檢測海馬齒狀回（dentate gyrus，DG），CA1和CA3區(qū)SIRT1和BDNF的表達(dá)情況。冰凍切片（厚度10 μm）免疫熒光染色采用貼片法在室溫下進(jìn)行。切片先復(fù)溫30 min，后在丙酮內(nèi)固定15 min，固定結(jié)束在0.01 mol/L PBS浸洗后依次加入75%、85%、95%和100%乙醇各5 min水化。然后用0.01 mol/L PBS浸洗3次，每次5 min。SIRT1冰凍切片在pH=6.0的檸檬酸鹽修復(fù)液中高溫高壓修復(fù)2 min后冷卻至室溫。BDNF冰凍切片在pH9.0的Tris-EDTA修復(fù)液中加熱，直至修復(fù)液中出現(xiàn)氣泡，停止加熱并計時5 min，重復(fù)上述步驟3次。兩種抗原修復(fù)后切片均在0.01 mol/L PBS浸洗3次，每次5 min。之后用抗原封閉液（0.01 mol/L PBS，0.4%Triton X-100和10%山羊血清）孵育50 min后加一抗（mouse anti-SIRT1抗 體1∶400；Rabbit anti-BDNF抗體1∶400），在抗體稀釋液中4 ℃過夜。一抗過夜后0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次5 min，熒光共軛二抗（Alexa Fluor 568 Goat anti-Mouse 1∶200；Alexa Fluor 488 Goat anti-Rabbit 1∶200）避光孵育2 h，避光條件下用0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次5 min。DAPI孵育5 min后再用PBS避光漂洗3次，每次5 min。最后使用抗熒光淬滅封片劑封片。

1.2.4 圖像處理與分析：采用激光共聚焦顯微鏡及其成像系統(tǒng)（日本Olympus，F(xiàn)V-1000）觀測ISC組及ISC+CIMT組大鼠缺血側(cè)以及Sham組大鼠注水側(cè)的海馬DG、CA1及CA3區(qū)SIRT1和BDNF的表達(dá)。同時對每只大鼠海馬DG 區(qū)、CA3區(qū)、CA1區(qū)隨機(jī)選取的3個部位進(jìn)行激光薄層掃描，然后對Z軸系列圖層進(jìn)行三維重建。用NIH ImageJ軟件對目標(biāo)染色進(jìn)行光密度值統(tǒng)計，其光密度值代表SIRT1和BDNF的表達(dá)水平。

1.2.5 水迷宮實驗［6］：大鼠腦缺血術(shù)后31 d，采用Morris水迷宮（淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司）及圖像分析系統(tǒng)（美國HVS Image公司）對大鼠進(jìn)行認(rèn)知功能測試。定位航行實驗即分別從水迷宮4個象限的池壁中點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水中，記錄大鼠在120 s內(nèi)從入水到登上平臺所需時間（逃避潛伏期）。每次任務(wù)的起點(diǎn)都要改變，而且平臺的位置每天都被更換，連續(xù)進(jìn)行3 d，逃避潛伏期和大鼠找到平臺前游泳的距離被用來評價水迷宮的成績。最后1 d定位航行實驗結(jié)束后將平臺撤離進(jìn)行空間探索實驗，記錄目標(biāo)象限60 s內(nèi)大鼠穿越原來平臺所在位置的次數(shù)及游泳軌跡。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠海馬SIRT1表達(dá)水平的比較

免疫熒光染色結(jié)果顯示，ISC組大鼠海馬DG區(qū)、CA1區(qū)、CA3區(qū)SIRT1的表達(dá)水平與Sham組相比均無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞ 0.05）。ISC+CIMT組大鼠海馬DG區(qū)、CA1區(qū)SIRT1的表達(dá)較ISC組均顯著增加（P＜0.01，P＜ 0.05）。而ISC+CIMT組海馬CA3區(qū)SIRT1的表達(dá)水平較ISC組有增高趨勢，但沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞ 0.05）。見圖1。

圖1 腦缺血后33 d各組大鼠海馬各區(qū)SIRT1的表達(dá)情況（DG×100，CA1×400，CA3×200）Fig.1 Immunofluorescence staining of SIRT1 expression in the hippocampus of the rats in each group，33 days after cerebral ischemia（DG×100，CA1×400，CA3×200）

2.2 各組大鼠海馬區(qū)域BDNF表達(dá)水平的比較

免疫熒光染色結(jié)果顯示，ISC組海馬DG、CA1區(qū)的BDNF表達(dá)水平較Sham組有增多趨勢，ISC+CIMT組海馬DG和CA1區(qū)BDNF的表達(dá)較ISC組有減少趨勢，但3組間海馬DG、CA1區(qū)BDNF的表達(dá)水平?jīng)]有統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞ 0.05）。見圖2。

ISC組海馬CA3區(qū)BDNF的表達(dá)水平與Sham組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞ 0.05）；ISC+CIMT組海馬CA3區(qū)BDNF的表達(dá)較ISC組略減少，但2組差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。見圖2。

2.3 水迷宮實驗結(jié)果

重復(fù)測量方差分析結(jié)果顯示，各組大鼠水迷宮定位航行實驗逃避潛伏期具有統(tǒng)計學(xué)差異（F=11.80，P＜ 0.01）。與Sham組比較，ISC組大鼠逃避潛伏期明顯增加（P＜ 0.01），給予CIMT后可以明顯降低缺血后大鼠逃避潛伏期（P＜ 0.05）。單因素方差分析結(jié)果也提示在定位航行實驗的第2天和第3天，ISC組大鼠逃避潛伏期較Sham組明顯增加（P＜0.01），ISC+CIMT 組大鼠的逃避潛伏期較ISC組明顯減低（P＜ 0.05）。空間探索實驗結(jié)果提示ISC組大鼠在60 s內(nèi)穿越平臺所在位置的次數(shù)較SHAM組大鼠明顯減少（P＜ 0.01），ISC+CIMT組大鼠穿越平臺所在位置的次數(shù)較ISC組明顯增加（P＜ 0.01），見表1。

3 討論

本研究大鼠行為學(xué)測試結(jié)果顯示，ISC組大鼠認(rèn)知功能較Sham組明顯下降，腦缺血后CIMT治療可以顯著改善腦缺血后大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。免疫熒光檢測結(jié)果顯示CIMT能夠顯著提高腦缺血后大鼠海馬DG和CA1區(qū)SIRT1的表達(dá)水平；腦缺血后海馬DG和CA1區(qū)BDNF的表達(dá)較Sham組有增加趨勢，CIMT治療在一定程度上減少了腦缺血后BDNF的表達(dá)。

圖2 腦缺血后33 d各組大鼠海馬各區(qū)BDNF的表達(dá)情況（DG×100，CA1×400，CA3×200）Fig.2 Immunofluorescence staining of BDNF expression in the hippocampus of the rats in each group，33 days after cerebral ischemia（DG×100，CA1×400，CA3×200）

表1 各組大鼠逃避潛伏期和穿越平臺所在位置的次數(shù)比較Tab.1 Comparison between the escape latency and times of crossing the platform for rats in each group

近年來，SIRT1對神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控作用引起了人們的廣泛關(guān)注，多項研究［12-14］表明SIRT1在突觸可塑性和記憶的形成發(fā)揮關(guān)鍵作用。SIRT1是一類進(jìn)化上保守的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的組蛋白去乙?；讣易宄蓡T之一，是廣泛存在于哺乳動物中NAD+依賴的去乙酰化酶，在哺乳動物的腦神經(jīng)元中高度表達(dá)，可通過增加線粒體再生、抗凋亡、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄水平等機(jī)制對神經(jīng)元進(jìn)行修復(fù)［15-16］。有研究［17-18］報道康復(fù)運(yùn)動可通過提高大腦SIRT1的表達(dá)抵抗衰老，動物實驗表明跑臺運(yùn)動可能通過激活SIRT1通路改善阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠的認(rèn)知功能。本研究結(jié)果提示CIMT可以顯著改善腦缺血后大鼠的水迷宮測試成績，同時增加腦缺血后大鼠海馬各區(qū)域SIRT1的表達(dá)，說明CIMT可能是通過SIRT1相關(guān)通路起到促進(jìn)腦缺血后認(rèn)知功能恢復(fù)的作用。

BDNF是一個對運(yùn)動訓(xùn)練敏感的促進(jìn)神經(jīng)再生和突觸發(fā)生的因子，在腦組織廣泛表達(dá)，特別是在海馬區(qū)，對學(xué)習(xí)和記憶形成有重要作用。BDNF可能參與改善大腦認(rèn)知功能［19］。

有研究［20-21］表明SIRT1可通過調(diào)節(jié)甲基-CpG結(jié)合蛋白2與BDNF基因啟動子的結(jié)合狀態(tài)調(diào)控BDNF的轉(zhuǎn)錄來改善認(rèn)知。另外SIRT1也可通過與包含轉(zhuǎn)錄因子的抑制復(fù)合物相互作用而減少miR-134表達(dá)，最終促進(jìn)BDNF以及環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)長時程增強(qiáng)效應(yīng)形成介導(dǎo)學(xué)習(xí)記憶功能。本研究結(jié)果提示腦缺血后大鼠DG及CA1區(qū)BDNF的表達(dá)較Sham組增加，ISC+CIMT組大鼠海馬各區(qū)域BNDF的表達(dá)較ISC組有減低趨勢，但差異均沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05），可能是因為樣本量過小或者各組內(nèi)樣本差異過大所致。CIMT減少腦缺血后BDNF的表達(dá)究其原因可能是采用CIMT固定大鼠健側(cè)肢體會引起大鼠緊張，長期處于緊張壓力狀態(tài)導(dǎo)致慢性應(yīng)激會影響腦缺血大鼠海馬BDNF的表達(dá)。已有研究證實自主運(yùn)動可明顯促進(jìn)腦缺血后大鼠海馬BDNF的表達(dá)，同時使大鼠表現(xiàn)出更少的皮質(zhì)醇應(yīng)激反應(yīng)，而給予強(qiáng)制性運(yùn)動后大鼠的血清皮質(zhì)醇濃度較自主運(yùn)動組大鼠明顯增高，其體內(nèi)高應(yīng)激反應(yīng)抑制了海馬BDNF的表達(dá)［22-23］。

本研究結(jié)果表明，CIMT雖然增加了SIRT1的表達(dá)，但并不是通過SIRT1-BDNF通路來起到改善腦缺血后認(rèn)知功能的作用。SIRT1可以通過多種機(jī)制對缺血保護(hù)起重要作用，主要包括促進(jìn)線粒體功能并抗氧化、DNA修復(fù)、改善突觸功能，參與NAD+代謝的神經(jīng)保護(hù)以及調(diào)節(jié)血液流動和神經(jīng)炎癥［9］。還有研究［24］證實褪黑素可以通過SIRT1-FoxO1通路改善認(rèn)知。FoxO1是自噬調(diào)節(jié)的主要調(diào)節(jié)因子，其介導(dǎo)的自噬能夠改善血管性癡呆模型大鼠的認(rèn)知功能［25］。近些年的動物模型相關(guān)實驗［26］也顯示自噬對血管性癡呆模型的大鼠起神經(jīng)保護(hù)作用。CIMT是否通過SIRT1相關(guān)的其他通路改善腦缺血后大鼠認(rèn)知功能，需要將來進(jìn)一步研究加以驗證。

綜上所述，本研究從形態(tài)學(xué)角度結(jié)合行為學(xué)測試探討了CIMT對腦缺血后大鼠認(rèn)知功能改善的作用及可能的作用機(jī)制。證實了 CIMT可以顯著改善腦缺血后的認(rèn)知功能障礙，且CIMT可能通過SIRT1相關(guān)信號通路發(fā)揮其改善腦缺血后大鼠認(rèn)知功能的作用，SIRT1通路下游的具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步探索。

本研究結(jié)果對于深入了解腦缺血后中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自我修復(fù)能力具有重要的意義，并為腦梗死后的認(rèn)知功能恢復(fù)提供了新的理論基礎(chǔ)和治療靶點(diǎn)。