利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構建人源結腸癌SAMHD1基因敲除細胞株及其功能的初步研究

張洲，操孫潤，武晉英，馬孟濤，宋曉宇

（中國醫(yī)科大學轉化醫(yī)學研究院，沈陽 110122）

結腸癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率已居全球第3位，死亡率也位于惡性腫瘤前列［1］。由于結腸癌細胞具有快速增殖能力和轉移能力，結腸癌的發(fā)病率和致死率呈逐年上升趨勢。近年研究表明，免疫基因在結腸癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用，探討免疫相關基因和蛋白在結腸癌細胞中的功能和作用，對結腸癌的防治具有重要意義。包含SAM和HD結構域的1型蛋白（sterile alpha motif and histidine-aspartic acid domain containing protein 1，SAMHD1）是一種脫氧核苷酸三磷酸水解酶，在維持細胞脫氧核糖核苷酸穩(wěn)態(tài)平衡中發(fā)揮重要作用［2-3］。SAMHD1蛋白首次發(fā)現于樹突狀細胞，細胞SAMHD1基因突變會導致機體產生嚴重的免疫性疾病，如Aicardi-Goutières綜合征、系統(tǒng)性狼瘡、腦萎縮、癌癥等［4］。常間回文重復序列叢集（clustered regularly interspaced palindromic repeat，CRISPR）/常間回文重復序列叢集關聯蛋白9（CRISPR-associated protein，Cas9）系統(tǒng)是細菌和古細菌形成的一種免疫防御系統(tǒng)，利用單向導RNA（single-guide RNA，sgRNA）介導的Cas9 蛋白對基因組DNA進行特異性切割，從而達到更好的基因編輯作用，可幫助研究人員了解疾病分子機制［5-7］。為了探究SAMHD1蛋白在結腸癌細胞中的生物學功能和分子機制，本研究通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除SAMHD1基因，構建了SAMHD1基因敲除的HCT116人源結腸癌細胞株，進一步檢測SAMHD1對結腸癌細胞增殖能力的影響，為深入研究SAMHD1在結腸癌細胞中作用的分子機制提供可選模型和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

pYSY-CMV-Cas9-EF1α-Puromycin質粒購自南京堯順禹生物科技有限公司；人結腸癌細胞（HCT116）購自于美國ATCC公司；T4 連接酶、E.coliDH5α購自日本TaKaRa公司；Tubofect transfection試劑購自美國Thermo Scientific公 司；anti-SAMHD1、β-actin抗體購自美國CST公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質粒小提試劑盒、無內毒素質粒中提試劑盒、細胞基因組DNA提取試劑盒、嘌呤霉素、IMDM培養(yǎng)基、限制性內切酶BbsⅠ均購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 人源SAMHD1基因結構分析及靶點設計：在美國國家生物技術信息中心數據庫里找到人源SAMHD1的mRNA，根據實驗目的選定目標結構域cd00077，找到該結構域對應的氨基酸序列中第一個M及核苷酸序列中對應的起始密碼子，確定該起始密碼子所在的外顯子，輸入預測sgRNA網站（http：//crispr.mit.edu）進行預測。選取最高分引物：上游引物，5’-CACCGTATTCCACTTGCTCGCCCGG-3’；下游引物，5’-AAACCCGGGCGAGCAAGTGGAATAC-3’。在核酸序列nucleotide中找到sgRNA序列位置，并找到合適的鑒定引物位置，再使用DNACLUB進行檢測，觀察GC比例等。設計鑒定引物：上游引物，5’-GGCAACAAGAGCGAAACTCCGTCT-3’；下游引物，5’-CAGTGTCCAGGGTGCTTTCATTCACA-3’。

1.2.2 pYSY-CMV-Cas9-EF1α-Puromycin-sgRNASAMHD1重組質粒構建及克?。菏褂孟拗菩詢惹忻窧bsⅠ酶切質粒使pYSY-CMV-Cas9-EF1α-Puromycin線性化，隨后切膠回收。將合成的單鏈sgRNA常規(guī)退火后形成雙鏈，用T4連接酶將之與純化后的線性質粒連接。然后將連接產物轉化到E.coliDH5α感受態(tài)中，涂于 AMP抗性的LB平板上。過夜培養(yǎng)后，挑取數個單菌落，送樣測序，比對測序結果，選取含有正確的重組質粒的菌株擴大培養(yǎng)，進行中提取無內毒素質粒。

1.2.3 質粒轉染及細胞培養(yǎng)：用含10%胎牛血清及青霉素（100 U/mL）和鏈霉素（100 U/mL）的IMDM 培養(yǎng)基，將HCT116細胞置于37 ℃、5%CO2孵箱進行培養(yǎng)，待細胞狀態(tài)良好時將細胞接種于6孔板，約2.5×105/孔，設置Cas9-vector組和Cas9-SAMHD1組，各3個復孔。將9 μg Cas9-vector質粒和9 μg Cas9-SAMHD1重組質粒分別加入2個1.5 mL EP管，分別加入20 μL轉染試劑Tubofect transfection和900 μL無血清培養(yǎng)基，混勻后分別取300 μL混合物，加入6孔板細胞中進行培養(yǎng)。轉染48 h后，用嘌呤霉素1.5 μg/mL篩選，3 d后將篩選的混合細胞的1/2凍存，剩下的細胞繼續(xù)培養(yǎng)，待狀態(tài)良好，進行梯度稀釋后接種于96孔板中，培養(yǎng)10 d后挑選單克隆細胞繼續(xù)擴大培養(yǎng)。

1.2.4 TA克隆測序：取培養(yǎng)10 d后96孔板中的單克隆細胞置于48孔板、24孔板、6孔板，最后鋪于10 cm培養(yǎng)皿中，取1/4提取基因組，然后進行PCR，采用TA克隆試劑盒對PCR引物進行TA克隆后送測序。

1.2.5 蛋白質印跡法檢測SAMHD1蛋白水平：將選定的單克隆細胞擴大培養(yǎng)后，使用細胞裂解液（1%NP40）裂解細胞，提取蛋白并定量。利用SDSPAGE凝膠電泳分離蛋白后，采用恒壓80 V電壓轉膜120 min，用5%牛血清白蛋白封閉液室溫封閉1 h，加入一抗4 ℃過夜，次日TBST緩沖液洗膜3次，每次5 min，加入二抗室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗膜3次，每次15 min，采用ECL化學發(fā)光檢測試劑盒檢測蛋白水平。

1.2.6 檢測DNA損傷指標γH2AX并采用CCK-8法和光學顯微鏡檢測細胞增殖：分別將單克隆細胞傳代至2個10 cm細胞培養(yǎng)皿，分別給予PBS（對照組）和0.5 mmol/L阿霉素（DNA損傷組），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，進行蛋白質印跡實驗，檢測DNA損傷指標γH2AX。以2.5×103/孔的密度將細胞接種至96孔板，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱過夜，待完全貼壁后，根據實驗目的進行分組（Cas9-vector組和Cas9-SAMHD1組），每組3個復孔，培養(yǎng)24、48、72 h后，加入CCK-8試劑（5.0 g/L）10 μL/孔，置入細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育1 h，酶標儀檢測450 nm處各組吸光度，并比較各時間點細胞數量。將Cas9-vector組和Cas9-SAMHD1組的3個復孔450 nm處的吸光度值取平均值，用來表示細胞增殖能力的變化。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)打靶成功構建靶向敲除SAMHD1的CRISPR/Cas9載體體系

利用 BbsⅠ酶對pYSY-CMV-Cas9-EF1α-Puromycin進行線性化處理后，進行瓊脂糖凝膠電泳，見圖1A。將合成的sgRNA-SAMHD1引物配制成100 mmol/L的保存濃度，經過退火后，進行瓊脂糖凝膠電泳，見圖1B。待成功后，連接到已線性化的pYSY-CMV-Cas9-EF1α-Puromycin，并測序。測序結果表明，重組質粒構建成功，見圖1C。

圖1 利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)打靶構建基因敲除質粒圖Fig.1 Images of gene knockout plasmids by CRISPR/Cas9 system targeting technology

2.2 利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功構建敲除SAMHD1基因的HCT116細胞株

通過蛋白質印跡法檢測敲除SAMHD1基因后Cas9-SAMHD1組和Cas9-vector組中HCT116細胞的SAMHD1蛋白表達水平，見圖2。結果證明，敲除SAMHD1基因后Cas9-SAMHD1組SAMHD1蛋白表達水平在72×103位置條帶亮度明顯較低，SAMHD1蛋白的相對表達量為0.026±0.003；而Cas9-vector組SAMHD1蛋白的相對表達量為0.064±0.006，表明靶向敲除SAMHD1基因的HCT116 Cas9-SAMHD1細胞株構建成功。

2.3 驗證敲除SAMHD1基因的穩(wěn)定HCT116細胞DNA損傷修復能力較對照組細胞增強

圖2 Western blotting檢測HCT116細胞中SAMHD1蛋白的表達Fig.2 Western blotting results of SAMHD1 protein expression in HCT116 cells

通過蛋白質印跡法檢測Cas9-SAMHD1組和Cas9-vector組DNA損傷指標γH2AX的表達水平，見圖3。結果顯示，Cas9-SAMHD1組的γH2AX表達水平在15×103位置條帶亮度明顯較低，未給予阿霉素時和給予阿霉素4 h后γH2AX蛋白的相對表達量分別為0.140±0.013和0.201±0.007；而Cas9-vector組未給予阿霉素時和給予阿霉素4 h后γH2AX蛋白的相對表達量分別為0.119±0.006和0.465±0.016。結果表明，Cas9-SAMHD1組細胞抵抗DNA損傷的能力增強。

2.4 敲除SAMHD1基因后HCT116細胞的增殖能力較對照組顯著增強

圖3 Western blotting檢測HCT116細胞中γH2AX蛋白表達Fig.3 Western blotting results of γH2AX protein expression in HCT116 cells

記錄4個時間點（0、24、48、72 h）的細胞數量，放大倍數為10倍，見圖4。光鏡結果顯示，Cas9-SAMHD1組細胞增殖能力較Cas9-vector組增強。計算細胞存活率，細胞存活率（%）=Cas9-SAMHD1組存活細胞數量/ Cas9-vector組存活細胞數量×100。Cas9-SAMHD1組與Cas9-vector組相比，細胞存活率的差異有統(tǒng)計學意義（均P＜ 0.01），見圖5。CCK-8結果顯示，Cas9-SAMHD1組細胞增殖能力較Cas9-vector組明顯增強。

圖4 HCT116細胞數量的變化 ×10Fig.4 Changes of HCT116 cells number ×10

3 討論

本研究利用CRISPR/Cas9技術成功構建靶向敲除SAMHD1基因的HCT116細胞株，并證實該細胞株的增殖能力和抵抗DNA損傷的能力均較對照組顯著增強。

從2012年起，CRISPR/Cas9系統(tǒng)被發(fā)展成為基因編輯工具，并被廣泛用于多項科研和醫(yī)療領域。通過CRISPR/Cas9基因編輯技術可實現單個基因、位點的特異性突變，從而使特定基因完全喪失生物學功能［8-9］。通過利用sgRNA和Cas9蛋白，CRISPR/Cas9系統(tǒng)便可實現對目標DNA的識別和精確編輯。在很多方面該技術要明顯優(yōu)于其他基因編輯技術，尤其體現在其易于操作、效率高、周期短、工作量小、成本低等方面，并且可以在不同的位點同時引入多個突變，這是其他基因編輯技術不易做到的［10-11］。

圖5 HCT116細胞存活率的比較Fig.5 Comparison of survival rate of HCT116 cells

近年來，研究［12-15］證實SAMHD1是一種高效的dNTP水解酶，通過調控脫氧核糖核苷三磷酸的含量來維持基因組的穩(wěn)定，并且可能通過降低細胞內的dNTP水平來抑制細胞增殖。研究［16］發(fā)現，SAMHD1在肺癌細胞中過表達后，可抑制核苷酸的形成和肺癌細胞的擴散，這提示SAMHD1可能與腫瘤細胞的增殖有關。與此同時，KODIGEPALLI等［17］發(fā)現，外源性SAMHD1表達通過促進細胞凋亡，在一定程度上抑制了皮膚T細胞淋巴瘤細胞的生長和增殖。這提示SAMHD1在腫瘤細胞生長中可能起抑制作用。本研究通過CRISPR/Cas9基因敲除技術成功敲除結腸癌細胞中SAMHD1，發(fā)現敲除SAMHD1后，結腸癌細胞的增殖活力顯著增強，并且能夠抵抗DNA損傷。

綜上所述，SAMHD1基因參與調控腫瘤細胞增殖和DNA損傷修復反應。本研究結果有助于進一步了解SAMHD1在HCT116細胞以及其他腫瘤細胞中的生物學功能及分子機制。