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    轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5、GATA4在先天性心臟病產(chǎn)前診斷中的研究

    2020-04-17 14:44:54江敏梁燕華林麗虹
    中國實(shí)用醫(yī)藥 2020年4期
    關(guān)鍵詞:基因突變先天性染色體

    江敏 梁燕華 林麗虹

    【摘要】 目的 研究轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5、GATA4在先天性心臟?。–HD)產(chǎn)前診斷中的臨床價值。方法 50例超聲心動圖確診胎兒為先天性心臟病的孕婦, 抽取孕婦羊水、臍血或引產(chǎn)胎兒臍血, 采用多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(MLPA)檢測, 分析其染色體核型、 MLPA檢測結(jié)果。結(jié)果 50例先天性心臟病胎兒中6例染色體核型分析異常, 其中3例為21-三體綜合征, 2例為18-部分三體綜合征, 1例為46, XX,der(6) (q16q22);剩余44例先天性心臟病胎兒染色體核型分析結(jié)果正常。50例先天性心臟病胎兒進(jìn)行Nkx2.5、GATA4基因的突變篩查, 結(jié)果未發(fā)現(xiàn)任何突變。1例先天性心臟病患兒通過染色體微陣列分析(CMA)在染色體8p23.2位置檢出一段約859 kb的拷貝數(shù)變異(CNV), 涉及OMIM基因CSMD1等, 可能為多態(tài)改變。結(jié)論 先天性心臟病胎兒不存在Nkx2.5、GATA4基因異常, 這可能一方面是由于所選樣本量過小, 有待于擴(kuò)大樣本量, 以便進(jìn)行更廣泛的篩查;另一方面也可能因?yàn)槲覈蛧獾娜朔N差異, 因此需進(jìn)一步擴(kuò)大先天性心臟病的樣本數(shù)量進(jìn)行更深入的研究, 以進(jìn)一步揭示先天性心臟病的發(fā)病機(jī)制。

    【關(guān)鍵詞】 先天性心臟病;Nkx2.5;GATA4;產(chǎn)前診斷

    DOI:10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.04.091

    先天性心臟病(congenital heart disease, CHD)近十年是我國出生缺陷的首位, 發(fā)病率在活產(chǎn)嬰兒占8‰~12‰。我國每年大約10萬~20萬先天性心臟病新生兒出生, 廣東省每年新增先天性心臟病新生兒至少7000例, 是我國城市0~5歲嬰幼兒死亡的首要原因[1-3]。其遺傳學(xué)病因有染色體病、單基因病、多基因病、線粒體病等。先天性心臟病的發(fā)病率占新生兒的0.4%~5.0%, 病因迄今仍不清楚。但研究認(rèn)為, 先天性心臟病是由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用導(dǎo)致心臟血管發(fā)育異常所引起的, 遺傳度為55%~65%, 并證實(shí)多種轉(zhuǎn)錄因子與心臟發(fā)育緊密相關(guān), 包括GATA4、Nkx2.5、TBX5、AP2b等[4, 5]。本研究從分子水平觀察了先天性心臟病患者的Nkx2.5、GATA4基因突變情況, 初步探討兩種轉(zhuǎn)錄因子與先天性心臟病發(fā)病的關(guān)系, 為先天性心臟病的產(chǎn)前診斷和基因治療提供依據(jù)?,F(xiàn)報告如下。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料 選取2016年1月~2017年12月本院超聲心動圖確診胎兒為先天性心臟病的孕婦50例, 包括心臟擴(kuò)大、室間隔缺損(VSD)、房間隔缺損(ASD)、單心房、法洛四聯(lián)癥(TOF)、心內(nèi)膜墊缺損、右心室雙出口、永存動脈干、大動脈轉(zhuǎn)位、主動脈弓狹窄、肺動脈狹窄、主肺動脈窗等, 經(jīng)過遺傳咨詢自愿行介入性產(chǎn)前診斷。孕婦年齡20~44歲, 平均年齡(26.5±2.8)歲;孕周20+4~33周, 平均孕周(26.5±2.2)周。所有孕婦均簽署產(chǎn)前診斷知情同意書。

    1.2 研究方法

    1.2.1 標(biāo)本提取 經(jīng)知情同意抽取孕婦的羊水或臍帶血。妊娠18~24周孕婦:B超引導(dǎo)下經(jīng)腹壁行羊膜穿刺抽取18~22 ml羊水, 使用2個無菌刻度離心管分裝, 離心后棄上清, 每管留下約2 ml的細(xì)胞懸液, 加入培養(yǎng)基7 ml, 使用2個細(xì)胞培養(yǎng)瓶分別接種, 置恒溫37℃, 5%CO2培養(yǎng)箱中, 培養(yǎng)9~10 d后換液, 細(xì)胞生長情況需要每天觀察, 貼壁細(xì)胞生長旺盛時可作為收獲節(jié)點(diǎn), 出現(xiàn)較多透明圓形細(xì)胞時為明顯標(biāo)志, 常規(guī)制片、G顯帶。妊娠25~37周孕婦:B超引導(dǎo)下經(jīng)腹壁行臍血細(xì)胞穿刺術(shù), 循常規(guī)操作染色體制片, 在1640培養(yǎng)基中注入1 ml肝素鈉抗凝的血標(biāo)本以行淋巴細(xì)胞培養(yǎng), 大約60~75 h后即可收獲, 取常規(guī)G顯帶(400條帶)制成所需染色體片。每例計數(shù)35個以上核型, 并對5~7個核型進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)異常者可增加至17個核型分析。

    1.2.2 DNA提取方法 ①羊水DNA提?。喝? ml羊水, 3000 r/min離心10 min, 棄上清, 用1 ml生理鹽水漂洗2次, 12000 r/min離心5 min, 棄上清。根據(jù)基因組DNA提取試劑盒說明書抽提羊水基因組DNA, 并計算DNA的濃度。②臍帶血DNA提?。喝√耗殠а?~2 ml(EDTA抗凝), 全基因組DNA可采用酚-氯仿法提取, DNA在260 nm和280 nm處的吸光值需用分光光度計法測定并提取, 從而得出濃度及純度值, 并用TE溶液稀釋終濃度至50 ng/?l。

    1.2.3 MLPA檢測方法 采用荷蘭MRC-Holland公司生產(chǎn)的P311試劑盒, 包含了檢測GATA4所有7個外顯子及GATA4基因上下游序列、Nkx2.5基因所有2個外顯子的探針。按MLPA試劑盒所提供的操作流程進(jìn)行探針的雜交和擴(kuò)增。檢測擴(kuò)增產(chǎn)物需在ABI3500遺傳分析儀(Applied Biosystems)上進(jìn)行, 并通過Genemapper3.7獲取結(jié)果, 最后通過Coffalyser v9.4(MRC-Holland)進(jìn)行分析得出基因相對拷貝數(shù)比值。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 所得結(jié)果通過GenemarkerV 1.80 軟件進(jìn)行定量分析, 將獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物峰的峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化, 并得到反映樣本DNA片段擴(kuò)增數(shù)目變化的比值, 以便于分析DNA片段變化的情況。

    2 結(jié)果

    2.1 染色體核型結(jié)果 50例先天性心臟病胎兒中6例染色體核型分析異常, 其中3例為21-三體綜合征, 2例為18-部分三體綜合征, 1例為46, XX, der(6) (q16q22);剩余44例先天性心臟病胎兒染色體核型分析結(jié)果正常。

    2.2 MLPA結(jié)果 50例先天性心臟病胎兒進(jìn)行Nkx2.5、GATA4基因的突變篩查, 結(jié)果未發(fā)現(xiàn)任何突變。1例先天性心臟病患兒通過染色體微陣列分析(chromosome microarray analysis, CMA)在染色體8p23.2位置檢出一段約859 kb的拷貝數(shù)變異, 涉及OMIM基因CSMD1等, 可能為多態(tài)改變。

    3 討論

    先天性心臟病簡稱先心病, 是胎兒期心血管發(fā)育異常引起的血管畸形, 也是最為常見的血管畸形之一, 其發(fā)病率占出生活產(chǎn)嬰兒的比例很高, 是新生兒致死致殘的一個主要原因。先天性心臟病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜, 臨床表現(xiàn)明顯不同, 可能與遺傳、宮內(nèi)感染、大劑量放射性物質(zhì)接觸和藥物等因素有關(guān)[6]。一些患兒癥狀明顯, 一般在 0~15 歲的幼兒期即可發(fā)現(xiàn);一些患兒可能無明顯癥狀, 直至出現(xiàn)癥狀時才發(fā)現(xiàn)其患有先天性心臟病。根據(jù)先天性心臟病的嚴(yán)重程度, 外科修補(bǔ)或內(nèi)科封堵手術(shù)都能有效的控制先天性心臟病。由于遺傳基因突變導(dǎo)致的先天性心臟病, 即使做了心臟修補(bǔ)手術(shù)也可能出現(xiàn)一些其他的并發(fā)癥, 如心律失常、心內(nèi)膜炎和心力衰竭, 因此還需要注意觀察, 有可能還需要額外的外科手術(shù)。值得一提的是, 先天性心臟病中的心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)異常是可以伴隨患者終生的十分危險的致死病因, 且癥狀會隨著年齡增加而呈現(xiàn)逐漸加重的趨勢。因此, 對先天性心臟病患者進(jìn)行遺傳基因檢測, 找出致病基因, 對患者術(shù)后的生活質(zhì)量和生存率都至關(guān)重要。近期心臟發(fā)育中的一些轉(zhuǎn)錄調(diào)控回路的研究也發(fā)現(xiàn)心臟轉(zhuǎn)錄因子在先天性心臟病發(fā)生發(fā)展中也起著重要作用, 如轉(zhuǎn)錄因子 Nkx2.5、GATA4 和 TBX5 在心臟的早期發(fā)育中就都起著重要作用[7, 8]。因此, 本文旨在討論心臟轉(zhuǎn)錄因子 Nkx2.5和GATA4在早期產(chǎn)前診斷中對心臟產(chǎn)生的重要作用及其突變導(dǎo)致的先天性心臟病表型, 并討論其導(dǎo)致先天性心臟病的可能機(jī)制。

    人類在胚胎期的心血管系統(tǒng)是在第3周開始發(fā)育的, 直到第8周結(jié)束。心臟發(fā)育起始于前面?zhèn)劝逯信邔觾?nèi)心臟祖細(xì)胞的分化。心臟的胚胎發(fā)育可分為分段發(fā)育、融合連接、扭曲旋轉(zhuǎn)和順序分隔4步。人類胚胎發(fā)育到第16~17天, 血管母細(xì)胞增殖形成鼓勵的內(nèi)皮細(xì)胞團(tuán);到第18~19天, 生心板形成;胚胎發(fā)育到第23天, 單個心管形成, 開始低效率的收縮;第26天, 單個心房心臟形成;第29天, 開始發(fā)育成兩個心房;第30天血液循環(huán)系統(tǒng)開始運(yùn)行, 第49天心臟四個腔室基本形成, 但要到出生才會發(fā)育為成熟的心臟。其中主要的發(fā)育包括心管的形成、心臟的扭轉(zhuǎn)、心臟的環(huán)化、房室分隔、傳導(dǎo)系統(tǒng)和血管的發(fā)育以及流出通道的形成。

    研究表明[9], Nkx2.5是心臟前體細(xì)胞分化的最早期標(biāo)志之一, 參與心臟前體細(xì)胞分化、房室分隔、房室流出道的形成和傳導(dǎo)系統(tǒng)的成熟;在發(fā)育成熟的心臟中, Nkx2.5表達(dá)局限在房室肌細(xì)胞中, 但對成熟心臟發(fā)揮正常功能卻不可缺少。人類Nkx2.5基因定位于染色體5q34上, 有2個外顯子, 編碼324個氨基酸, 在進(jìn)化上高度保守。其突變與多種先天性心臟病的形成有關(guān), 如房間隔缺損、室間隔缺損、法洛四聯(lián)癥和伴有傳導(dǎo)系統(tǒng)病變的三尖瓣下移畸形。有研究表明[10], 幾乎所有類型的先天性心臟病都存在Nkx2.5基因的突變, 國外已經(jīng)發(fā)現(xiàn)41種突變報道, 其中33種單核苷酸置換, 6種核苷酸缺失, 2種核苷酸插入。McElhinney等[11] 報道NK2.5基因外顯子1的突變存在于各種先天性心臟病中, 但國內(nèi)卻少有發(fā)現(xiàn)報道。2005年, 石琳等[12]對包括室間隔缺損、法樂四聯(lián)癥、房間隔缺損、完全性肺靜脈畸形引流、完全性大動脈轉(zhuǎn)位在內(nèi)的110例中國先天性心臟病患兒及110例正常對照者的NK2.5基因外顯子1及其側(cè)翼進(jìn)行突變檢測, 結(jié)果任何突變位點(diǎn)都未被發(fā)現(xiàn), 但是發(fā)現(xiàn)了1個新的SNP位點(diǎn)63A>G(rs2277923)。對其基因型和等位基因頻率變化的分析發(fā)現(xiàn), 對照組和病例組都顯示G基因型高于基因庫中所標(biāo)示的基因型A, 對照組中G基因型達(dá)到了62%, 而病例組中的室間隔缺損和法樂四聯(lián)癥組中G基因型則均達(dá)到了87%, 該SNP在兩組病例與對照組之間明顯存在著顯著的相關(guān)性。韓增強(qiáng)等[13]對81例單純性先天性心臟病患者的研究發(fā)現(xiàn), Nkx2.5基因突變與我國單純性先天性心臟病之間無明顯相關(guān)。國內(nèi)簡永遠(yuǎn)等[14]對30名廣西壯族ASD患者及30例廣西壯族對照病例進(jìn)行Nkx2.5基因的突變篩查中, 結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)任何突變。關(guān)于散發(fā)先天性心臟病人群的突變研究, 張為民等[15]篩查了120例維吾爾族ASD患者, 也并未檢測出任何Nkx2.5基因突變。

    GATA4基因定位于8p23.1-p22, 是心臟發(fā)生調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中重要的蛋白, 是在心臟早期發(fā)育中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子之一, 并且相互作用于其他轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子, 是心臟細(xì)胞胚胎發(fā)育過程中的早期標(biāo)志, 并調(diào)控心肌細(xì)胞的分化增生及心臟的形態(tài)發(fā)生過程[16-18]。首先在心前期中胚層表達(dá), 隨后在心內(nèi)膜與心肌中表達(dá), 并參與調(diào)節(jié)表達(dá)心臟結(jié)構(gòu)基因, 主要包括心臟肌球蛋A重鏈-α(α-Myhc)、心肌鈣蛋白C、心房利鈉肽因子(ANF)等, 也通過其鋅指結(jié)構(gòu)與其他心臟特異性的轉(zhuǎn)錄因子(如Nkx2.5、TBX5等)相互作用共同發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[19-21]。該基因單個或多個突變及異常表達(dá)均會導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)畸形, 如室間隔缺損、房間隔缺損、房室間隔缺損、心內(nèi)膜墊缺失、右心室雙流出道、左心發(fā)育不全綜合征、肺動脈縮窄、動脈導(dǎo)管未閉等。自2003年Garg等首次證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子GATA4突變是導(dǎo)致人類先天性心臟病的致病原因之一。隨后有多個研究報道GATA4突變與人類先天性心臟病相關(guān)[17, 18, 20]。汪希珂等[16]對198例先天性心臟病患者研究發(fā)現(xiàn)2例GATA4位點(diǎn)雜合突變。

    本研究未發(fā)現(xiàn)先天性心臟病胎兒存在Nkx2.5、GATA4基因異常, 這可能一方面是由于所選樣本量過小, 因此有待于擴(kuò)大樣本量, 以便進(jìn)行更廣泛的篩查;另一方面也可能因?yàn)槲覈蛧獾娜朔N差異。同種疾病可能有不同類型的基因突變, 即由遺傳的異質(zhì)性決定, 可能Nkx2.5、GATA4基因并非是我國先天性心臟病的主效基因。同時進(jìn)一步提示先天性心臟病有著復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制, 并提示可能的多基因相互作用、可能的環(huán)境一遺傳因素的相互作用, 需進(jìn)一步擴(kuò)大先天性心臟病的樣本數(shù)量進(jìn)行更深入的研究, 以進(jìn)一步揭示先天性心臟病的發(fā)病機(jī)制。

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    [收稿日期:2019-12-10]

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