地黃飲子對(duì)D-半乳糖衰老模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及衰老相關(guān)蛋白P16、P21的影響

蔡智剛　唐新征

【摘要】 目的 通過(guò)探討地黃飲子對(duì)衰老大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及衰老相關(guān)蛋白P16、P21的影響， 研究地黃飲子對(duì)于延緩衰老的作用。方法 50只SD大鼠， 隨機(jī)分為正常組、衰老組、地黃飲子組、六味地黃丸組、維生素E組， 每組10只。除正常組外， 每組頸背部皮下注射D-半乳糖380 mg/kg， 連續(xù)3個(gè)月。同時(shí)地黃飲子組、六味地黃丸組、維生素E組分別給予地黃飲子、六味地黃丸、維生素E灌胃。用Morris水迷宮檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力， 用Western blot檢測(cè)大鼠海馬中P16、P21蛋白的表達(dá)。比較五組大鼠到達(dá)平臺(tái)時(shí)間、經(jīng)過(guò)平臺(tái)次數(shù);海馬中P16、P21蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 衰老組大鼠經(jīng)過(guò)平臺(tái)次數(shù)為（2.21±1.56）次低于正常組的（6.43±1.21）次， 到達(dá)平臺(tái)時(shí)間為（75.33±4.22）s長(zhǎng)于對(duì)照組的（36.68±4.10）s， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。地黃飲子組大鼠到達(dá)平臺(tái)時(shí)間（45.92±3.84）s短于衰老組的（75.33±4.22）s、維生素E組的（58.23±3.69）s， 經(jīng)過(guò)平臺(tái)次數(shù)（6.82±1.22）次高于衰老組的（2.21±1.56）次、維生素E組的（5.09±1.61）次， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。地黃飲子組大鼠到達(dá)平臺(tái)時(shí)間、經(jīng)過(guò)平臺(tái)次數(shù)與六味地黃丸組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。衰老組大鼠海馬中P16、P21蛋白表達(dá)水平分別為（0.44±0.01）、（0.49±0.02）ng/ml高于正常組的（0.32±0.01）、（0.25±0.02）ng/ml， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。地黃飲子組大鼠海馬中P16、P21蛋白表達(dá)水平低于衰老組、六味地黃丸組、維生素E組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 地黃飲子方能夠提高衰老大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力， 通過(guò)降低大鼠體內(nèi)P16、P21的含量從而達(dá)到延緩衰老的目的。

【關(guān)鍵詞】 地黃飲子;衰老;P16;P21

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.04.090

中國(guó)正快速步入老齡化社會(huì)， 衰老和死亡是任何物種的個(gè)體都難以避免的最終結(jié)局， 但至今對(duì)衰老發(fā)生機(jī)制的理解還相當(dāng)有限。鑒于其重要性， 衰老一直是生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。如何發(fā)揮中醫(yī)中藥的優(yōu)勢(shì)， 采用中西醫(yī)結(jié)合的方法， 優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)， 最大程度的提高老年人的生活質(zhì)量， 延緩老年人臟器的衰老， 防治重大老年性疾病， 成為亟待解決的重大問(wèn)題。本研究通過(guò)觀察地黃飲子對(duì)實(shí)驗(yàn)室衰老后SD大鼠日常生活能力及衰老蛋白P16、P21的表達(dá)高低， 探討以地黃飲子為代表的補(bǔ)腎法對(duì)延緩衰老的意義。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 50只8周齡SD雄性大鼠， 體重（225±12）g，?廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院提供合格實(shí)驗(yàn)動(dòng)物， 動(dòng)物許可證：SYYK（粵）2018-0012。飼養(yǎng)環(huán)境溫度約22℃， 濕度55%～65%， 飲用水為純凈水。處置動(dòng)物嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)[1]。將50只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、衰老組、地黃飲子組、六味地黃丸組、維生素E組， 每組10只。

1. 2 藥物 地黃飲子藥物組成：均為道地藥材， 其中菟絲子15 g、山萸肉20 g、牛膝10 g、鹿角膠15 g、龜板膠10 g、熟地黃30 g、淮山15 g、枸杞15 g（由廣州中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院煎制）。其中除龜板膠、鹿角膠烊化外， 將其他所有藥物混合煎煮， 待藥物有效成分析出外， 濃縮， 置于冰箱保存。

1. 3 實(shí)驗(yàn)試劑及主要儀器

1. 3. 1 主要試劑 Western blot主要試劑：來(lái)自Santa公司的P21多克隆抗體、P16單克隆抗體;來(lái)自Amresco公司的D-半乳糖、其他原料均來(lái)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室已有原料。

1. 3. 2 主要儀器 水平搖床、凝膠電泳儀、核酸蛋白測(cè)定儀、大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)裝置等設(shè)備。

1. 4 方法

1. 4. 1 模型的制備 制備衰老大鼠動(dòng)物模型參照相關(guān)文獻(xiàn)[2， 3]：除正常組外， 每組頸背部皮下注射D-半乳糖380 mg/kg，?連續(xù)3個(gè)月。同時(shí)地黃飲子組、六味地黃丸組、維生素E組分別給予地黃飲子、六味地黃丸、維生素E灌胃。喂養(yǎng)到期后將大鼠處死， 分離海馬， 放組織液中保存。

1. 4. 2 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力檢測(cè) 測(cè)試方法水迷宮水池的設(shè)置、定位航行實(shí)驗(yàn)參照有關(guān)文獻(xiàn)[5]。

1. 4. 3 P16、P21蛋白檢測(cè) 采用Western blot免疫印跡法檢測(cè)P16、P21蛋白， 參照自身實(shí)驗(yàn)室Western blot步驟及查閱相關(guān)文獻(xiàn)[6]。

1. 5 觀察指標(biāo) 比較五組大鼠到達(dá)平臺(tái)時(shí)間、經(jīng)過(guò)平臺(tái)次數(shù);海馬中P16、P21蛋白表達(dá)水平。

1. 6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)大鼠的非正常死亡例數(shù)：正常組0例， 衰老組1例， 地黃飲子組1例， 六味地黃丸組2例， 維生素E組0例。

2. 1 五組大鼠到達(dá)平臺(tái)時(shí)間、經(jīng)過(guò)平臺(tái)次數(shù)比較 衰老組大鼠經(jīng)過(guò)平臺(tái)次數(shù)低于A組正常組， 到達(dá)平臺(tái)時(shí)間長(zhǎng)于對(duì)照組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。地黃飲子組大鼠到達(dá)平臺(tái)時(shí)間短于衰老組、維生素E組， 經(jīng)過(guò)平臺(tái)次數(shù)高于衰老組、維生素E組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。地黃飲子組大鼠到達(dá)平臺(tái)時(shí)間、經(jīng)過(guò)平臺(tái)次數(shù)與六味地黃丸組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

2. 2 五組大鼠海馬中P16、P21蛋白表達(dá)水平比較 衰老組大鼠海馬中P16、P21蛋白表達(dá)水平高于正常組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。地黃飲子組大鼠海馬中P16、P21蛋白表達(dá)水平低于衰老組、六味地黃丸組、維生素E組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2， 圖1， 圖2。

3 討論

衰老是人類正常生命活動(dòng)的自然規(guī)律， 人類的機(jī)體在生長(zhǎng)發(fā)育完成之后， 便逐漸進(jìn)入衰老的過(guò)程。探討衰老的概念、原因和衰老時(shí)的生理、病理改變， 以至防止衰老的措施， 是十分重要的。

衰老可分為兩類， 即生理性衰老及病理性衰老。生理性衰老系指隨年齡的增長(zhǎng)到成熟期以后所出現(xiàn)的生理性退化， 也就是人體在體質(zhì)方面的年齡變化， 這是一切生物的普遍規(guī)律。病理性衰老即由于內(nèi)在的或外在的原因使人體發(fā)生病理性變化， 使衰老現(xiàn)象提前發(fā)生， 這種衰老又稱為早衰。

腎為先天之本， 人的生長(zhǎng)發(fā)育衰老與腎臟的關(guān)系極為密切?！端貑?wèn)·上古天真論》中“女子七七”、“丈夫八八”的一段論述， 即是以腎氣的自然盛衰規(guī)律， 來(lái)說(shuō)明人體生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老的過(guò)程與先天稟賦的關(guān)系， 從而提示衰老的關(guān)鍵在于腎氣的盛衰。腎屬水， 主藏精， 為元?dú)庵荆?一身陰陽(yáng)生化之根。腎的盛衰影響著元?dú)獾氖⑺ズ蜕δ艿膹?qiáng)弱， 腎虛則元?dú)馑ィ?元?dú)馑t生化功能弱， 人的衰老就會(huì)加速到來(lái)。

人的生命活動(dòng)， 靠臟腑氣血充盛、功能協(xié)調(diào)來(lái)維持。腎為先天之本， 對(duì)人的生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老起著決定性的作用。腎氣虛損， 五臟六腑功能減退， 則出現(xiàn)一系列衰老征象， 這是人類變老的重要原因。腎氣充盛即能抗病又能抗衰老延年益壽。中醫(yī)學(xué)在抗衰老理論上， 補(bǔ)腎法延緩衰老具有重要的臨床意義。本研究中地黃飲子方用熟地黃、山茱萸滋補(bǔ)腎陰， 肉蓯蓉、巴戟天溫壯腎陽(yáng)， 四味共為君藥。配伍附子、肉桂之辛熱， 以助溫養(yǎng)下元， 攝納浮陽(yáng)， 引火歸原;石斛、麥冬、五味子滋養(yǎng)肺腎， 金水相生， 壯水以濟(jì)火， 均為臣藥。石菖蒲與遠(yuǎn)志、茯苓合用， 是開(kāi)竅化痰， 交通心腎的常用組合， 是為佐藥。姜、棗和中調(diào)藥， 功兼佐使。

細(xì)胞的衰老是機(jī)體衰老最重要的因素之一， 對(duì)于衰老機(jī)制的研究也在不斷深化 [9-11]。本研究觀察補(bǔ)腎生髓方劑地黃飲子對(duì)衰老大鼠的干預(yù)， 結(jié)果顯示：衰老組大鼠經(jīng)過(guò)平臺(tái)次數(shù)低于A組正常組， 到達(dá)平臺(tái)時(shí)間長(zhǎng)于對(duì)照組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）， 提示制造衰老模型后明顯降低了大鼠的日常生活能力。地黃飲子組大鼠到達(dá)平臺(tái)時(shí)間短于衰老組、維生素E組， 經(jīng)過(guò)平臺(tái)次數(shù)高于衰老組、維生素E組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。地黃飲子組大鼠到達(dá)平臺(tái)時(shí)間、經(jīng)過(guò)平臺(tái)次數(shù)與六味地黃丸組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），?提示地黃飲子一方面能提高大鼠經(jīng)過(guò)平臺(tái)的次數(shù)， 同時(shí)到達(dá)平臺(tái)的潛伏期也明顯縮短， 說(shuō)明地黃飲子能提高大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力。衰老組大鼠海馬中P16、P21蛋白表達(dá)水平高于正常組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）， 說(shuō)明衰老大鼠中P16、P21蛋白表達(dá)增高。地黃飲子組大鼠海馬中P16、P21蛋白表達(dá)水平低于衰老組、六味地黃丸組、維生素E組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。得出補(bǔ)腎生髓中藥可以明顯延緩機(jī)體衰老， 補(bǔ)腎生髓法能夠提高大鼠學(xué)習(xí)記憶能力， 并能夠明顯下調(diào)P16、P21的表達(dá)水平來(lái)達(dá)到延緩衰老的目的。證明 “腎主骨生髓” 中醫(yī)理論在延緩衰老機(jī)制中的正確性和可操作性。

綜上所述， 遵循“腎-精-髓-腦”理論， 采用補(bǔ)腎生髓中藥地黃飲子對(duì)延緩機(jī)體衰老是有希望的， 在中醫(yī)理論指導(dǎo)下的實(shí)驗(yàn)研究， 不僅為延緩衰老提供了研究的新思路和新方案， 而且有利于醫(yī)學(xué)的進(jìn)步和發(fā)展， 開(kāi)拓新的治療方法。

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[收稿日期：2019-05-20]