• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    蟬花真菌液體發(fā)酵及活性成分測(cè)定

    2020-04-17 09:53:15黃小忠謝春芹張雪松凡軍民許俊齊陳松玲
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020年2期
    關(guān)鍵詞:活性成分測(cè)定

    黃小忠 謝春芹 張雪松 凡軍民 許俊齊 陳松玲

    摘要:利用蟬擬青霉(Paecilomyces cicadae)菌株進(jìn)行液體發(fā)酵,并進(jìn)行單因素和正交試驗(yàn),以實(shí)現(xiàn)蟬花真菌液態(tài)發(fā)酵條件包括pH值、溫度、搖床轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)基裝液量的優(yōu)化。結(jié)果表明,蟬花液體發(fā)酵的最優(yōu)條件為pH值7.4、搖床轉(zhuǎn)速 150 r/min、溫度28 ℃、裝液量40%;在此條件下,測(cè)得的真菌多糖含量為107.45 mg/g,蟲草酸含量為95.82 mg/g,真菌多糖、蟲草酸含量皆高于天然蟬花。

    關(guān)鍵詞:蟬花;液體發(fā)酵;活性成分;測(cè)定

    中圖分類號(hào): S567.3+50.1;S188+.4

    文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

    文章編號(hào):1002-1302(2020)02-0197-04

    收稿日期:2018-10-29

    作者簡(jiǎn)介:黃小忠(1981—),男,江蘇海安人,碩士,講師,主要從事發(fā)酵工程研究。E-mail:huangxiaozhong@jsafc.edu.cn。

    通信作者:謝春芹,副教授,主要從事食藥用菌研究。E-mail:xiechunqin@jsafc.edu.cn。

    蟬花(Cordyceps cicadae),別稱大蟲草,屬蟲生真菌,與冬蟲夏草有非常接近的親緣關(guān)系,屬麥角菌科(Clavicipttaceus)蟲草屬(Cordyceps),在我國(guó),蟬花主要分布在四川省、江蘇省、浙江省、福建省等地[1]。

    國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究成果表明,蟬花具有多種保健作用,包括提高人體自身免疫力、抗疲勞、養(yǎng)腎、養(yǎng)肝、改善睡眠、抗腫瘤、抗輻射和明目等,是一味具有神奇效果的古老中草藥[2]。李時(shí)珍在《本草綱目》中記載的藥效為:“蟬花可治療驚癇,夜啼心悸,功同蟬蛻”。蟬花的天然成分與冬蟲夏草類似,具有相同的藥用價(jià)值,且尚未檢測(cè)出有毒重金屬如碘、汞、鉛等,在安全性方面蟬花顯然優(yōu)于冬蟲夏草,同時(shí)蟬花的價(jià)格相對(duì)于冬蟲夏草而言較低,因此蟬花常作為冬蟲夏草的替代品。

    蟬花對(duì)生長(zhǎng)條件要求比較嚴(yán)格,需要特定的生態(tài)環(huán)境和寄主昆蟲(金蟬)[3],這是蟬花資源稀少的主要原因。近幾年隨著生態(tài)環(huán)境的破壞,蟬花的生長(zhǎng)區(qū)域大范圍縮小;同時(shí)人們開始認(rèn)識(shí)到蟬花的價(jià)值,使蟬花遭到了瘋狂的采摘,導(dǎo)致蟬花資源迅速減少。本試驗(yàn)的目的是利用蟬擬青霉(Paecilomyces cicadae),在經(jīng)優(yōu)化的液態(tài)培養(yǎng)條件下生產(chǎn)蟬花菌絲體,并對(duì)菌絲體的生物活性物質(zhì)進(jìn)行提取及測(cè)定分析,以期通過(guò)菌絲體發(fā)酵來(lái)獲得天然蟬花含有的藥用活性物質(zhì),為規(guī)?;a(chǎn)提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 蟬花菌種來(lái)源

    蟬花(Cordyceps cicadae)菌株來(lái)自江蘇省食用菌研究所。

    1.2 試劑與儀器

    1.2.1 試劑 甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品、乙酸銨、冰醋酸、乙酰丙酮、高碘酸鈉、L-鼠李糖、葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、酵母膏、瓊脂、孟加拉紅染色劑、氯霉素、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、高碘酸鉀、苯酚、濃硫酸、無(wú)水乙醇。

    1.2.2 儀器 水浴恒溫振蕩器;電子天平;立式壓力蒸汽滅菌器;數(shù)顯恒溫水浴鍋;可見(jiàn)分光光度計(jì);冷凍真空干燥機(jī)。

    1.3 培養(yǎng)基

    1.3.1 菌種保藏培養(yǎng)基 PDA斜面試管培養(yǎng)基:馬鈴薯 200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g,加水至1 L,pH值自然,在121 ℃下滅菌30 min備用。

    1.3.2 種子培養(yǎng)基 土豆200 g、蔗糖50 g、豆粕 5 g、KH2PO4 5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g,加水至1 L,pH值自然,在 121 ℃ 下滅菌30 min備用。

    1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基 蔗糖40 g、蛋白胨15 g、KH2PO4 1.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g,加水至1 L,在121 ℃下滅菌30 min備用。

    1.4 發(fā)酵種子的制備

    1.4.1 菌種活化 將試驗(yàn)分離所得到的在低溫保藏的蟬花菌種通過(guò)無(wú)菌操作接種于PDA平板培養(yǎng)基上,在溫度為 28 ℃ 條件下培養(yǎng)2~3 d進(jìn)行活化,當(dāng)菌絲長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿時(shí),即可使用[4]。

    1.4.2 孢子懸浮液的制備 在無(wú)菌條件下,用接種鉤從培養(yǎng)基上取大小約0.3 cm×0.3 cm的母種塊,接種于盛有100 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中(菌塊稍帶培養(yǎng)基且要薄,以能浮在培養(yǎng)液表面為最佳),在溫度為28 ℃,轉(zhuǎn)速為180 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)72 h[5]。

    1.5 液體發(fā)酵條件的確定

    1.5.1 發(fā)酵溫度的優(yōu)化 取5 mL菌懸液,接入裝液(發(fā)酵培養(yǎng)基)量為40%的250 mL三角瓶中,將恒溫?fù)u床的溫度分別設(shè)為22、25、28、31、34 ℃,搖床轉(zhuǎn)速設(shè)為150 r/min,培養(yǎng)5 d后測(cè)其生物量。

    1.5.2 發(fā)酵pH值的優(yōu)化 取5 mL菌懸液,接入初始pH值分別為6.5、6.8、7.1、7.4,培養(yǎng)基裝液量為40%的250 mL三角瓶中,置于溫度為28 ℃的搖床中以轉(zhuǎn)速為150 r/min的速率進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)5 d后測(cè)其生物量。

    1.5.3 發(fā)酵搖床轉(zhuǎn)速的優(yōu)化 取5 mL菌懸液,接入裝液量為三角瓶中,將搖床的轉(zhuǎn)速分別設(shè)為110、130、150、170、190 r/min,在溫度為28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)5 d后測(cè)其生物量。

    1.5.4 發(fā)酵裝液量的優(yōu)化 在裝液量分別為20%、40%、60%、80%的三角瓶中接入5 mL菌懸液,置于溫度為28 ℃的恒溫?fù)u床中以轉(zhuǎn)速為150 r/min的速度培養(yǎng)5 d后測(cè)其生物量。

    1.5.5 正交試驗(yàn)的確定 選擇溫度、搖床轉(zhuǎn)速、pH值和裝液量為試驗(yàn)因素,進(jìn)行4個(gè)因素3個(gè)水平 L9(34) 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),對(duì)發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行極差和方差分析,探討各種培養(yǎng)條件對(duì)蟬花液態(tài)發(fā)酵所獲得的生物量和蟲草酸含量的影響程度。

    1.6 測(cè)定方法

    1.6.1 生物量測(cè)定方法 采用細(xì)胞干質(zhì)量法[6]測(cè)定蟬在液態(tài)發(fā)酵所獲生物量,具體操作為在發(fā)酵液培養(yǎng)完成后,用100目篩過(guò)濾得到菌絲體和胞外液,用蒸餾水反復(fù)沖洗菌絲體直至所出濾液澄清為止,將所收集的菌絲體置于玻璃紙上,放入烘箱中,在溫度為60 ℃條件下烘干至恒質(zhì)量,稱質(zhì)量得生物量。

    1.6.2 蟲草酸含量測(cè)定 通過(guò)微波提取法[7]提取菌絲體中的蟲草酸。利用高碘酸鈉比色法[8]測(cè)定蟲草酸含量。

    1.6.2.1 微波提取法 取0.05 g干燥液體發(fā)酵菌絲體加入10 mL蒸餾水中在微波爐中通過(guò)中火加熱2 min進(jìn)行微波處理。處理完畢后在3 000 r/min下離心25 min,取上清液加入到50 mL容量瓶中,并用蒸餾水定容。

    1.6.2.2 高碘酸鈉比色法 取50 mg甘露醇加入到50 mL蒸餾水中配置成1 mg/mL甘露醇溶液,分別取1、2、3、4、5 mL甘露醇溶液于100 mL容量瓶中,并用蒸餾水定容,得到10、20、30、40、50 μg/mL樣液,取樣液各1 mL,加1 mL高錳酸鉀溶液(加0.15 mol高錳酸鉀于100 mL 0.12 mol/L鹽酸溶液中混勻)。室溫放置10 min,加入2 mL 0.1% L-鼠李糖溶液除去過(guò)多的高碘酸鹽?;旌虾蠹? mL新配NaSH試劑(150 g乙酸銨,2 mL冰乙酸,2 mL乙酰丙酮,用蒸餾水稀釋至 1 000 mL),53 ℃水浴加熱15 min使其呈色,冷卻,用蒸餾水代替甘露醇標(biāo)準(zhǔn)液。在波長(zhǎng)為412 nm處測(cè)吸光度(D412 nm),將測(cè)得的吸光度通過(guò)回歸方程進(jìn)行計(jì)算,然后通過(guò)下式計(jì)算菌絲體中蟲草酸的含量[8]。

    R=C×V×101 000×m。

    式中:R為菌絲體中蟲草酸含量,mg/g;C為提取液中蟲草酸含量,μg/g;10為試樣浸提后定容體積,mL;V為提取液體積,mL;m為試樣的準(zhǔn)確質(zhì)量,g。

    1.6.3 真菌多糖含量的測(cè)定 將干燥后的菌絲體進(jìn)行前處理。步驟:熱水提取、乙醇沉淀、脫色、去蛋白、低溫干燥。采用硫酸-苯酚法[9]測(cè)定真菌多糖含量。

    1.6.3.1 前處理 取2 g干燥液體發(fā)酵菌絲研磨成粉末,用水提醇法提取,即加10倍量的蒸餾水,100 ℃水浴煎煮 1 h,重復(fù)3次,過(guò)濾提取液,濃縮至1 g ∶1 mL,加3倍量的95%乙醇進(jìn)行沉淀,5 000 r/min 離心5 min,取上清液,繼續(xù)加95%乙醇放置,傾出上清液,沉淀依次用95%乙醇、無(wú)水乙醇洗滌、過(guò)濾,低溫干燥24 h,即得多糖粗品。

    1.6.3.2 硫酸-苯酚法測(cè)定真菌多糖 將提取的多糖樣品置于10 mL容量瓶中,加雙蒸水溶解,并稀釋到刻度線位置,搖勻,備用。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液(100 μg/mL)0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,分別加入到各試管中,用雙蒸水補(bǔ)足至每管2 mL,使各管葡萄糖含量分別為0、10、20、30、40、60、80、100 μg。向各管中分別加入0.05 mL 80%苯酚溶液,再加入5 mL濃硫酸(勿沿管壁加入,以便使樣品與硫酸快速混勻),靜置10 min,30 ℃ 水浴15 min。在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)各管的吸光度,以糖濃度為橫坐標(biāo),各管的吸光度為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線,作回歸方程曲線,通過(guò)以下公式計(jì)算真菌多糖含量。

    R′=C′×V′1 000×ω。

    式中:R′為菌絲體中真菌多糖含量,mg/g;C′為提取液中真菌多糖含量,μg/g;V′為提取液體積,mL;ω為干菌絲體質(zhì)量,g。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 蟬花生物量的獲得

    2.1.1 發(fā)酵溫度對(duì)生物量的影響 蟬花真菌在不同溫度下進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)的結(jié)果見(jiàn)圖1。對(duì)于微生物液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)來(lái)說(shuō),溫度的影響是雙方面的:隨著溫度升高,可以加速微生物的生長(zhǎng)代謝,但是溫度過(guò)高不僅會(huì)導(dǎo)致微生物體內(nèi)的酶失活還容易使菌體老化,從而影響微生物的正常生長(zhǎng)以及代謝產(chǎn)物的積累;溫度過(guò)低則導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)緩慢,因而積累的代謝產(chǎn)物較少。蟬花真菌菌株在溫度為 22~34 ℃ 條件下均能生長(zhǎng),在溫度為28 ℃條件下所獲得的生物量最大,為5.63 g/L。

    2.1.2 發(fā)酵pH值對(duì)生物量的影響 不同pH值對(duì)生物量的影響見(jiàn)圖2。在正常條件下,pH值過(guò)低菌體容易衰老,而pH值過(guò)高則會(huì)導(dǎo)致菌體自溶。本試驗(yàn)通過(guò)設(shè)置不同的pH值來(lái)考察蟬花液體發(fā)酵培養(yǎng)的最佳pH值。蟬花真菌在pH值為 6.5~7.7條件下均能生長(zhǎng),生物量隨著pH值的上升出現(xiàn)了先增加后減少的現(xiàn)象,在pH值為7.1時(shí)所獲生物量最大,為4.68 g/L。

    2.1.3 發(fā)酵搖床轉(zhuǎn)速對(duì)生物量的影響 蟬花真菌屬于好氧微生物,菌絲的生長(zhǎng)需要消耗氧氣,提高搖床的轉(zhuǎn)速,不僅可以增大液體接觸空氣的面積,還對(duì)蟬花真菌的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用;轉(zhuǎn)速太小影響通氣量,從而影響溶氧量,不利于菌絲生長(zhǎng);搖床轉(zhuǎn)速超過(guò)最佳轉(zhuǎn)速時(shí),由于剪切力增加,菌絲被切斷導(dǎo)致菌絲體難以成形,因此難以維持正常的生長(zhǎng),導(dǎo)致獲得的生物量減少(圖3)。在搖床轉(zhuǎn)速為 150 r/min 時(shí)所獲生物量最大,為4.68 g/L。

    2.1.4 發(fā)酵裝液量對(duì)生物量的影響 不同裝液量對(duì)生物量的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。裝液量主要影響發(fā)酵過(guò)程中的通氣情況,從而影響菌絲體的生長(zhǎng),裝液量過(guò)小導(dǎo)致培養(yǎng)基水分蒸發(fā)較快,代謝物濃度較大,溶氧量下降;裝液量過(guò)大會(huì)使振蕩效果減弱,溶氧量降低。蟬花真菌液態(tài)發(fā)酵最佳裝液量為40%,此時(shí)生物量為5.37 g/L。

    2.2 蟬花真菌最佳液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件

    選擇溫度、裝液量、搖床轉(zhuǎn)速、pH值為試驗(yàn)因素,因素水平表見(jiàn)表1。

    正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表2,影響蟬花真菌液態(tài)發(fā)酵生物量的各因素主次為A>C>D>B,即溫度對(duì)蟬花真菌液態(tài)發(fā)酵過(guò)程中生物量的影響最大,搖床轉(zhuǎn)速次之,pH值再次之,裝液量對(duì)生物量的影響最小。根據(jù)表2直觀分析最佳發(fā)酵條件為A2B1C2D3, 該條件下發(fā)酵液中的生物量為6.13 g/L。

    蟬花真菌液體發(fā)酵培養(yǎng)的最佳條件:溫度為28 ℃,搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min,pH值為7.4,裝液量為40%。

    2.3 蟬花菌絲體中的活性成分測(cè)定

    2.3.1 蟲草酸含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 根據(jù)高碘酸鈉比色法,作蟲草酸(D-甘露醇)含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5)。蟲草酸含量的回歸方程:y=0.004 0x+0.003 2。根據(jù)“1.6.2”節(jié)中的方法得到的樣品吸光度為 0.572,蟲草酸含量為95.82 mg/g。

    2.3.2 蟬花真菌多糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 根據(jù)硫酸-苯酚法,作真菌多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖6)。真菌多糖含量的回歸方程:y=0.067 5x-0.014 0。根據(jù)“1.6.3”節(jié)中的方法得到的樣品吸光度是0.497,真菌多糖含量為107.45 mg/g。

    3 結(jié)論與討論

    本研究通過(guò)對(duì)蟬花真菌進(jìn)行液體發(fā)酵工藝優(yōu)化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),蟬花真菌液體發(fā)酵培養(yǎng)的最佳條件是溫度為28 ℃,搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min,pH值為7.4,裝液量為40%。

    文欣等發(fā)現(xiàn),在改良的液體發(fā)酵條件下得到的蟬花菌絲生物量為 5.72 g/L,真菌多糖含量為86.71 mg/g,蟲草酸含量為 90.13 mg/g[10]。黃小忠等在改良的液體發(fā)酵培養(yǎng)基條件下,得到的蟬花菌絲生物量為5.63 g/L,真菌多糖含量為88.73 mg/g,蟲草酸含量為82.58 mg/g[2]。本研究在使用改良液體發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,優(yōu)化了發(fā)酵工藝,所獲得的生物量為 6.13 g/L,真菌多糖含量為107.45 mg/g,蟲草酸含量為 95.82 mg/g。3項(xiàng)指標(biāo)皆明顯提高,在發(fā)酵中所獲得的蟬花菌絲體活性物質(zhì)與天然蟬花中活性物質(zhì)相同,但蟬花菌絲體中的天然有益物質(zhì)真菌多糖和蟲草酸的含量均高于天然蟬花,天然蟬花真菌多糖含量為33.2 mg/g,蟲草酸含量為53.6 mg/g[11]。因此將蟬花液體發(fā)酵菌絲體用于保健用品開發(fā),以替代天然蟬花的使用不無(wú)可能,此方法不僅可以降低生產(chǎn)成本,也可減少對(duì)天然蟬花資源的破壞。

    本研究對(duì)蟬花液體發(fā)酵條件進(jìn)行了考察,優(yōu)化了蟬花液體發(fā)酵工藝條件。后續(xù)還將會(huì)對(duì)蟬擬青霉菌種進(jìn)行選育考察,同時(shí)將繼續(xù)研究和改良發(fā)酵培養(yǎng)基的配方,在打破傳統(tǒng)配方的基礎(chǔ)上,尋找更適合蟬花發(fā)酵的碳源、氮源等材料,從而進(jìn)一步優(yōu)化蟬花發(fā)酵工藝。

    參考文獻(xiàn):

    [1]陳顯群,羊 悅,楊勝利. 中藥蟬花菌株篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化研究[J]. 浙江化工,2015,46(2):18-21.

    [2]黃小忠,謝正林,許俊齊,等. 蟬花真菌的分離及液體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2017,45(22):153-155.

    [3]程愛(ài)芳,鄧政東,陳 文,等. 多粘類芽孢桿菌HD-1產(chǎn)纖維素酶的條件優(yōu)化[J]. 食品工業(yè)科技,2015,36(10):173-177.

    [4]程?hào)|慶,丁志山,林美愛(ài),等. 蟬花真菌的分離及液體發(fā)酵培養(yǎng)[J]. 中藥材,2006,29(2):99-101.

    [5]曾凡清,劉德云,宋小亞,等. 蟬花的分離和培養(yǎng)研究[J]. 浙江食用菌,2008(4):28-29.

    [6]官宗華,宋玉良,滕 曄,等. 金蟬花菌種的分離和培養(yǎng)[J]. 內(nèi)蒙古中醫(yī)藥,2012,31(18):34.

    [7]夏 敏,溫 魯. 微波法提取蟲草素研究[J]. 食品科學(xué),2006,27(10):248-251.

    [8]來(lái)永斌,王 琦,孫 月. 蛹蟲草多糖含量的測(cè)定與分析[J]. 中成藥,2001,23(7):517-518.

    [9]邵 穎,李 文,王 陶. 蛹擬青霉發(fā)酵菌絲體中蟲草酸的提取與測(cè)定[J]. 食品工業(yè)科技,2012,33(1):262-264,267.

    [10]文 欣,劉素純,黃曉晗. 蟬花菌株的篩選及菌絲體成分分析[J]. 食品與機(jī)械,2013,29(3):61-65.

    [11]董鈺明,劉 暉,張 軍,等. 比色法測(cè)定復(fù)方蟲草顆粒中甘露醇的含量[J]. 中草藥,2001,32(8):697-699.任 凱,陳 通,陸道禮,等. 基于微型可見(jiàn)光譜儀的茶湯色差的研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2020,48(2):201-206.

    猜你喜歡
    活性成分測(cè)定
    黃芪生理活性成分及其藥理作用研究進(jìn)展
    不同濃度氮磷配比對(duì)丹參生長(zhǎng)和活性成分積累的影響
    贛南臍橙葉片中氮含量的測(cè)定研究
    高效液相色譜法測(cè)定腎舒康膠囊淫羊藿苷含量
    不同炮制工藝對(duì)何首烏中成分含量的影響
    不同炮制方法對(duì)北柴胡中柴胡皂苷d的含量影響
    對(duì)環(huán)境監(jiān)測(cè)中水質(zhì)總磷測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)方法的探討
    綠色科技(2016年20期)2016-12-27 16:04:51
    水中BOD5分析應(yīng)注意問(wèn)題解析
    東方教育(2016年3期)2016-12-14 20:35:31
    野生靈芝與栽培靈芝主要成分和功效的比較分析
    雪菊活性成分提取及引種研究進(jìn)展
    伊人久久国产一区二区| 性少妇av在线| 精品福利永久在线观看| 国产男女超爽视频在线观看| 女性生殖器流出的白浆| 最新的欧美精品一区二区| 午夜av观看不卡| 欧美中文综合在线视频| 99久国产av精品国产电影| 国产成人欧美| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 久久狼人影院| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 日本色播在线视频| 国产片内射在线| 亚洲欧美一区二区三区久久| av不卡在线播放| 久久97久久精品| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 久久久久国产精品人妻一区二区| 中文字幕制服av| 国产乱人偷精品视频| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 男人添女人高潮全过程视频| 免费看不卡的av| 久久久久久久久久久免费av| 国产成人精品无人区| 在线天堂最新版资源| 日本欧美视频一区| 尾随美女入室| 考比视频在线观看| 欧美黄色片欧美黄色片| 无遮挡黄片免费观看| 欧美av亚洲av综合av国产av | 国产精品国产av在线观看| 最近手机中文字幕大全| 最近手机中文字幕大全| 99九九在线精品视频| av卡一久久| 亚洲综合精品二区| 最近手机中文字幕大全| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 看免费av毛片| 日日摸夜夜添夜夜爱| 午夜激情久久久久久久| 韩国精品一区二区三区| 在线观看人妻少妇| 18禁国产床啪视频网站| 一区二区三区精品91| 男女边吃奶边做爰视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 精品亚洲成a人片在线观看| 岛国毛片在线播放| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 亚洲精品久久午夜乱码| 中文字幕亚洲精品专区| 久久精品人人爽人人爽视色| 精品国产乱码久久久久久小说| 人人澡人人妻人| 欧美成人午夜精品| 欧美黑人欧美精品刺激| 看非洲黑人一级黄片| xxxhd国产人妻xxx| 妹子高潮喷水视频| 午夜福利视频在线观看免费| 深夜精品福利| 国产精品一区二区精品视频观看| 欧美日韩av久久| 男女午夜视频在线观看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| h视频一区二区三区| 亚洲精品一二三| 色94色欧美一区二区| 51午夜福利影视在线观看| 男人操女人黄网站| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 国产伦人伦偷精品视频| 久久女婷五月综合色啪小说| 亚洲成人国产一区在线观看 | 亚洲五月色婷婷综合| 亚洲欧美一区二区三区久久| 国产老妇伦熟女老妇高清| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 老司机靠b影院| 自线自在国产av| 在线观看一区二区三区激情| 日韩一区二区视频免费看| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 精品国产国语对白av| 久久久久国产精品人妻一区二区| 久久久久久久国产电影| 国产色婷婷99| 午夜福利,免费看| 久久国产精品大桥未久av| 免费高清在线观看日韩| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲av欧美aⅴ国产| 操出白浆在线播放| 国产亚洲欧美精品永久| 大片免费播放器 马上看| 国产精品一二三区在线看| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产伦人伦偷精品视频| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产成人免费观看mmmm| 国产男人的电影天堂91| 操美女的视频在线观看| 丝袜美足系列| 一级a爱视频在线免费观看| www.自偷自拍.com| 欧美 日韩 精品 国产| 丰满饥渴人妻一区二区三| 悠悠久久av| 精品视频人人做人人爽| 欧美日本中文国产一区发布| 香蕉国产在线看| 日韩成人av中文字幕在线观看| 婷婷成人精品国产| 国产欧美亚洲国产| 成人国语在线视频| 秋霞在线观看毛片| 性高湖久久久久久久久免费观看| 亚洲国产av影院在线观看| 9191精品国产免费久久| 国产色婷婷99| 国产黄色免费在线视频| 久久精品久久精品一区二区三区| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 永久免费av网站大全| 色婷婷av一区二区三区视频| 中国三级夫妇交换| 黑丝袜美女国产一区| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 最黄视频免费看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 黑人猛操日本美女一级片| 精品国产乱码久久久久久男人| 色网站视频免费| 亚洲人成电影观看| 超色免费av| 久久性视频一级片| 国产麻豆69| 久久ye,这里只有精品| 欧美另类一区| 国产在视频线精品| 美女午夜性视频免费| 电影成人av| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产 精品1| 国产精品久久久人人做人人爽| 最新的欧美精品一区二区| 黄片播放在线免费| 新久久久久国产一级毛片| 国产av码专区亚洲av| 国产男女内射视频| 亚洲精品国产av蜜桃| 久久久国产精品麻豆| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 国产老妇伦熟女老妇高清| 蜜桃在线观看..| 成人黄色视频免费在线看| 久久97久久精品| 亚洲国产精品国产精品| 美女大奶头黄色视频| 中国国产av一级| 中文字幕制服av| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 在线观看人妻少妇| 国产精品无大码| 黑人猛操日本美女一级片| 黄色怎么调成土黄色| 免费不卡黄色视频| 观看av在线不卡| 成人影院久久| 不卡av一区二区三区| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 搡老岳熟女国产| 熟女av电影| 国产精品一区二区在线观看99| 国产极品天堂在线| 亚洲美女视频黄频| 亚洲精品国产色婷婷电影| av不卡在线播放| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 中文天堂在线官网| 亚洲精品国产一区二区精华液| 97精品久久久久久久久久精品| 亚洲国产日韩一区二区| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 黑丝袜美女国产一区| 多毛熟女@视频| 各种免费的搞黄视频| 五月天丁香电影| 国产成人一区二区在线| 国产一区亚洲一区在线观看| 亚洲av综合色区一区| 欧美日韩综合久久久久久| 一级毛片电影观看| 久久久国产欧美日韩av| 两性夫妻黄色片| 日韩欧美精品免费久久| 欧美人与善性xxx| 一级毛片 在线播放| 久热爱精品视频在线9| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产一区亚洲一区在线观看| 久久久久久人妻| 亚洲av日韩在线播放| 两个人看的免费小视频| 亚洲伊人色综图| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 一区二区三区四区激情视频| 国产又爽黄色视频| 视频区图区小说| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 午夜福利,免费看| 国产97色在线日韩免费| 晚上一个人看的免费电影| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 丰满迷人的少妇在线观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 欧美激情极品国产一区二区三区| av一本久久久久| 自线自在国产av| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 黄色毛片三级朝国网站| 久久亚洲国产成人精品v| 精品久久久久久电影网| 国产精品国产三级国产专区5o| 亚洲精品一二三| 免费观看人在逋| 国产午夜精品一二区理论片| 久久久亚洲精品成人影院| 国产精品 欧美亚洲| 9热在线视频观看99| 久热这里只有精品99| 99精国产麻豆久久婷婷| 日韩制服骚丝袜av| 好男人视频免费观看在线| 涩涩av久久男人的天堂| 一级,二级,三级黄色视频| 中文字幕最新亚洲高清| 国产一级毛片在线| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 赤兔流量卡办理| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 精品第一国产精品| 一级a爱视频在线免费观看| 午夜福利一区二区在线看| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 日韩av免费高清视频| www日本在线高清视频| 亚洲,欧美精品.| 七月丁香在线播放| 午夜精品国产一区二区电影| 免费高清在线观看视频在线观看| 下体分泌物呈黄色| 国产av码专区亚洲av| 精品一区二区三区av网在线观看 | 一级毛片黄色毛片免费观看视频| a级毛片在线看网站| 熟女av电影| 欧美精品一区二区免费开放| 大片电影免费在线观看免费| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 亚洲精品国产区一区二| a级片在线免费高清观看视频| 欧美精品一区二区免费开放| 9色porny在线观看| 国产精品一二三区在线看| 女人久久www免费人成看片| 成人手机av| 18禁国产床啪视频网站| 日韩人妻精品一区2区三区| 免费人妻精品一区二区三区视频| 夫妻午夜视频| 日韩欧美精品免费久久| 在线观看人妻少妇| 成人午夜精彩视频在线观看| 中文欧美无线码| 大码成人一级视频| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 日本午夜av视频| av女优亚洲男人天堂| 国产精品一区二区在线观看99| 丰满迷人的少妇在线观看| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 国产亚洲一区二区精品| 一级片免费观看大全| 人妻人人澡人人爽人人| 久久女婷五月综合色啪小说| 黄色怎么调成土黄色| 成人午夜精彩视频在线观看| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产色婷婷99| 99久久精品国产亚洲精品| 婷婷色av中文字幕| 久久性视频一级片| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 大话2 男鬼变身卡| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 亚洲男人天堂网一区| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 韩国精品一区二区三区| 国产国语露脸激情在线看| 一边摸一边做爽爽视频免费| 伊人亚洲综合成人网| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 成年人免费黄色播放视频| www.熟女人妻精品国产| 精品人妻在线不人妻| 亚洲美女黄色视频免费看| 欧美精品亚洲一区二区| 久久99一区二区三区| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲在久久综合| 亚洲av福利一区| 国产深夜福利视频在线观看| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 国产爽快片一区二区三区| 日本av免费视频播放| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 国产又色又爽无遮挡免| 国产精品三级大全| 欧美在线黄色| 精品午夜福利在线看| 97在线人人人人妻| 99热网站在线观看| 欧美亚洲日本最大视频资源| 亚洲一区二区三区欧美精品| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产女主播在线喷水免费视频网站| av国产久精品久网站免费入址| 九草在线视频观看| 超碰成人久久| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 一二三四中文在线观看免费高清| 亚洲国产日韩一区二区| 久久97久久精品| 99re6热这里在线精品视频| www.熟女人妻精品国产| 久久毛片免费看一区二区三区| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 国产熟女欧美一区二区| 亚洲欧美清纯卡通| 国产精品.久久久| 黄片播放在线免费| 精品少妇黑人巨大在线播放| 在线观看国产h片| 97在线人人人人妻| 中国三级夫妇交换| 国产又爽黄色视频| 国产亚洲欧美精品永久| 国产成人系列免费观看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 桃花免费在线播放| 99久久人妻综合| 99热国产这里只有精品6| 国产精品一二三区在线看| 99精国产麻豆久久婷婷| 精品国产一区二区久久| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 日本av手机在线免费观看| 精品亚洲成a人片在线观看| 电影成人av| 久久韩国三级中文字幕| 欧美变态另类bdsm刘玥| 午夜老司机福利片| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 欧美日本中文国产一区发布| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 免费黄色在线免费观看| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 亚洲国产av新网站| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 久久久亚洲精品成人影院| 日韩av免费高清视频| 狂野欧美激情性bbbbbb| 亚洲第一青青草原| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产人伦9x9x在线观看| 如何舔出高潮| 交换朋友夫妻互换小说| 91精品伊人久久大香线蕉| 国产午夜精品一二区理论片| 国产97色在线日韩免费| 超碰97精品在线观看| 欧美激情极品国产一区二区三区| 各种免费的搞黄视频| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产成人一区二区在线| 最近最新中文字幕免费大全7| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 看十八女毛片水多多多| 国产精品一区二区在线不卡| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 赤兔流量卡办理| 色吧在线观看| 欧美日韩亚洲高清精品| 欧美黄色片欧美黄色片| 亚洲精品乱久久久久久| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 亚洲国产av影院在线观看| 最近2019中文字幕mv第一页| 欧美人与善性xxx| 一本色道久久久久久精品综合| 秋霞在线观看毛片| 国产av码专区亚洲av| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 狂野欧美激情性bbbbbb| 在线精品无人区一区二区三| 日韩人妻精品一区2区三区| 中文字幕av电影在线播放| 精品国产一区二区三区四区第35| 制服诱惑二区| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 秋霞伦理黄片| 欧美黄色片欧美黄色片| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 51午夜福利影视在线观看| 精品少妇内射三级| 午夜福利,免费看| 久久久精品94久久精品| 亚洲色图综合在线观看| 精品国产一区二区三区四区第35| 少妇的丰满在线观看| 国产成人系列免费观看| 黑人猛操日本美女一级片| 熟女av电影| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产成人精品福利久久| 美国免费a级毛片| 中文字幕人妻丝袜制服| 丝袜脚勾引网站| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 欧美 日韩 精品 国产| 99热国产这里只有精品6| 高清在线视频一区二区三区| 久久久久国产一级毛片高清牌| 男女午夜视频在线观看| www.精华液| 久久亚洲国产成人精品v| 久久青草综合色| 久久精品人人爽人人爽视色| 99久国产av精品国产电影| 一级片免费观看大全| 日韩一区二区三区影片| 国产极品粉嫩免费观看在线| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲精品国产色婷婷电影| 91精品三级在线观看| 嫩草影院入口| 午夜福利网站1000一区二区三区| 青春草国产在线视频| 操出白浆在线播放| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 激情五月婷婷亚洲| 在线天堂中文资源库| 久久精品国产综合久久久| 满18在线观看网站| 99热全是精品| 久久久久精品久久久久真实原创| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 777米奇影视久久| 考比视频在线观看| 国产av国产精品国产| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 免费在线观看黄色视频的| 久久人人97超碰香蕉20202| 最近最新中文字幕免费大全7| 国产在线一区二区三区精| 欧美日韩一级在线毛片| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 日韩一本色道免费dvd| 曰老女人黄片| 精品福利永久在线观看| 男人爽女人下面视频在线观看| 欧美激情高清一区二区三区 | 久久女婷五月综合色啪小说| 国精品久久久久久国模美| 熟女av电影| svipshipincom国产片| 一级爰片在线观看| 七月丁香在线播放| av线在线观看网站| 人人妻人人澡人人看| 亚洲成人一二三区av| 亚洲熟女精品中文字幕| 丝袜在线中文字幕| 精品国产乱码久久久久久小说| 久久久久久人人人人人| 国产精品无大码| 国产精品久久久久久久久免| 观看av在线不卡| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 欧美国产精品一级二级三级| 亚洲熟女毛片儿| 交换朋友夫妻互换小说| 久久久久精品性色| 亚洲精品视频女| 热re99久久精品国产66热6| 欧美最新免费一区二区三区| 午夜福利影视在线免费观看| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 成年美女黄网站色视频大全免费| 99久久99久久久精品蜜桃| 日本91视频免费播放| 99国产综合亚洲精品| 老司机深夜福利视频在线观看 | 一本大道久久a久久精品| 90打野战视频偷拍视频| 久久 成人 亚洲| 啦啦啦 在线观看视频| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 飞空精品影院首页| 成人手机av| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 色婷婷av一区二区三区视频| 在线观看人妻少妇| 久久久国产一区二区| 热99久久久久精品小说推荐| xxxhd国产人妻xxx| 夫妻性生交免费视频一级片| 中文字幕高清在线视频| 午夜福利在线免费观看网站| 美国免费a级毛片| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 亚洲欧洲日产国产| videos熟女内射| 桃花免费在线播放| 乱人伦中国视频| 国产一区亚洲一区在线观看| 欧美在线黄色| 国产精品 欧美亚洲| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 日韩电影二区| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 欧美黑人精品巨大| 国产精品欧美亚洲77777| 国产又色又爽无遮挡免| 久久久久久久久免费视频了| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 国产精品久久久人人做人人爽| 最新在线观看一区二区三区 | 国产亚洲最大av| 两个人免费观看高清视频| 欧美日韩一级在线毛片| 悠悠久久av| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 国产在线一区二区三区精| 日日撸夜夜添| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产高清国产精品国产三级| 国产伦理片在线播放av一区| 亚洲情色 制服丝袜| 欧美黑人欧美精品刺激| 日日爽夜夜爽网站| 精品国产乱码久久久久久男人| 色婷婷久久久亚洲欧美| 超色免费av| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 视频区图区小说| 欧美av亚洲av综合av国产av | 男人舔女人的私密视频| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 国产淫语在线视频| 国产一区二区 视频在线| 伦理电影大哥的女人| 不卡av一区二区三区| 欧美xxⅹ黑人| 国产亚洲一区二区精品| 国产极品粉嫩免费观看在线| 18禁动态无遮挡网站| 国产麻豆69| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 青春草亚洲视频在线观看| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 精品久久久精品久久久| 人成视频在线观看免费观看| 久久人人爽人人片av| 看非洲黑人一级黄片| 国产日韩欧美在线精品| 久久久久人妻精品一区果冻| 国产在线免费精品| 又黄又粗又硬又大视频| 日韩av不卡免费在线播放| 老汉色∧v一级毛片| 国产成人免费观看mmmm| 久热这里只有精品99| 久久久久久久精品精品| 伦理电影大哥的女人| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 国产极品天堂在线| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 啦啦啦在线观看免费高清www| 亚洲精品一二三| 91老司机精品| 人体艺术视频欧美日本|