蟬花真菌液體發(fā)酵及活性成分測(cè)定

黃小忠　謝春芹　張雪松　凡軍民　許俊齊　陳松玲

摘要：利用蟬擬青霉（Paecilomyces cicadae）菌株進(jìn)行液體發(fā)酵，并進(jìn)行單因素和正交試驗(yàn)，以實(shí)現(xiàn)蟬花真菌液態(tài)發(fā)酵條件包括pH值、溫度、搖床轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)基裝液量的優(yōu)化。結(jié)果表明，蟬花液體發(fā)酵的最優(yōu)條件為pH值7.4、搖床轉(zhuǎn)速 150 r/min、溫度28 ℃、裝液量40%;在此條件下，測(cè)得的真菌多糖含量為107.45 mg/g，蟲草酸含量為95.82 mg/g，真菌多糖、蟲草酸含量皆高于天然蟬花。

關(guān)鍵詞：蟬花;液體發(fā)酵;活性成分;測(cè)定

中圖分類號(hào)： S567.3+50.1;S188+.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）02-0197-04

收稿日期：2018-10-29

作者簡(jiǎn)介：黃小忠（1981—），男，江蘇海安人，碩士，講師，主要從事發(fā)酵工程研究。E-mail：huangxiaozhong@jsafc.edu.cn。

通信作者：謝春芹，副教授，主要從事食藥用菌研究。E-mail：xiechunqin@jsafc.edu.cn。

蟬花（Cordyceps cicadae），別稱大蟲草，屬蟲生真菌，與冬蟲夏草有非常接近的親緣關(guān)系，屬麥角菌科（Clavicipttaceus）蟲草屬（Cordyceps），在我國(guó)，蟬花主要分布在四川省、江蘇省、浙江省、福建省等地[1]。

國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究成果表明，蟬花具有多種保健作用，包括提高人體自身免疫力、抗疲勞、養(yǎng)腎、養(yǎng)肝、改善睡眠、抗腫瘤、抗輻射和明目等，是一味具有神奇效果的古老中草藥[2]。李時(shí)珍在《本草綱目》中記載的藥效為：“蟬花可治療驚癇，夜啼心悸，功同蟬蛻”。蟬花的天然成分與冬蟲夏草類似，具有相同的藥用價(jià)值，且尚未檢測(cè)出有毒重金屬如碘、汞、鉛等，在安全性方面蟬花顯然優(yōu)于冬蟲夏草，同時(shí)蟬花的價(jià)格相對(duì)于冬蟲夏草而言較低，因此蟬花常作為冬蟲夏草的替代品。

蟬花對(duì)生長(zhǎng)條件要求比較嚴(yán)格，需要特定的生態(tài)環(huán)境和寄主昆蟲（金蟬）[3]，這是蟬花資源稀少的主要原因。近幾年隨著生態(tài)環(huán)境的破壞，蟬花的生長(zhǎng)區(qū)域大范圍縮小;同時(shí)人們開始認(rèn)識(shí)到蟬花的價(jià)值，使蟬花遭到了瘋狂的采摘，導(dǎo)致蟬花資源迅速減少。本試驗(yàn)的目的是利用蟬擬青霉（Paecilomyces cicadae），在經(jīng)優(yōu)化的液態(tài)培養(yǎng)條件下生產(chǎn)蟬花菌絲體，并對(duì)菌絲體的生物活性物質(zhì)進(jìn)行提取及測(cè)定分析，以期通過(guò)菌絲體發(fā)酵來(lái)獲得天然蟬花含有的藥用活性物質(zhì)，為規(guī)?；a(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 蟬花菌種來(lái)源

蟬花（Cordyceps cicadae）菌株來(lái)自江蘇省食用菌研究所。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品、乙酸銨、冰醋酸、乙酰丙酮、高碘酸鈉、L-鼠李糖、葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、酵母膏、瓊脂、孟加拉紅染色劑、氯霉素、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、高碘酸鉀、苯酚、濃硫酸、無(wú)水乙醇。

1.2.2 儀器 水浴恒溫振蕩器;電子天平;立式壓力蒸汽滅菌器;數(shù)顯恒溫水浴鍋;可見(jiàn)分光光度計(jì);冷凍真空干燥機(jī)。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 菌種保藏培養(yǎng)基 PDA斜面試管培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，加水至1 L，pH值自然，在121 ℃下滅菌30 min備用。

1.3.2 種子培養(yǎng)基 土豆200 g、蔗糖50 g、豆粕 5 g、KH2PO4 5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g，加水至1 L，pH值自然，在 121 ℃ 下滅菌30 min備用。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基 蔗糖40 g、蛋白胨15 g、KH2PO4 1.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g，加水至1 L，在121 ℃下滅菌30 min備用。

1.4 發(fā)酵種子的制備

1.4.1 菌種活化 將試驗(yàn)分離所得到的在低溫保藏的蟬花菌種通過(guò)無(wú)菌操作接種于PDA平板培養(yǎng)基上，在溫度為 28 ℃ 條件下培養(yǎng)2～3 d進(jìn)行活化，當(dāng)菌絲長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿時(shí)，即可使用[4]。

1.4.2 孢子懸浮液的制備 在無(wú)菌條件下，用接種鉤從培養(yǎng)基上取大小約0.3 cm×0.3 cm的母種塊，接種于盛有100 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中（菌塊稍帶培養(yǎng)基且要薄，以能浮在培養(yǎng)液表面為最佳），在溫度為28 ℃，轉(zhuǎn)速為180 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)72 h[5]。

1.5 液體發(fā)酵條件的確定

1.5.1 發(fā)酵溫度的優(yōu)化 取5 mL菌懸液，接入裝液（發(fā)酵培養(yǎng)基）量為40%的250 mL三角瓶中，將恒溫?fù)u床的溫度分別設(shè)為22、25、28、31、34 ℃，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)為150 r/min，培養(yǎng)5 d后測(cè)其生物量。

1.5.2 發(fā)酵pH值的優(yōu)化 取5 mL菌懸液，接入初始pH值分別為6.5、6.8、7.1、7.4，培養(yǎng)基裝液量為40%的250 mL三角瓶中，置于溫度為28 ℃的搖床中以轉(zhuǎn)速為150 r/min的速率進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)5 d后測(cè)其生物量。

1.5.3 發(fā)酵搖床轉(zhuǎn)速的優(yōu)化 取5 mL菌懸液，接入裝液量為三角瓶中，將搖床的轉(zhuǎn)速分別設(shè)為110、130、150、170、190 r/min，在溫度為28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)5 d后測(cè)其生物量。

1.5.4 發(fā)酵裝液量的優(yōu)化 在裝液量分別為20%、40%、60%、80%的三角瓶中接入5 mL菌懸液，置于溫度為28 ℃的恒溫?fù)u床中以轉(zhuǎn)速為150 r/min的速度培養(yǎng)5 d后測(cè)其生物量。

1.5.5 正交試驗(yàn)的確定 選擇溫度、搖床轉(zhuǎn)速、pH值和裝液量為試驗(yàn)因素，進(jìn)行4個(gè)因素3個(gè)水平 L9（34） 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行極差和方差分析，探討各種培養(yǎng)條件對(duì)蟬花液態(tài)發(fā)酵所獲得的生物量和蟲草酸含量的影響程度。

1.6 測(cè)定方法

1.6.1 生物量測(cè)定方法 采用細(xì)胞干質(zhì)量法[6]測(cè)定蟬在液態(tài)發(fā)酵所獲生物量，具體操作為在發(fā)酵液培養(yǎng)完成后，用100目篩過(guò)濾得到菌絲體和胞外液，用蒸餾水反復(fù)沖洗菌絲體直至所出濾液澄清為止，將所收集的菌絲體置于玻璃紙上，放入烘箱中，在溫度為60 ℃條件下烘干至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量得生物量。

1.6.2 蟲草酸含量測(cè)定 通過(guò)微波提取法[7]提取菌絲體中的蟲草酸。利用高碘酸鈉比色法[8]測(cè)定蟲草酸含量。

1.6.2.1 微波提取法 取0.05 g干燥液體發(fā)酵菌絲體加入10 mL蒸餾水中在微波爐中通過(guò)中火加熱2 min進(jìn)行微波處理。處理完畢后在3 000 r/min下離心25 min，取上清液加入到50 mL容量瓶中，并用蒸餾水定容。

1.6.2.2 高碘酸鈉比色法 取50 mg甘露醇加入到50 mL蒸餾水中配置成1 mg/mL甘露醇溶液，分別取1、2、3、4、5 mL甘露醇溶液于100 mL容量瓶中，并用蒸餾水定容，得到10、20、30、40、50 μg/mL樣液，取樣液各1 mL，加1 mL高錳酸鉀溶液（加0.15 mol高錳酸鉀于100 mL 0.12 mol/L鹽酸溶液中混勻）。室溫放置10 min，加入2 mL 0.1% L-鼠李糖溶液除去過(guò)多的高碘酸鹽?；旌虾蠹? mL新配NaSH試劑（150 g乙酸銨，2 mL冰乙酸，2 mL乙酰丙酮，用蒸餾水稀釋至 1 000 mL），53 ℃水浴加熱15 min使其呈色，冷卻，用蒸餾水代替甘露醇標(biāo)準(zhǔn)液。在波長(zhǎng)為412 nm處測(cè)吸光度（D412 nm），將測(cè)得的吸光度通過(guò)回歸方程進(jìn)行計(jì)算，然后通過(guò)下式計(jì)算菌絲體中蟲草酸的含量[8]。

R=C×V×101 000×m。

式中：R為菌絲體中蟲草酸含量，mg/g;C為提取液中蟲草酸含量，μg/g;10為試樣浸提后定容體積，mL;V為提取液體積，mL;m為試樣的準(zhǔn)確質(zhì)量，g。

1.6.3 真菌多糖含量的測(cè)定 將干燥后的菌絲體進(jìn)行前處理。步驟：熱水提取、乙醇沉淀、脫色、去蛋白、低溫干燥。采用硫酸-苯酚法[9]測(cè)定真菌多糖含量。

1.6.3.1 前處理 取2 g干燥液體發(fā)酵菌絲研磨成粉末，用水提醇法提取，即加10倍量的蒸餾水，100 ℃水浴煎煮 1 h，重復(fù)3次，過(guò)濾提取液，濃縮至1 g ∶1 mL，加3倍量的95%乙醇進(jìn)行沉淀，5 000 r/min 離心5 min，取上清液，繼續(xù)加95%乙醇放置，傾出上清液，沉淀依次用95%乙醇、無(wú)水乙醇洗滌、過(guò)濾，低溫干燥24 h，即得多糖粗品。

1.6.3.2 硫酸-苯酚法測(cè)定真菌多糖 將提取的多糖樣品置于10 mL容量瓶中，加雙蒸水溶解，并稀釋到刻度線位置，搖勻，備用。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（100 μg/mL）0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別加入到各試管中，用雙蒸水補(bǔ)足至每管2 mL，使各管葡萄糖含量分別為0、10、20、30、40、60、80、100 μg。向各管中分別加入0.05 mL 80%苯酚溶液，再加入5 mL濃硫酸（勿沿管壁加入，以便使樣品與硫酸快速混勻），靜置10 min，30 ℃ 水浴15 min。在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)各管的吸光度，以糖濃度為橫坐標(biāo)，各管的吸光度為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，作回歸方程曲線，通過(guò)以下公式計(jì)算真菌多糖含量。

R′=C′×V′1 000×ω。

式中：R′為菌絲體中真菌多糖含量，mg/g;C′為提取液中真菌多糖含量，μg/g;V′為提取液體積，mL;ω為干菌絲體質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟬花生物量的獲得

2.1.1 發(fā)酵溫度對(duì)生物量的影響 蟬花真菌在不同溫度下進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)的結(jié)果見(jiàn)圖1。對(duì)于微生物液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)來(lái)說(shuō)，溫度的影響是雙方面的：隨著溫度升高，可以加速微生物的生長(zhǎng)代謝，但是溫度過(guò)高不僅會(huì)導(dǎo)致微生物體內(nèi)的酶失活還容易使菌體老化，從而影響微生物的正常生長(zhǎng)以及代謝產(chǎn)物的積累;溫度過(guò)低則導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)緩慢，因而積累的代謝產(chǎn)物較少。蟬花真菌菌株在溫度為 22～34 ℃ 條件下均能生長(zhǎng)，在溫度為28 ℃條件下所獲得的生物量最大，為5.63 g/L。

2.1.2 發(fā)酵pH值對(duì)生物量的影響 不同pH值對(duì)生物量的影響見(jiàn)圖2。在正常條件下，pH值過(guò)低菌體容易衰老，而pH值過(guò)高則會(huì)導(dǎo)致菌體自溶。本試驗(yàn)通過(guò)設(shè)置不同的pH值來(lái)考察蟬花液體發(fā)酵培養(yǎng)的最佳pH值。蟬花真菌在pH值為 6.5～7.7條件下均能生長(zhǎng)，生物量隨著pH值的上升出現(xiàn)了先增加后減少的現(xiàn)象，在pH值為7.1時(shí)所獲生物量最大，為4.68 g/L。

2.1.3 發(fā)酵搖床轉(zhuǎn)速對(duì)生物量的影響 蟬花真菌屬于好氧微生物，菌絲的生長(zhǎng)需要消耗氧氣，提高搖床的轉(zhuǎn)速，不僅可以增大液體接觸空氣的面積，還對(duì)蟬花真菌的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用;轉(zhuǎn)速太小影響通氣量，從而影響溶氧量，不利于菌絲生長(zhǎng);搖床轉(zhuǎn)速超過(guò)最佳轉(zhuǎn)速時(shí)，由于剪切力增加，菌絲被切斷導(dǎo)致菌絲體難以成形，因此難以維持正常的生長(zhǎng)，導(dǎo)致獲得的生物量減少（圖3）。在搖床轉(zhuǎn)速為 150 r/min 時(shí)所獲生物量最大，為4.68 g/L。

2.1.4 發(fā)酵裝液量對(duì)生物量的影響 不同裝液量對(duì)生物量的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。裝液量主要影響發(fā)酵過(guò)程中的通氣情況，從而影響菌絲體的生長(zhǎng)，裝液量過(guò)小導(dǎo)致培養(yǎng)基水分蒸發(fā)較快，代謝物濃度較大，溶氧量下降;裝液量過(guò)大會(huì)使振蕩效果減弱，溶氧量降低。蟬花真菌液態(tài)發(fā)酵最佳裝液量為40%，此時(shí)生物量為5.37 g/L。

2.2 蟬花真菌最佳液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件

選擇溫度、裝液量、搖床轉(zhuǎn)速、pH值為試驗(yàn)因素，因素水平表見(jiàn)表1。

正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表2，影響蟬花真菌液態(tài)發(fā)酵生物量的各因素主次為A>C>D>B，即溫度對(duì)蟬花真菌液態(tài)發(fā)酵過(guò)程中生物量的影響最大，搖床轉(zhuǎn)速次之，pH值再次之，裝液量對(duì)生物量的影響最小。根據(jù)表2直觀分析最佳發(fā)酵條件為A2B1C2D3， 該條件下發(fā)酵液中的生物量為6.13 g/L。

蟬花真菌液體發(fā)酵培養(yǎng)的最佳條件：溫度為28 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min，pH值為7.4，裝液量為40%。

2.3 蟬花菌絲體中的活性成分測(cè)定

2.3.1 蟲草酸含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 根據(jù)高碘酸鈉比色法，作蟲草酸（D-甘露醇）含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖5）。蟲草酸含量的回歸方程：y=0.004 0x+0.003 2。根據(jù)“1.6.2”節(jié)中的方法得到的樣品吸光度為 0.572，蟲草酸含量為95.82 mg/g。

2.3.2 蟬花真菌多糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 根據(jù)硫酸-苯酚法，作真菌多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖6）。真菌多糖含量的回歸方程：y=0.067 5x-0.014 0。根據(jù)“1.6.3”節(jié)中的方法得到的樣品吸光度是0.497，真菌多糖含量為107.45 mg/g。

3 結(jié)論與討論

本研究通過(guò)對(duì)蟬花真菌進(jìn)行液體發(fā)酵工藝優(yōu)化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蟬花真菌液體發(fā)酵培養(yǎng)的最佳條件是溫度為28 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min，pH值為7.4，裝液量為40%。

文欣等發(fā)現(xiàn)，在改良的液體發(fā)酵條件下得到的蟬花菌絲生物量為 5.72 g/L，真菌多糖含量為86.71 mg/g，蟲草酸含量為 90.13 mg/g[10]。黃小忠等在改良的液體發(fā)酵培養(yǎng)基條件下，得到的蟬花菌絲生物量為5.63 g/L，真菌多糖含量為88.73 mg/g，蟲草酸含量為82.58 mg/g[2]。本研究在使用改良液體發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了發(fā)酵工藝，所獲得的生物量為 6.13 g/L，真菌多糖含量為107.45 mg/g，蟲草酸含量為 95.82 mg/g。3項(xiàng)指標(biāo)皆明顯提高，在發(fā)酵中所獲得的蟬花菌絲體活性物質(zhì)與天然蟬花中活性物質(zhì)相同，但蟬花菌絲體中的天然有益物質(zhì)真菌多糖和蟲草酸的含量均高于天然蟬花，天然蟬花真菌多糖含量為33.2 mg/g，蟲草酸含量為53.6 mg/g[11]。因此將蟬花液體發(fā)酵菌絲體用于保健用品開發(fā)，以替代天然蟬花的使用不無(wú)可能，此方法不僅可以降低生產(chǎn)成本，也可減少對(duì)天然蟬花資源的破壞。

本研究對(duì)蟬花液體發(fā)酵條件進(jìn)行了考察，優(yōu)化了蟬花液體發(fā)酵工藝條件。后續(xù)還將會(huì)對(duì)蟬擬青霉菌種進(jìn)行選育考察，同時(shí)將繼續(xù)研究和改良發(fā)酵培養(yǎng)基的配方，在打破傳統(tǒng)配方的基礎(chǔ)上，尋找更適合蟬花發(fā)酵的碳源、氮源等材料，從而進(jìn)一步優(yōu)化蟬花發(fā)酵工藝。

參考文獻(xiàn)：

[1]陳顯群，羊 悅，楊勝利. 中藥蟬花菌株篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化研究[J]. 浙江化工，2015，46（2）：18-21.

[2]黃小忠，謝正林，許俊齊，等. 蟬花真菌的分離及液體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（22）：153-155.

[3]程愛(ài)芳，鄧政東，陳 文，等. 多粘類芽孢桿菌HD-1產(chǎn)纖維素酶的條件優(yōu)化[J]. 食品工業(yè)科技，2015，36（10）：173-177.

[4]程?hào)|慶，丁志山，林美愛(ài)，等. 蟬花真菌的分離及液體發(fā)酵培養(yǎng)[J]. 中藥材，2006，29（2）：99-101.

[5]曾凡清，劉德云，宋小亞，等. 蟬花的分離和培養(yǎng)研究[J]. 浙江食用菌，2008（4）：28-29.

[6]官宗華，宋玉良，滕 曄，等. 金蟬花菌種的分離和培養(yǎng)[J]. 內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2012，31（18）：34.

[7]夏 敏，溫 魯. 微波法提取蟲草素研究[J]. 食品科學(xué)，2006，27（10）：248-251.

[8]來(lái)永斌，王 琦，孫 月. 蛹蟲草多糖含量的測(cè)定與分析[J]. 中成藥，2001，23（7）：517-518.

[9]邵 穎，李 文，王 陶. 蛹擬青霉發(fā)酵菌絲體中蟲草酸的提取與測(cè)定[J]. 食品工業(yè)科技，2012，33（1）：262-264，267.

[10]文 欣，劉素純，黃曉晗. 蟬花菌株的篩選及菌絲體成分分析[J]. 食品與機(jī)械，2013，29（3）：61-65.

[11]董鈺明，劉 暉，張 軍，等. 比色法測(cè)定復(fù)方蟲草顆粒中甘露醇的含量[J]. 中草藥，2001，32（8）：697-699.任 凱，陳 通，陸道禮，等. 基于微型可見(jiàn)光譜儀的茶湯色差的研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（2）：201-206.