五月齡翹嘴紅鲌性腺組織小RNA轉錄譜的分析比較

曹訪　劉莉　采克俊　吳成龍　周俊波

摘要：采用轉錄組高通量測序方法，比較分析幼齡翹嘴紅鲌精巢、卵巢組織中小RNA轉錄譜。結果顯示，精巢、卵巢的小RNA分布的峰值分別為28、29 nt，與一般物種的22～24 nt有較大的差異;在小RNA庫中，經(jīng)比對注釋的比例很低，分別為2.5%、2.1%。在比對注釋的斑馬魚miRBase、斑馬魚ncRNA、piRNA、Rfam數(shù)據(jù)庫中，精巢組織中被miRBase數(shù)據(jù)庫注釋的比例最高，為1.49%;而卵巢組織中被miRBase和piRNA數(shù)據(jù)庫注釋的比例接近，分別為094%和0.96%。比較表達量相對較高的共有miRNA分子，均是與胚胎發(fā)育相關的分子，且大多是精巢組織的表達量高于卵巢組織，這些miRNA分子在個體發(fā)育中可能具有重要意義。初步獲得了翹嘴紅鲌不同性腺組織的轉錄譜，為今后進一步分析小RNA在生殖發(fā)育中的調控作用奠定了基礎。

關鍵詞：翹嘴紅鲌;精巢;卵巢;miRNA;轉錄譜;分析;比較

中圖分類號： S917.4

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）02-0077-06

收稿日期：2018-10-17

作者簡介：曹 訪（1980—），男，江蘇豐縣人，碩士，高級實驗師，研究方向為動物遺傳育種與繁殖。E-mail：hzyzucf@hotmail.com。

生物體內的小分子非編碼RNA通過轉錄和轉錄后調節(jié)形成遺傳信息的表達調控網(wǎng)絡，在細胞的分裂分化、個體生長發(fā)育和繁殖等生命活動過程中具有重要的作用。已發(fā)現(xiàn)的這類小RNA包括siRNA（small interfering RNA）、miRNA（microRNA）、hsRNA（heterochromatin associated small RNA）和piRNA（piwi interacting RNA）等。發(fā)掘新的小分子非編碼RNA、研究其生物學功能及作用機制在生命科學研究中具有重要意義，目前研究較多的是miRNA。魚類的miRNA也已在斑馬魚、紅鰭東方鲀等幾個模式種以及非模式魚類的虹鱒魚中被發(fā)現(xiàn)報道[1-2]。

miRNAs是一類非編碼、長度約22 nt的小RNA分子，由60～80 nt的莖環(huán)前體分子衍生而來，廣泛存在于動物、植物甚至病毒中。miRNAs通過調節(jié)靶標mRNAs的穩(wěn)定性和翻譯效率，在基因的表達中起著非常重要的作用，影響著各個生理過程，包括代謝、細胞凋亡、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、免疫防御、腫瘤病理過程等。自從1993年首次在秀麗線蟲中發(fā)現(xiàn)miRNA（lin-4）以來[3]，有大量關于miRNAs的生物合成、功能和作用機制的研究[4-6]。盡管miRNAs的作用早已發(fā)現(xiàn)，但有關miRNA轉錄組的研究最近幾年才開始。過去主要是通過直接克隆、測序、northern blot雜交分析等鑒定逐個對miRNAs鑒定。但這一方法對于含量較低的、表達水平變化幅度大的、瞬時表達的、與不同發(fā)育階段相關的miRNAs的分析具有很大的局限性。這也解釋了小規(guī)模測序主要揭示保守miRNAs分子，而對于低水平的非保守miRNAs卻難以分析，高通量測序方法使非保守的、弱表達的、種特異性的miRNAs的分析成為可能。piRNAs是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類非編碼小RNA，具有組織特異性，調控著生殖細胞和干細胞的生長發(fā)育，對物種的遺傳和維持至關重要，已在人、果蠅、斑馬魚等動物的生殖細胞中發(fā)現(xiàn)了這類小分子[7-9]。

現(xiàn)有的魚類生殖發(fā)育研究主要集中在斑馬魚、青鳉魚等模式物種上，而養(yǎng)殖魚類相關研究甚少，其原因與相關遺傳背景是否清楚有關。但魚類屬低等脊椎動物，物種差異大，其生殖發(fā)育復雜多樣，對模式生物的研究成果難以套用到養(yǎng)殖品種中。我國作為水產(chǎn)大國，很多研究者已經(jīng)認識到這一點。翹嘴紅鲌（Erythroculter ilishaeformis）是一種鯉科淡水魚類，分布較為廣泛，俗稱白魚，長江下游俗稱“太湖白魚”，是“太湖三白”之一。其肉質細嫩、營養(yǎng)豐富，是魚中上品，市場價格較高。天然水域的生產(chǎn)量已很低，野生資源日益減少。目前已建立了翹嘴紅鲌的人工繁殖技術和大規(guī)模的人工養(yǎng)殖技術。筆者前期的初步研究發(fā)現(xiàn)，雌性翹嘴紅鲌的卵巢發(fā)育較雄性精巢發(fā)育早，其生長也較早。針對這一名優(yōu)特色魚種開展生殖細胞的基礎生物學研究，對于品種進一步的開發(fā)利用及保護天然翹嘴紅鲌的野生資源等都有重要的意義。本研究選取幼齡翹嘴紅鲌的性腺開展了小RNA轉錄組的分析比較，為今后進一步開展生殖細胞發(fā)育及性別調控研究等奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 組織收集與總RNA制備

分別取5月齡的3尾雌性及3尾雄性翹嘴紅鲌的性腺組織各1 g，迅速在液氮中速凍。研磨后，分別將3尾雌魚和3尾雄魚的組織樣品混合，用TRIzol reagent（Life Technologies公司）試劑提取總RNA。提取的RNA經(jīng)紫外分光光度計、1%瓊脂糖電泳和Agilent BioAnalyzer 2100進行質檢（安捷倫科技有限公司）。

1.2 小RNA文庫的建立

采用miRNA提取試劑盒mirVanaTM miRNA isolation kit（Ca#t.AM1560 Austin TX，Thermo Fisher，US）從上述提取的總RNA中富集小RNA。之后，先在小RNA的5′和3′末端添加1對接頭序列，再用于接頭互補的序列作為引物進行RT-PCR。擴增的cDNA經(jīng)6% PAGE膠純化后，使用Qubit 2.0 Fluorometer檢測濃度，Agilent2100檢測文庫的大小。由測序儀Illumina Genome Analyzer GA-IIX（Illumina公司）進行高通量測序。測序質量要求每向堿基質量大于20（Q20）的比例不小于85%。

1.3 生物信息學分析

原始的測序數(shù)據(jù)以去除低質量讀長以及將含接頭序列且大于18 nt序列為可用的讀長作為數(shù)據(jù)過濾的依據(jù)，所用軟件為CLC genomic workbench（商業(yè)軟件版本號5.5）。經(jīng)過濾的small RNA序列與公共數(shù)據(jù)庫比對去除rRNA、tRNA、small nuclear RNA（snRNA）and small nucleolar RNA（snoRNA），余下的序列再與miRBase、ncRNA、piRNA、Rfam等數(shù)據(jù)庫進行比對分析。此外，應用sRNA Toolkit軟件包里的miRCat工具來預測novel miRNA;應用miRanda軟件對miRNA序列以及所測序物種的cDNA序列進行可能的靶位點預測;用DEGseq R語言包結合perl腳本將樣品的表達量進行比較分析。

2 結果與分析

2.1 總RNA制備與小RNA文庫的質量評價

提取精巢和卵巢混合樣品的總RNA的D260 nm/D280 nm分別為2.05和2.02，表明其純度較好。但同樣組織量精巢樣品提取的總RNA量明顯低于卵巢的總RNA提取量，且5S的量較高。推測這可能與雌魚較雄魚發(fā)育快有關。此外，Agilent BioAnalyzer 2100質檢結果中RIN值大于8，也表明提取質量合格。

構建的小RNA文庫經(jīng)Qubit 2.0 Fluorometer檢測，精巢、卵巢的小RNA的cDNA文庫濃度分別為32.6、10.6 ng/μL，主峰長度分別為148、149 bp（圖1）。單端測序，讀長50 nt，測序所用Flow cell為Illumina Single Read Flow cell V4，測序結果顯示精巢和卵巢的Q20值的百分比分別為97.4%和976%，表明測序數(shù)據(jù)可用于后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。

2.2 數(shù)據(jù)預處理與長度分布統(tǒng)計

本研究采用Illumina/Solexa深度測序技術對幼齡翹嘴紅鲌的精巢和卵巢的小RNA庫進行了測定。應用 CLC genomics_workbench 5.5軟件對測定的數(shù)

據(jù)進行預處理，主要是棄去僅含接頭序列、低質量序列、長度小于15 nt和大于33 nt的序列等。此外，還須排除已知的mRNA，rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA和重復序列元件。測定的精巢小RNA原始讀長（reads）為24 752 792個，可用于后續(xù)分析的高質量有效讀長20 167 240個，占81.47%;卵巢小RNA的原始讀長為 22 947 949 個，其中有效讀長為18 198 879個，占79.31%。精巢小RNA的序列大小分布的峰值在28 nt，卵巢小RNA的峰值在29 nt（圖2）。

2.3 比對注釋，鑒定已知miRNA

上述處理后的序列與最新Sanger miRBase數(shù)據(jù)庫比對，比對過程不允許有錯配。另外還與其他非編碼數(shù)據(jù)庫ncRNA、piRNA、Rfam數(shù)據(jù)庫比對，允許與目標序列有2個堿基錯配、允許比目標序列兩端各縮短或延長2個堿基。比對結果（圖3）表明，精巢的有效讀長序列中，被注釋的讀長有502 823個，占2.5%，其中與斑馬魚miRBase、斑馬魚ncRNA、piRNA、Rfam數(shù)據(jù)庫比對注釋的讀長所占比例分別為 1.49%、0.87%、0.09%、0.05%;而卵巢組織中被注釋的讀長有374 895個，占2.1%，被上述數(shù)據(jù)庫注釋的比例分別為0.94%、0.10%、0.96%、0.07%。

用DEGseq R語言包結合perl腳本將精巢和卵巢樣品的表達量進行鑒定和比較分析。2個樣品的小RNA中，有219個miRNA與斑馬魚miRBase已知miRNA相同，但其表達量有差異。其中有9個miRNA在精巢組織中可找到，在卵巢中沒有找到;有4個在卵巢中有而在精巢中沒有，但這13個miRNA的表達豐度都極低。在已知miRNA中，較高表達豐度的miRNA分子在精巢中的表達絕大部分都高于卵巢（圖4）。

2.4 新microRNA分子的預測

應用sRNA Toolkit軟件包中的miRCat工具來預測novel miRNA。microRNA前體的標志性發(fā)卡結構能夠用來預測新的microRNA。將沒有注釋的讀長（樣品名_unannotated.csv）比對到斑馬魚基因組后，通過折疊模型分析，若有序列位于莖環(huán)結構上，則初步判定該序列為1個候選的新microRNA。按上述方法在精巢組織中預測到76個新microRNA，卵巢組織中預測到77個，其中50個相同。預測新microRNA序列，見表1。在這些預測的新microRNA分子中，僅在精巢和卵巢共有序列中有4個序列具有對應的miRNA*序列，分別是第1、第2、第30號序列，它們對應的miRNA*序列分別為：AUGAAGGUCAAUGGUUAvCCvAGU（dre-miR-7146-3p）、GAUCAUUUUUGUGAUUAUGCAGCU（dre-miR-153c-3p）、UCACAGUGAACCGGUCUCUUUU（dre-miR-128-3p）。

3 討論

魚類養(yǎng)殖中所涉及的苗種繁育、性別控制等問題與魚類生殖細胞的發(fā)育分化密切相關。此外，魚類屬低等脊椎動物，其生殖發(fā)育較高等脊椎動物具有更豐富的多樣性。結合現(xiàn)代生命科學技術，弄清楚水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類的基礎生物學問題，是進行現(xiàn)代育種、建設現(xiàn)代漁業(yè)的重要環(huán)節(jié)。本研究就具有地方特色的名優(yōu)水產(chǎn)養(yǎng)殖品種翹嘴紅鲌的性腺小RNA轉錄譜進行了初步的分析。筆者在研究中發(fā)現(xiàn)，盡管筆者所用材料均為5月齡翹嘴紅鲌性腺，但通過組織切片觀察其性腺發(fā)育階段明顯不同。該階段精巢組織中還未見游離精子，而卵巢組織中已見游離的卵子;提取總RNA時也發(fā)現(xiàn)，卵巢組織總RNA中5S RNA的含量很高。目前，已有翹嘴紅鲌全雌育種技術的應用，主要是利用雌性生長較雄性快的特點，從其性腺的發(fā)育來看，也是雌性發(fā)育較雄性早。

從獲得的小RNA數(shù)據(jù)與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫比對結果來看，可注釋的序列比例非常低，97%以上的序列無法注釋，這一方面反映了魚類基因組信息的多樣性，另一方面也提示模式生物的遺傳信息對于魚類基因組、轉錄組等研究具有較大的局限性。在小RNA序列分布中，發(fā)現(xiàn)其峰值在28～29 nt，這一值較其他物種明顯偏高。已報道的其他物種小RNA大小分布的峰值一般在22～24 nt，也有報道在 26 nt[10]。仔細校驗測序過程，證實其樣品制備及測序質控均符合要求，說明該結果與物種有關。但是否因其特殊的發(fā)育階段導致，還須與其他發(fā)育階段的小RNA轉錄組比較。

在被注釋的已知miRNA中，miR-181a-5p、mir-143-1、mir-92a-1、mir-26a-1、miR-146a、mir-10b-1、mir-22a、mir-21-1、mir-10c、let-7a-1等這些表達量較高的miRNA分子，均與斑馬魚的個體發(fā)育密切相關[11-12]。此外，在小RNA轉錄譜已比對注釋的分子中，精巢miRNAs所占比例最高，為1.49%，而卵巢中已注釋的miRNAs和piRNAs所占比例接近，分別為0.94%和0.96%，這可能也與同一年齡的精巢和卵巢組織實際上是處于不同的發(fā)育階段有關，其中miRNAs和piRNAs的消長規(guī)律值得進一步探討。

4 結論

本研究采用轉錄組高通量測序方法，比較分析了幼齡翹嘴紅鲌精巢和卵巢組織中小RNA轉錄譜，由于沒有翹嘴紅鲌基因組信息，新miRNA的預測只能以斑馬魚基因組信息為基礎展開。結果顯示，部分預測的同一個新miRNA分子位于不同的染色體上，由此推測這些成熟的miRNA分子在翹嘴紅鲌的基因組中也可能對不同的基因起到調控作用。下一步，筆者可繼續(xù)比較分析其他不同發(fā)育階段性腺小RNA轉錄譜，可能找出性別調控的關鍵miRNAs或piRNAs。

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