基于高通量測序技術分析2種菌草根際土壤真菌群落多樣性

葉文雨 謝序澤 許鈺瀅 倪明月 胡紅莉 余文英 Norvienyeku Justice 魯國東

摘? 要：為了解福州菌草基地巨菌草和綠洲一號2種菌草的根際土壤真菌群落多樣性，采用Illumina Miseq高通量測序技術和生物信息學方法，對菌草根際土真菌的多樣性及群落結構進行分析。結果表明：從3份土壤樣本中獲得525 292條ITS序列，在97%序列相似性基礎上可劃分為7267個可操作分類單元（OTU）。真菌群落的豐富度指數(shù)（ACE）以菌草非根際土最低，綠洲一號根際土略高于巨菌草根際土;而多樣性指數(shù)（Shannon-Wiener和Simpson）菌草根際土高于非根際土，綠洲一號根際土略高于巨菌草根際土。3份樣品的優(yōu)勢菌門為子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、接合菌門（Zygomycota）、壺菌門（Chytridiomycota）、球囊菌門（Glomeromycota）;優(yōu)勢菌綱為散囊菌綱（Eurotiomycetes）、糞殼菌綱（ Sordariomycetes）、座囊菌綱（Dothideomycetes）、傘菌綱（Agaricomycetes）、錘舌菌綱（Leotiomycetes）、圓盤菌綱（Orbiliomycetes）、銀耳綱（Tremellomycetes）、粘膜菌綱（Wallemiomycetes）;優(yōu)勢菌屬為籃狀菌屬（Talaromyces）、深黃傘形霉屬（Umbelopsis）、枝孢菌屬（Cladosporium）、暗雙孢菌屬（Cordana）、鐮刀菌屬（Fusarium）、隱球菌屬（Cryptococcus）、淡紫紫霉屬（Purpureocillium）、赤霉菌屬 （Gibberella）、靈芝屬（Ganoderma）。研究結果表明，菌草根際土真菌群落多樣性高于非根際土，為進一步更好地利用菌草提供理論參考依據(jù)。

關鍵詞：菌草;根際土壤;真菌群落多樣性;高通量測序

中圖分類號： Q938? ? ? 文獻標識碼：A

High-throughput Sequencing Analysis of Fungal Community in Rhizosphere Soils of Two Plants for Mushroon Cultivation （JUNCAO）

YE Wenyu1，2， XIE Xuze2， XU Yuying2， NI Mingyue3， HU Hongli3， YU Wenying 2， Norvienyeku Justice2，

LU Guodong1，3*

1. China National Engineering Research Center of JUNCAO Technology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China ; 2. College of Life Sciences， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China; 3. College of Plant Protection， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract： High-throughput sequencing and bioinformatics analysis were used to analyze the composition of fungal communities in the rhizosphere and non-rhizosphere soils from the plants for mushroom cultivation. A total of 525 292 fungal ITS sequences from the samples were obtained. 7267 OTU （operational taxonomic units） could be grouped based on 97% sequence similarity as the threshold. The ACE of the fungal community was the lowest in the non-rhizosphere soil， and the rhizosphere soil of Lvzhou No. 1 was slightly higher than that in the rhizosphere soil of the plants for mushroom cultivation. The Shannon-wiener and Simpson values obtained for rhizosphere soils were higher than the values recorded from non-rhizosphere soils. Also， the Shannon-wiener and Simpson values for Lvzhou No. 1 rhizosphere soil was slightly higher compared to the values obtained for the rhizosphere soil of the plants for mushroom cultivation. This study further revealed Ascomycota， Basidiomycota， Zygomycota， Chytridiomycota， and Glomeromycota as the pre-dominant phylum present in all the rhizosphere soil samples. From class level analysis， we identified eight pre-dominant classes in all soil samples， including Eurotiomycetes， Sordariomycetes， Agaricomycetes， Leotiomycetes， Orbiliomycetes， Tremellomycetes， Dothideomycetes， and Wallemiomycetes. Nine pre-dominant genuses， including Talaromyces， Umbelopsis， Cladosporium， Cordana， Fusarium， Cryptococcus， Purpureocillium， Gibberella， and Ganoderma in all the soil samples were revealed. The results would provide insights into the prevailing upsurge in diversity in the rhizosphere fungi community compared to the non-rhizosphere soil and would serve as a reference for the characterization of rhizosphere fungi.

Keywords： plants for mushroom cultivation （JUNCAO）; rhizosphere soil; diversity of fungal communities; high- throughput sequencing

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.03.019

近年來，高通量測序技術[1-3]已成為分析土壤根際微生物多樣性研究的方法之一[4-5]。巨菌草（Pennisetum giganteum）和綠洲一號（Arundo donax cv.Lvzhou No.1）均為禾本科（Gramineae）年生草本植物，國內（河南、內蒙古、西藏、陜西、青海、甘肅等地區(qū)）、國外（盧旺達、斐濟、萊索托和南非等國）均有分布[6]。這2種菌草不僅可作為食用菌、藥用菌的培養(yǎng)基[7]，還可作為動物飼料[8-9]、生物能源物質[10-11]及具有生態(tài)治理作用[12-16]。隨著人們生活質量的提高、生態(tài)環(huán)境的改善及畜牧業(yè)的發(fā)展，迫切需要開展提高菌草產(chǎn)量和質量等方面的研究。

植物與根際土壤微生物的關系十分密切，根際土壤微生物種類和數(shù)量對植物營養(yǎng)養(yǎng)分循環(huán)[17]過程具有重要意義。根際土壤微生物影響植物根系的發(fā)育、促進植物的生長及抑制或減輕植物病害的發(fā)生等起一定的作用[18-20]，其多樣性及其生態(tài)功能成為目前國內外的研究熱點[21-22]。真菌是土壤微生物的主要組成部分之一，對植物的生長發(fā)育等方面有著重要的生物學功能，如防治植物病害[23-24]、促進植株生長[25]和增強植物抗逆性[26]等。國內外學者對植物根際土真菌群落多樣性等方面進行了研究，常見的根際土真菌屬有鐮刀菌屬（Fusarium）、青霉屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）等[27];從白菜軟腐病根部土壤分離出草莖點霉（Phoma herbarum F217-1）能拮抗細菌性軟腐病[28]。

菌草作為具有廣泛用途植物之一，其根際土壤真菌多樣性的相關研究尚未見報道。為探討同一生長條件下不同菌草根際土壤微生物群落多樣性，以福建農(nóng)林大學菌草基地的巨菌草和綠洲一號根際土壤為研究對象，采用Illumina Miseq高通量測序技術對真菌ITS3-ITS4區(qū)片段進行測序并進行生物信息學分析，從分子水平上揭示巨菌草和綠洲一號根際土壤真菌群落的多樣性，以期為深入研究巨菌草和綠洲一號根際土壤真菌潛在的生態(tài)功能研究提供一定的理論參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

樣品采自福建農(nóng)林大學菌草試驗基地根際土壤。采集時隨機選取巨菌草和綠洲一號植株各5株，抖落根系外圍土壤，收取附著于根系表面的土壤做為根際土，并同時采取其同一地塊的巨菌草和綠洲一號共同對照非根際土壤。帶回實驗室立即放入80℃冰箱內備用。

1.2? 方法

1.2.1? 樣品的采集? 本研究將采自福建農(nóng)林大學菌草基地菌草根系表面0～5 cm范圍內10～20 cm土層的土壤視為根際土壤，而非根際土壤樣品為距離菌草根系表面10～15 cm范圍內10～20 cm土層的土壤。隨機選取3個樣點，多點采集的根際土和非根際土分別充分混合后，置于無菌自封袋中。將土壤樣本帶回實驗室，置于?80 ℃冰箱中保存，備用。

1.2.2? 土壤總DNA的提取? 土壤DNA提取采用試劑盒（Fast DNA Spin Kit for Soil）（MP Biomedicals，USA），具體步驟參照提取說明書[29]。用1%的瓊脂糖凝膠電泳（0.5×TAE）檢測DNA的質量，質量合格的DNA于?20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3? 土壤真菌ITS序列的PCR擴增及高通量測序? 以稀釋后的土壤DNA為模板，采用真菌通用引物ITS3-2024F（5-GCATCGATG AAGA AC G CA GC-3）和ITS4-2409R（5-TCCTCCGCTTA T T G A TATGC-3）PCR擴增真菌ITS3-ITS4區(qū)域。PCR總反應體系為30 μL（Phusion Master Mix（2×）15 μL、Primer（2 μmol/L）3 μL（6 μmol/L）、DNA模板10 μL（5～10 ng）、H2O 2 μL）。反應程序：98 ℃預變性1 min;30 個循環(huán)包括（98 ℃，10 s;50 ℃，30 s;72 ℃，30 s）;72 ℃，5 min，3次重復。將同一樣品PCR 產(chǎn)物混合后經(jīng)電泳檢測、割膠純化、濃度檢測等操作后，將樣品送到諾禾致源生物有限公司，使用New England Biolabs 公司的NEB Next? Ultra? DNA Library Prep Kit for Illumina建庫試劑盒進行文庫的構建，構建好的文庫經(jīng)過Qubit 定量和文庫檢測，合格后，使用HiSeq進行上機測序。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

對測序得到的原始數(shù)據(jù)（raw data）使用FLASH [30]對每個樣品的reads進行拼接，得到的拼接序列為原始Tags數(shù)據(jù)（raw tags）;拼接得到的Raw Tags，需要經(jīng)過嚴格的過濾處理[31]得到高質量的Tags數(shù)據(jù)（clean tags）。然后用Qiime等[32]的Tags質量控制流程，經(jīng)過處理后得到的Tags需要進行去除嵌合體序列的處理，Tags序列通過（UCHIME algorithm）[33]與數(shù)據(jù)庫（unite database）進行比對，檢測嵌合體序列，并最終去除其中的嵌合體序列[34]，得到最終的有效數(shù)據(jù)（eff e ctive tags）。

利用Uparse軟件[35]對所有樣品的全部 Effective Tags進行聚類，默認以97%的一致性（identity）將序列聚類成為OTUs（operational taxonomic units），同時會選取OTUs的代表性序列進行物種注釋，用QIIME軟件中的blast方法[36] 與Unit數(shù)據(jù)庫[37]進行物種注釋分析，并分別在門（phylum）、綱（class）、屬（genus）分類水平統(tǒng)計各樣本的群落組成。使用MUSCLE[38]軟件進行快速多序列比對，得到所有OTUs代表序列的系統(tǒng)發(fā)生關系。最后以樣品中數(shù)據(jù)量最少的為標準對各樣品的數(shù)據(jù)進行均一化處理，后續(xù)的Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析都是基于均一化處理后的數(shù)據(jù)。

使用QIIME軟件計算Observed-species、Chao1、Shannon、Simpson、ACE、Goods-coverage，使用R軟件繪制稀釋曲線、Rank abundance曲線;使用R軟件繪制PCoA圖。

2? 結果與分析

2.1? 測序數(shù)據(jù)處理與分析

質量通過Illumina MiSeq高通量測序，9份土壤樣品質控后得到了 525 292條有效序列，經(jīng)過過濾和去除嵌合體之后得到了511 816條優(yōu)質序列，優(yōu)質序列的長度集中在200～450 bp之間，以97%相似度劃分，共得到7267個OTU。

2.2? Chao1指數(shù)稀釋曲線和Observed species指數(shù)稀釋曲線

Chao1指數(shù)稀釋曲線和Observed species指數(shù)稀釋曲線可以判斷樣品測序量是否足夠以及得知樣品中群落的豐富度。從Chao1指數(shù)稀釋曲線和Observed species指數(shù)稀釋曲線來看，3個樣品的稀釋曲線均基本趨于平緩，說明測序量已足夠覆蓋樣品中的所有物種（圖1A和圖1B）。在97%相似水平上計算各土壤樣品測序的覆蓋率，由表1可知，真菌文庫測序覆蓋率均在99%以上，說明取樣合理，土壤樣品間微生物文庫測序覆蓋率差異不顯著。因此，測序數(shù)據(jù)能夠真實地反映土壤樣品中的微生物群落。

2.3? 2種菌草土壤真菌群落結構變化

2.3.1? 門水平群落結構分析? 由圖2可知，巨菌草根際土壤真菌群落在門類水平上主要類群為子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌亞門（Basidio mycota）、接合菌門（Zygomycota）、壺菌門（Chy tridiomycota），相對豐度分別為59.51%、13.39%、1.26%、0.04%;綠洲一號根際土壤真菌群落在門類水平上主要類群為子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌亞門（Basidio mycota）、接合菌門（Zygom ycota）、壺菌門（Chytridiomycota），相對豐度分別為64.37%、20.91%、0.83%、0.29%;對照非根際土壤真菌群落在門類水平上主要類群為子囊菌門（Ascom yco ta）、擔子菌亞門（Basidiomycota）、接合菌門（Zygomycota）、壺菌門（Chytri diomyco ta），相對豐度分別為77.24%、7.02%、6.18%、0.05%。綜上所述，菌草根際土和非根際土在門水平上豐富度最高的是子囊菌門（Ascomycota）。

2.3.2? 綱水平群落結構分析? 由圖3可知，巨菌草根際土壤真菌群落在綱類水平上主要類群散囊菌綱（Eurotiomycetes）、座囊菌綱（Dothideo mycetes）、糞殼菌綱（Sordariomycetes）、傘菌綱（Agaricomycetes）、錘舌菌綱（Leotiomycetes）、銀耳綱（Tremellomycetes），其相對豐度分別為2.72 %、2.75%、19.80%、12.03%、0.76%、0.67%;綠洲一號根際土壤真菌群落在綱類水平上主要類群散囊菌綱（Eurotiomycetes）、座囊菌綱（Dot hideomycetes）、糞殼菌綱（Sordariomycetes）、傘菌綱（Agaricomycetes）、錘舌菌綱（Leotio m ycetes）、銀耳綱（Tremellomycetes），其相對豐度分別為9.51 %、15.51%、28.17%、16.97%、1.82%、2.61%;對照非根際土壤真菌群落在綱類水平上主要類群散囊菌綱（Eurotiomycetes）、座囊菌綱（Dothideomycetes）、糞殼菌綱（Sordario myce tes）、傘菌綱（Agaricomycetes）、錘舌菌綱（Leotio mycetes）、銀耳綱（Tremellomycetes），其相對豐度分別為55.44 %、4.67%、6.29%、2.10%、8.85%、3.95%。綜上所述，菌草根際土和非根際土在綱水平上豐富度最高的是糞殼菌綱（Sordariomy cetes）。

2.3.3? 屬水平群落結構分析? 由圖4可知，巨菌草根際土壤真菌群落在屬水平上主要類群為籃狀菌屬（Talaromyces）、深黃傘形霉屬（Umbelopsis）、枝孢菌屬（Cladosporium）、暗雙孢菌屬（Cordana）、鐮刀菌屬（Fusarium）、隱球菌屬（Cryptococcus）、淡紫紫霉屬（Purpureocillium）、 赤霉菌屬（Gibberella）、靈芝屬（Ganoderma），相對豐度分別為0.21%、0.62%、1.45%、1.21%、1.72%、0.38%、0.50%、0.10%、0.36%;綠洲一號根際土壤真菌群落在屬水平上主要類群為籃狀菌屬（Talaromyces）、深黃傘形霉屬（Umbelopsis）、枝孢菌屬（Cladosporium）、暗雙孢菌屬（Cor dana）、鐮刀菌屬（Fusarium）、隱球菌屬（Crypto coccus）、淡紫紫霉屬（Purpureocillium）、赤霉菌屬（Gibberella）、靈芝屬（Ganoderma），相對豐度分別為0.77%、1.10%、5.58%、2.68%、3.74%、2.50%、3.05%、0.03%、0.96%;非根際土壤真菌群落在屬水平上主要類群為籃狀菌屬（Talaro myces）、深黃傘形霉屬（Umbelopsis）、枝孢菌屬（Cladosporium）、暗雙孢菌屬（Cor da na）、鐮刀菌屬（Fusarium）、隱球菌屬（Crypto coc cus）、淡紫紫霉屬（Purpureocillium）、赤霉菌屬（Gibbe rella）、靈芝屬（Ganoderma），相對豐度分別為27.86%、5.20%、1.92%、0.16%、0.83%、3.73%、0.29%、0.23%、0.17%。綜上所述，巨菌草根際土壤真菌群落在屬水平上豐富度最高的類群為鐮刀菌屬（Fusarium），綠洲一號根際土壤真菌群落在屬水平上豐富度最高的類群為枝孢菌屬（Cladosporium），而非根際土壤真菌群落在屬水平上豐富度最高的類群為籃狀菌屬（Ta la ro myces）。

2.4? 2種菌草真菌群落豐度和多樣性分析

Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)用于反映土壤樣品中微生物的多樣性。由表1可知，與對照組相比，巨菌草和綠洲一號土壤真菌Shannon指數(shù)顯著高于非根際土壤，Simpson指數(shù)顯著低于非根際土壤;綠洲一號土壤樣本的Shannon-Wiener指數(shù)高于巨菌草根際土壤，為6.6507，而Simpson指數(shù)低于巨菌草根際土壤，為0.0323?？梢?，巨菌草和綠洲一號根際土壤樣本中土壤的真菌種群多樣性高于非根際土壤。綠洲一號根際土壤樣本

的真菌群落多樣性略高于巨菌草根際土壤樣本。

ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)反映群落物種豐富度。由表1可知，與對照組相比，巨菌草和綠洲一號根際土壤真菌ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)均比非根際土壤高，差異顯著;綠洲一號根際土壤真菌ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)均比比巨菌草根際土高，差異顯著。結果表明，巨菌草和綠洲一號根際土壤樣本中土壤的真菌豐度高于非根際土，綠洲一號根際土壤真菌豐富度高于巨菌草根際土。

2.5? 2種菌草真菌群落的相關性分析

圖5為巨菌草和綠洲一號根際土壤微生物的OTU韋恩圖。由圖5可知，對照、巨菌草及綠洲一號土壤樣本中分別檢測到真菌963、1261和1056個OTU，其中共有的OTU為597個，特有的OTU依次為191、112和288個，占對照、巨菌草及綠洲一號土壤樣本中總OTU的8.09%、11.63%和22.84%。

2.6? 基于OTUs的主坐標分析及樣品間的NMDS分析

為了解不同菌草根際土壤微生物群落組成，對樣本的土壤真菌群落進行主坐標分析（PCoA）。不同樣本表現(xiàn)出分散或聚集的分布情況，結果如圖6所示。圖6A中綠洲一號與PC2軸相距均較近而與PC1相對較遠，說明綠洲一號中真菌菌群結構受主成分PC2的影響大，PC2一種主成分對

樣品中菌群結構的影響達到總影響因子的24.8%;巨菌草與PC1和PC2軸相距均較近，說明巨菌草中真菌菌群結構受主成分PC1和PC2的影響均大，PC1和PC2兩種主成分對樣品中菌群結構的影響分別達到總影響因子的58.91%和24.8%;對照與PC2軸相距較遠，說明FSCK樣品中真菌菌群結構受主成分PC2的影響不大。通過主坐標分析可見，真菌群落PC1和PC2可分別解釋59.81%和24.8%差異性。綠洲一號、巨菌草及對照沒有聚在一起，說明微生物群落差異大。

無度量多維標定法（Non-Metric Multi-Dimen sional Scaling， NMDS）統(tǒng)計是一種適用于生態(tài)學研究的排序方法。NMDS是非線性模型，其設計目的是為克服線性模型（包括PCA、 PCoA）的缺點，更好地反映生態(tài)學數(shù)據(jù)的非線性結構。應用NMDS分析，根據(jù)樣本中包含的物種信息，以點的形式反映在多維空間上，而對不同樣本間的差異程度，則是通過點與點間的距離體現(xiàn)，能夠反映樣本的組間和組內差異等。由（圖6B）可知，3份樣品中，代表綠洲一號（FSLV）的3個樣品距離其他樣品較遠，表明該樣品的真菌群落結構存在彼此之間差異較大。

3? 討論

巨菌草和綠洲一號是具有廣泛作用的代表性菌草，在水土保持、荒漠化治理及提高落后國家人民的生活水平等方面具有重要的作用。植物根際土壤微生物參與土壤養(yǎng)分的轉化和循環(huán)，可提高土壤肥力[39]。土壤微生物的種類和數(shù)量影響土壤養(yǎng)分的效能，進一步影響植物的生長。土壤健康的指標之一就是土壤微生物群落的組成及其多樣性。

目前菌草根際土微生物多樣性的研究還未見報導。菌草試驗點選擇在同一地點、管理一致的不同菌草，因此，巨菌草和綠洲一號根際真菌群落多樣性的差異主要反映了不同菌草所產(chǎn)生的根際效應。高通量測序技術作為一種簡單、快速、準確的免培養(yǎng)分子生物學技術，為認識土壤微生物多樣性、群落結構組成及其生態(tài)功能提供有利手段[40]。本研究利用高通量測序技術分析了福州菌草基地的巨菌草和綠洲一號的根際土壤與非根際土壤真菌種群結構的多樣性，為菌草根際微生物的研究奠定基礎。菌草根際土壤樣本的ACE和Shannon-iener指數(shù)值均大于非根際土壤樣本，表明根際土壤真菌群落在豐富度和多樣性上均高于其非根際土壤。綠洲一號根際土壤樣本的ACE和Shannon- iener指數(shù)值大于巨菌草根際土壤樣本，表明綠洲一號根際土壤真菌群落在豐富度和多樣性上均高于巨菌草根際土壤。從門水平來看，3個樣品的優(yōu)勢門為子囊菌門（Ascomycota），與一些學者的研究結果一致[41-44]。其說明子囊菌門（Asco my ota）真菌適應性廣泛，在不同的土壤條件下都有分布。在屬水平上，籃狀菌屬（Talaro myces）、深黃傘形霉屬（Umbelopsis）、枝孢菌屬（Clado s porium）、暗雙孢菌屬（Cordana）、鐮刀菌屬（Fusarium）、隱球菌屬（Cryptococcus）、淡紫紫霉屬（Purpureo illium）、赤霉菌屬（Gibbe rella）、靈芝屬（Ganoderma）是所有樣品土壤真菌Top10 屬中的共有屬。姜華等[45]研究表明，蘆葦根際土壤真菌的優(yōu)勢屬有鏈格孢屬（Altern aria）、青霉屬（Penicillium）、擬青霉屬（Paecilo myces）、木霉屬（Trichoderma）和鏈格孢屬（Alte rnaria）。這說明不同植物根際土壤優(yōu)勢真菌在屬水平上是不同的[45]。

本研究結果表明，巨菌草和綠洲一號根際土真菌群落多樣性與豐富度均高于非根際土。綠洲一號根際土真菌群落多樣性與豐富度略高于巨菌草根際土真菌群落多樣性與豐富度。

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