殺菌劑對芒果細菌性角斑病菌的室內(nèi)毒力及田間防效

占禮鋼 葉火春 張靜 閆超 李曉宇 馮崗

摘? 要：細菌性角斑病是芒果生產(chǎn)上的重要病害，為篩選有效的防治藥劑，采用渾濁度法對22種殺菌劑進行室內(nèi)抑菌活性初篩，對抑菌活性較好的藥劑采用平板菌落計數(shù)法進行室內(nèi)毒力及田間藥效試驗。室內(nèi)抑菌活性表明，四霉素、辛菌胺醋酸鹽、溴菌腈、乙蒜素和噻霉酮抑菌作用最強，2 mg/L處理濃度下抑菌率均達90%以上，其次為丙硫唑和中生菌素，10 mg/L處理下抑菌率在75%以上;溴菌腈、噻霉酮、丙硫唑、春雷霉素和噻森銅的EC50值分別為0.048、0.103、0.900、21.970、189.347 mg/L。田間試驗顯示，施藥后30 d，20%噻唑鋅SC750倍防效最高，可達75%以上;其次為3%噻霉酮ME1000倍、20%丙硫唑SC1000倍和25%溴菌腈EC1000倍，防效均在70%以上;46%氫氧化銅WG保護作用最高，防治后病葉率最低。據(jù)此，氫氧化銅、噻唑鋅、噻霉酮、丙硫唑和溴菌腈可作為防治芒果細菌性角斑病的供選藥劑。

關(guān)鍵詞：芒果細菌性角斑病;殺菌劑;抑菌活性;田間防效

中圖分類號：S436.6;S482.2? ? ? 文獻標識碼：A

Assessment of Fungicides for in vitro and in vivo Activity Against Xanthomanas campestris pv. mangiferaeindicae

ZHAN Ligang1， YE Huochun2， ZHANG Jing2，3， YAN Chao2， LI Xiaoyu1， FENG Gang2，3*

1. School of Life and Pharmaceutical Science， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China; 3. Key Laboratory of Pests Comprehensive Governance for Tropical Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Haikou， Hainan 570100， China.

Abstract： Mango bacterial black spot （MBBS） caused by Xanthomonas campestris pv. manganiferaeindicae （Xcm） is a risk plant disease in mango orchards. In order to screen an effective fungicide for controlling MBBS， the bacteriostatic activity of 22 fungicides against MBBS were assessed by th turbidimeter test in the laboratory， and the toxicity of the fungicides with good antibacterial activity was tested by the method of plate culture count and the control efficacy were carried out in the field. Laboratory bioassay results showed that the inhibitory effect of tetramycin， octylamine acetate， bromothalonil and benziothiazolinone was strong， with an inhibitory rate 90% treated with 2 mg/L， followed by pothioconazole and zhongsengmycin with an inhibitory rates up to 75% at 10 mg/L. Except for oxine-copper， the bacteriostatic activity of copper fungicides was relatively low. The toxicity of bromothalonil， benziothiazolinone， pothioconazole， kasugamycin and saisentong to Xcm was calculated， with EC50 of 0.048， 0.103， 0.900， 21.970 and 189.347 mg/L， respectively. At 30 days after treatment， the result of the field trial indicated that 20% zinc-thiazole SC 750 times solution （TS） had the highest control efficacy on the disease and its control effect reached 75%， followed by 3% benziothiazolinone ME， 20% pothioconazole SC and 25% bromothalonil EC reached above 70% control efficacy at 1000 TS. Beyond that， 46% copper hydroxide WG showed a better protective effect than other fungicides with lowest diseased leaf rate after treatment. Accordingly， copper hydroxide， zinc-thiazole， benziothiazolinone， pothioconazole and bromothalonil could be used as the chemicals for controlling mango bacterial black spot.

Keywords： mango bacterial black spot; fungicides; antibacterial activity; control effect in vitro

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.03.016

芒果細菌性角斑?。╩ango bacterial black spot， MBBS）又稱芒果細菌性黑斑病、細菌性潰瘍病等，是芒果生產(chǎn)上重要病害之一，可引起芒果葉斑、枝條壞死、落果和果實采后腐爛，嚴重時造成的損失達50%以上[1-2]。芒果細菌性角斑病具有潛伏性和爆發(fā)性[3]。一般臺風雨過后是該病高發(fā)期，嚴重威脅我國海南、廣西、廣東、福建等地區(qū)芒果產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展[4-5]。使用化學藥劑是防治芒果細菌性角斑病主要方法之一。銅制劑和農(nóng)用抗生素類殺菌劑常用于細菌性病害防治。楊葉等[6]對芒果細菌性角斑病菌進行室內(nèi)藥劑篩選，獲得農(nóng)用鏈霉素、代森錳鋅、福美鋅等抑菌活性好。蒲金基等[7]室內(nèi)篩選農(nóng)用鏈霉素和其他抗生素復配藥劑，對芒果細菌角斑病菌抑菌活性進行研究。然而，為降低醫(yī)用抗生素在農(nóng)業(yè)使使用中可能引起的安全風險，農(nóng)用鏈霉素現(xiàn)已停止登記使用[8]。另一方面，銅制劑過多使用，尤其是無機銅殺菌劑，易凸顯環(huán)境污染、植物藥害、金屬資源消耗等問題[9-10]。因此，生產(chǎn)上防治芒果細菌性角斑病亟需高效、低風險藥劑。目前生產(chǎn)上出現(xiàn)不少替代農(nóng)用鏈霉素防治細菌病害藥劑。這些藥劑對芒果細菌性角斑病防治效果如何鮮有報道。為此，本研究收集當前防治細菌性病害22種殺菌劑，在室內(nèi)和田間對芒果細菌性角斑病進行藥劑篩選，研究結(jié)果將為該病的有效防控提供技術(shù)支撐。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 供試菌株? 芒果細菌性角斑病病原菌（Xanthomanas campestris pv. mangiferaeindicae，Xcm）由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院南亞熱帶作物研究所熱帶園藝產(chǎn)品采后保鮮研究室饋贈，于20%甘油中，?80 ℃保存;28 ℃條件下，在NA培養(yǎng)基復活供試。

1.1.2? 培養(yǎng)基? NB培養(yǎng)基：牛肉浸膏3 g、酵母浸膏1 g、蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、去離子水1 L、pH 6.8～7.0。NB培養(yǎng)基加入1.5%瓊脂粉即為固體培養(yǎng)基NA，分裝后于121 ℃滅菌20 min備用。

1.1.3? 供試藥劑? 供試殺菌劑的名稱及生產(chǎn)廠家如表1所示。

1.2? 方法

1.2.1? 室內(nèi)抑菌初篩? 采用渾濁度法參考NY/T 1156.16-2008試驗準則[11]，對各供試藥劑進行快速篩選。將各供試藥劑用NB培養(yǎng)基配制成100、10、2 mg/L的含藥培養(yǎng)基，吸取195 μL含藥培養(yǎng)基至96孔板微孔中，加入5 μL的Xcm菌懸液，以未加藥劑的NB培養(yǎng)基為對照，各處理設置未接菌液的微孔為背景對照，每個處理重復3次，于28 ℃震蕩條件下培養(yǎng)24 h，采用酶標儀檢測處理培養(yǎng)液光吸光值OD630，根據(jù)各處理光吸收增加值計算抑菌率。

光吸收增加值ΔOD=處理OD630背景對照OD630

式中，P為抑菌率，A0為對照OD值增加值，A1為OD值增加值。

1.2.2? 室內(nèi)毒力試驗? 采用平板菌落計數(shù)法[12]，在預試驗的基礎(chǔ)上，將室內(nèi)抑菌活性較高的3%噻霉酮ME、25%溴菌腈EC、20%丙硫唑SC、4%春雷霉素AS和20%噻森銅SC用滅菌水稀釋成系列濃度，與融化后冷卻至50 ℃的NA培養(yǎng)基混合，制成含系列濃度藥劑的NA平板，以滅菌水為對照。待平板凝固后，取40 μL的1104 CFU/mL菌懸液涂布于含藥平板上，每個處理重復3次。于28 ℃培養(yǎng)72 h，觀察統(tǒng)計平板的菌落數(shù)計算抑制率。

1.2.3? 田間試驗? 田間藥效試驗在海南省樂東縣黃流鎮(zhèn)三曲溝村臺農(nóng)芒果種植園進行，細菌性角斑病初始發(fā)生為害。方法參照GB/T 17980.98- 2004試驗準則進行[13]，使用背負式電動噴霧器施藥。供試藥劑選用5種抑菌活性較好藥劑和1種保護性無機銅殺菌劑，按藥劑推薦濃度設計為46%氫氧化銅WG 1000倍、3%噻霉酮ME 1000倍、20%丙硫唑SC1000倍、4%春雷霉素AS 500倍、20%噻唑鋅SC 750倍和25%溴菌腈EC 1000倍，以清水為對照。每個處理小區(qū)5株，重復3次，于2018年10月中旬開始施藥，間隔7 d施藥1次，共施藥3次。在末次施藥后15和30 d，每小區(qū)定點調(diào)查3株，每株按照芒果樹冠層不同方向選取5條樹梢，記錄總?cè)~片數(shù)及各級病葉數(shù)，統(tǒng)計病情指數(shù)，計算藥劑防治效果。

病情分級如下，0級：無病斑;1級：病斑面積占整個葉片面積的5%以下;3級：病斑面積占整個葉片面積的6%～15%;5級：病斑面積占整個葉片面積的16%～25%;7級：病斑面積占整個葉片面積的26%～50%;9級：病斑面積占整個葉片面積的50%以上。藥效計算公式：

（1）

（2）

1.3? 數(shù)據(jù)處理

實驗相關(guān)數(shù)據(jù)采用Excel 2007軟件處理，使用SPSS 22統(tǒng)計軟件進行分析。室內(nèi)毒力數(shù)據(jù)，以殺菌劑有效成分劑量濃度對數(shù)和抑菌率機率值之間進行線性回歸關(guān)系分析，計算EC50及95%置信限。田間藥效數(shù)據(jù)采用Duncan氏新復極差法進行差異性顯著分析，P<0.05表示差異顯著。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 藥劑室內(nèi)離體活性初篩

室內(nèi)抑菌活性結(jié)果表明，22種殺菌劑對Xcm均有不同程度抑制作用。其中，辛菌胺醋酸鹽、噻霉酮、四霉素、溴菌腈和乙蒜素抑菌活性最強，在2 mg/L濃度作用下，抑菌率均在80%以上，丙硫唑、中生菌素、春雷霉素和三氯異氰尿酸抑菌活性次之;在離體條件下，銅制劑除喹啉銅之外，抑菌活性相對較低（表2）。

2.2? 室內(nèi)毒力測定

室內(nèi)毒力結(jié)果顯示，5種殺菌劑對芒果細菌性角斑病菌的毒力具有明顯差異。溴菌腈和噻霉酮的毒力最高，EC50分別為0.048、0.103 mg/L;丙硫唑次之，EC50為0.900 mg/L，20%而噻森銅的活性最差，其EC50高于180 mg/L（表3）

2.3? 對芒果細菌性角斑病的田間防效

結(jié)果顯示，6種藥劑在施藥后30 d對芒果細菌性角斑病均有一定的防治效果。其中，20%噻唑鋅SC在750倍相對防效最好，防效為77.13%;其次為3%噻霉酮ME 1000倍、20%丙硫唑SC?1000倍和25%溴菌腈EC 1000倍，防效分別為72.83%、73.54%和70.70%。4%春雷霉素AS 500倍防效最低，僅為41.88%。46%氫氧化銅WG處理的病葉率顯著低于其他藥劑處理，施藥前后病葉率只提高了5.33%，而4%春雷霉素AS處理后病葉率最高，提高了13.3%（表4）。

3? 討論

隨著我國芒果種植規(guī)模擴大，芒果細菌性角斑病的危害越發(fā)頻繁和嚴重，尤其是遭受臺風威脅的沿海種植區(qū)。除無毒苗培育和農(nóng)藝措施之外，使用化學藥劑防治是預防和阻止病害為害和蔓延的重要手段之一。防治芒果細菌性角斑病側(cè)重于預防病害發(fā)生，在暴風雨或者臺風雨過后，及時多次用藥，能夠在一定程度上控制病害爆發(fā)流行。銅制劑這類多作用位點殺菌劑，病原菌不易產(chǎn)生抗藥性，保護作用效果好，在防控芒果細菌性角斑病常用于預防病害的流行蔓延。在研究中發(fā)現(xiàn)，銅制劑氫氧化銅離體活性低，而田間試驗則表現(xiàn)出明顯的防效，其原因可能是銅制劑殺菌劑為了減少高濃度游離銅離子對植物毒性，一般加工成難溶性的銅鹽，噴施到植物表面后，在植物體和環(huán)境作用下，緩慢釋放銅離子從而發(fā)揮殺菌作用[14]。噻唑鋅田間防效高，與陳金雄等報道一致，但離體抑菌活性低，原因亦可能是如此，需進一步研究驗證。本研究中，噻霉酮、溴菌腈、丙硫唑和春雷霉素等藥劑對芒果細菌性角斑病菌的離體和田間活體均具有良好防治作用，可考慮在作物發(fā)病初期將銅制劑、噻唑鋅、噻霉酮、丙硫唑、溴菌腈和作為供選藥劑，輪換使用，以減少銅制劑的頻繁使用和抗藥性的產(chǎn)生。

有效成分、使用濃度和次數(shù)，是影響殺菌劑達到防控病害為目標的重要因子[15]。在田間試驗中，各藥劑在推薦一個濃度下，施藥3次，獲得了噻唑鋅等5種殺菌劑較好防治效果。在室內(nèi)活性測定中，辛菌胺醋酸鹽、乙蒜素、四霉素和中生菌素抑菌活性較高，但未開展田間藥效。因此，在后續(xù)研究中，在農(nóng)藥殘留不超標和作物未出現(xiàn)藥害的前提下，探索噻唑鋅等5種藥劑防治芒果細菌性角斑病的最佳使用濃度和次數(shù)，并繼續(xù)開展辛菌胺醋酸鹽等其他藥劑田間藥效試驗，進一步探討各藥劑間復配增效作用，以期獲得高效、安全防治藥劑。

參考文獻

文衍堂， 黃圣明. 芒果細菌性黑斑病癥狀與病原菌鑒定[J]. 熱帶作物學報， 1994（1）： 79-85.

Boshoff M， Kotze J M， Korsten L. Control of bacterial black spot[M]//South African Mango Growers' Association Yearbook. Tzaneen： HortResearch SA， 2000： 51-57.

Gagnevin L， Pruvost O. Epidemiology and control of mango bacterial black spot[J]. Plant Disease， 2001， 85（9）： 928-935.

何漢生， 董? 春， 朱彬年， 等. 芒果細菌性黑斑病的發(fā)生與防治研究初報[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學， 1996（6）： 35-37.

董? 春， 何漢生. 芒果細菌性黑斑病研究進展[J]. 果樹科學， 1999（S1）： 47-51.

楊? 葉， 黃圣明， 文衍堂. 芒果細菌性黑斑病菌的室內(nèi)藥劑篩選試驗[J]. 熱帶作物研究， 1994（3）： 34-36.

蒲金基， 張? 賀， 漆艷香， 等. 六種復配劑對芒果細菌性黑斑病菌的室內(nèi)抑菌效果評價[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學. 2015， 54（10）： 2387-2389， 2393.

王以燕. 第八屆全國農(nóng)藥登記評審委員會第九次全體會議紀要[J]. 世界農(nóng)藥， 2011， 33（5）： 56.

馬紹英. 棚室蔬菜銅制劑藥害的發(fā)生原因及建議[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技， 2018（11）： 139， 141.

Wightwick A M， Salztnan S A， Reichman S M ， et al. Effects of copper fungicide residues on the microbial function of vineyard soils[J]. Environmental Science and Pollution Research， 2013， 20（3）： 1574-1585.

農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所. 農(nóng)藥室內(nèi)生物測定試驗準則殺菌劑第16部分：抑制細菌生長量試驗渾濁度法[S]. 北京， 2008.

游文莉， 許文耀. 殺細菌劑毒力測定方法的研究[J]. 農(nóng)藥科學與管理， 2002（2）： 21-22.

農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所. 農(nóng)藥田間藥效試驗準則（二）第98部分：殺菌劑防治芒果炭疽病[S]. 北京， 2004： 3.

徐漢虹. 植物化學保護學（第四版）[M]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社， 2007： 135.

聶繼云， 董雅鳳， 王? 志. 落葉果樹生產(chǎn)中農(nóng)藥的安全使用[J]. 中國果樹， 2001（4）： 50-52.