TSA誘導(dǎo)橡膠樹(shù)次生乳管分化過(guò)程qRT-PCR內(nèi)參基因的篩選

吳紹華 張世鑫 楊署光 田維敏

摘? 要：橡膠樹(shù)乳管分化過(guò)程中差異表達(dá)基因的鑒定對(duì)于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)乳管分化的分子機(jī)理具有重要的作用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）是進(jìn)行基因表達(dá)分析的常用技術(shù)手段，合適內(nèi)參基因的選擇是準(zhǔn)確進(jìn)行基因表達(dá)定量的前提。以組蛋白去乙?；种苿┣乓志谹（trichostatin A， TSA）誘導(dǎo)橡膠樹(shù)次生乳管分化的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，采用qRT-PCR技術(shù)分析TSA處理橡膠樹(shù)萌條及對(duì)照內(nèi)層樹(shù)皮中22個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：TSA誘導(dǎo)橡膠樹(shù)萌條次生乳管分化的過(guò)程中，穩(wěn)定性最高的3個(gè)基因分別為UBC3、UBC4和eIF1Aa，而穩(wěn)定性最差的3個(gè)基因分別為ROC3、PTP、CYP2。以UBC3、Actin和ROC3基因?yàn)閮?nèi)參，分析組蛋白去乙?；富騂DA1和HDA2在TSA處理下樹(shù)皮中表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照的變化，結(jié)果初步證實(shí)TSA誘導(dǎo)橡膠樹(shù)萌條次生乳管分化的過(guò)程中，UBC3是最佳的內(nèi)參基因，ROC3不適合作為內(nèi)參基因。

關(guān)鍵詞：巴西橡膠樹(shù);乳管分化;曲古抑菌素A（TSA）;內(nèi)參基因

中圖分類(lèi)號(hào)：S794.1? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Selection of Reference Genes for Normalization of Quantitative Real-time PCR Analysis in Secondary Laticifer Differentiation Induced by Trichostatin A in Rubber Tree （Hevea brasiliensis Muell. Arg.）

WU Shaohua， ZHANG Shixin， YANG Shuguang， TIAN Weimin*

Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / State Key Laboratory Breeding Base of Cultivation and Physiology for Tropical Crops， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract： The identification of differentially expressed genes associated with laticifer differentiation is crucial for understanding the molecular mechanism of laticifer differentiation. The selection of a suitable reference gene is a precondition for accurate gene expression analysis by quantitative real-time PCR （qRT-PCR）. In the present study， the expression stability of 22 candidate reference genes were evaluated on the basis of TSA-induced secondary laticifer differentiation using geNorm and NormFinder algorithms. According to the analysis of geNorm and NormFinder， UBC3， UBC4， eIF1Aa were the top three stable genes and ROC3， PTP， CYP2 were the last three stable genes in the process of TSA-induced secondary laticifer differentiation. The expression patterns of HDA1 and HDA2 in TSA treated bark were analyzed based on UBC3， Actin and ROC3 as the reference gene respectively. The results showed that UBC3 could serve as a qRT-PCR reference gene to analyze the gene expression pattern in TSA-induced secondary laticifer differentiation. And ROC3 was not suitable as reference genes for qRT-PCR.

Keywords： Hevea brasiliensis Muell. Arg.; laticifer differentiation; trichostatin A; reference genes

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.03.012

巴西橡膠樹(shù)（Hevea brasiliensis Muell. Arg.），簡(jiǎn)稱(chēng)橡膠樹(shù)，是一種大戟科橡膠樹(shù)屬多年生熱帶喬木，是天然橡膠的主要來(lái)源。天然橡膠是在乳管細(xì)胞中合成和積累的。乳管細(xì)胞之間的細(xì)胞壁融合，形成互相連通的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)—乳管。在天然橡膠生產(chǎn)中，通常是通過(guò)周期性切割橡膠樹(shù)樹(shù)干樹(shù)皮，收集從乳管傷口處流出的膠乳來(lái)提煉天然橡膠。橡膠樹(shù)的乳管數(shù)量與橡膠樹(shù)品種的遺傳特性有關(guān)，與天然橡膠產(chǎn)量顯著正相關(guān)，是橡膠樹(shù)產(chǎn)量育種的重要指標(biāo)之一[1]。因此，進(jìn)行橡膠樹(shù)乳管分化調(diào)控機(jī)理的研究對(duì)于改良橡膠樹(shù)品系的遺傳特性具有重要的意義。橡膠樹(shù)乳管是由形成層細(xì)胞分化而來(lái)的，研究表明，機(jī)械傷害、茉莉酸及冠菌素（一種茉莉酸類(lèi)似物）均能誘導(dǎo)次生乳管的分化[2-5]。最近的研究證實(shí)，1種組蛋白去乙?；种苿乓志谹（trichostatin A， TSA）也能誘導(dǎo)次生乳管的分化，表明組蛋白乙?；谙鹉z樹(shù)次生乳管分化中起著重要的作用[6]。然而，關(guān)于組蛋白乙?；瘜?duì)乳管分化的調(diào)控機(jī)理了解的較少。

差異表達(dá)基因的篩選是進(jìn)行分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和基因功能研究的前提。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR， qRT-PCR）技術(shù)由于具有低成本、高精確性及其高靈敏度等特點(diǎn)[7]，已成為基因相對(duì)定量表達(dá)分析最常用的技術(shù)。但qRT-PCR也有缺點(diǎn)，即合適內(nèi)參基因選擇是準(zhǔn)確定量基因表達(dá)的前提。理想的內(nèi)參基因應(yīng)在不同的處理下及不同類(lèi)型樣品均能較穩(wěn)定地表達(dá)[8]。但已有的研究證實(shí)，生物體內(nèi)基因由于在不同的環(huán)境及不同的組織中行使功能的不同，并沒(méi)有真正的、完全穩(wěn)定的內(nèi)參基因[9-10]。因此，為獲得準(zhǔn)確的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，每進(jìn)行一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，都應(yīng)評(píng)估以選擇出當(dāng)前條件下合適的內(nèi)參基因。截止至目前為止，關(guān)于橡膠樹(shù)內(nèi)參基因評(píng)估的報(bào)道主要是針對(duì)膠乳的再生、排膠效應(yīng)、不同基因型、不同組織、不同激素處理及逆境等[11-14]。關(guān)于形成層分化乳管過(guò)程內(nèi)參基因的評(píng)估只見(jiàn)報(bào)道了1例，即冠菌素誘導(dǎo)橡膠樹(shù)萌條樹(shù)皮乳管分化系統(tǒng)內(nèi)參基因的評(píng)估，結(jié)果顯示HbUBC2a在冠菌素（coronatine， COR）誘導(dǎo)次生乳管分化的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中表達(dá)最穩(wěn)定[15]。為進(jìn)一步完善乳管分化實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)內(nèi)參基因的篩選和為構(gòu)建組蛋白乙?；{(diào)控橡膠樹(shù)次生乳管分化的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)篩選合適的內(nèi)參基因，本研究利用TSA誘導(dǎo)次生乳管分化的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，采用geNorm[16]和NormFinder[17]評(píng)估橡膠樹(shù)18s ribosomal RNA（18S）、actin、actin de po lymerizing factor（ADF，ADF4）、cyclophilin（CYP2）、eukaryotic translation initiation factor（eIF1Aa、eIF1Ab、eIF2、eIF3）、F-box family protein（FP）、trosine phosphatase（PTP）、DEAD box RNA helicase（RH2a、RH2b、RH8）、cytosolic cyclophilin（ROC3）、T-complex protein 1 subunit beta（TCBP）、Ubiquitin-protein ligase（UBC1、UBC2a、UBC2b、UBC3、UBC4）、mitosis protein YLS8（YLS8）持家基因[11]的表達(dá)穩(wěn)定性，以篩選出合適的內(nèi)參基因。

1? 材料與方法

1.1? 材料

本實(shí)驗(yàn)所用材料為巴西橡膠樹(shù)無(wú)性系熱研73397萌條，這些材料種植于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)場(chǎng)，每年都被鋸斷，由莖干基部的潛伏芽長(zhǎng)出萌條。萌條的頂芽在一年中活動(dòng)5～6次，2次活動(dòng)生長(zhǎng)的葉簇中間隔一定長(zhǎng)度的無(wú)葉莖稈，這種明顯的增長(zhǎng)形態(tài)，稱(chēng)為伸長(zhǎng)單位（extension unit， EU）[3-4]。在自然條件下，從頂端往下數(shù)第1～2伸長(zhǎng)單位中是沒(méi)有次生乳管[3-4]，因此，第1～2伸長(zhǎng)單位常常用來(lái)研究次生乳管分化的誘導(dǎo)。

1.2? 方法

1.2.1? 材料的處理及RNA的提取? 本實(shí)驗(yàn)采用萌條第2伸長(zhǎng)單位作為處理的部位，用單面刀片輕輕刮去莖表面的角質(zhì)層，然后分別涂100 nmol/L的TSA（Selleck，USA）和去離子水（CK），再用塑料薄膜包裹進(jìn)行處理[5-6]，于處理后0.5、1、2、4、8、24、48、72 h采集包含形成層的內(nèi)層樹(shù)皮，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集9株萌條的樣品，3株萌條的樣品混合為1個(gè)樣品，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3次重復(fù)，然后液氮冷凍后80 ℃冰箱保存用于RNA的提取。RNA的提取及痕量DNA的消化采用RNAprep Pure Plant（天根，北京）試劑盒進(jìn)行。RNA提取后采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整度，NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific，USA）測(cè)定RNA的純度和濃度。取1 ?g RNA采用Reve rt AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit （The rmo Fisher Scientific，USA）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，獲得的cDNA產(chǎn)物稀釋10倍后用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）。

1.2.2? qRT-PCR候選內(nèi)參基因及穩(wěn)定性驗(yàn)證基因的選擇? 根據(jù)橡膠樹(shù)已報(bào)道的內(nèi)參基因[11-15]，選擇22個(gè)持家基因（18S、Actin、ADF、ADF4、CYP2、eIF1Aa、eIF1Ab、eIF2、eIF3、FP、PTP、RH2a、RH2b、RH8、ROC3、TCBP、UBC1、UBC2a、UBC2b、UBC3、UBC4、YLS8）作為候選的內(nèi)參基因。參照已報(bào)道的HDA基因[18]，選擇HDA1、HDA2基因用于內(nèi)參基因穩(wěn)定性的驗(yàn)證，其中候選內(nèi)參基因及驗(yàn)證基因的引物如表1。

1.2.3? 基因的qRT-PCR分析? 以TSA處理和對(duì)照的cDNA為模板，采用SYBR Premix Ex Taq?（TaKaRa，Japan）試劑，基于CFX384 Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad公司，USA）平臺(tái)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。反應(yīng)體系為10 μL體系，包含1 μL模板、5 μL 2×SYBR Premix、10 μmol/L上游引物和下游引物各0.3 μL、滅菌水補(bǔ)足10 μL。每1個(gè)PCR反應(yīng)重復(fù)3次，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán);擴(kuò)增完后進(jìn)行產(chǎn)物熔解曲線分析檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，溫度為65～ 95 ℃，每循環(huán)上升0.5 ℃，連續(xù)測(cè)定樣品的熒光值獲得熔解曲線。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

采用geNorm和NormFinder對(duì)TSA處理的次生乳管分化的過(guò)程進(jìn)行內(nèi)參基因穩(wěn)定性的評(píng)估。需要先按照公式Q=EminCp–Cq（E為基因的擴(kuò)增效率。當(dāng)擴(kuò)增效率接近100%時(shí)，E通常默認(rèn)為2。Cq為該基因在各個(gè)組織中的Cq值，min Cq為該基因在所有組織中最小的Cq值）將內(nèi)參基因的原始Cq值轉(zhuǎn)化為相對(duì)表達(dá)量Q值，然后將Q值導(dǎo)入到geNorm和Normfinder軟件進(jìn)行分析。對(duì)于geNorm分析，以基因配對(duì)的形式不斷剔除最不穩(wěn)定的基因，得到內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值M，M值與內(nèi)參基因的穩(wěn)定性呈負(fù)相關(guān)，即M值越小代表基因的穩(wěn)定值越高，反之則越低，最后根據(jù)M值大小將候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性進(jìn)行排序，篩選出最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化因子配對(duì)差異分析Vn/n+1（閾值為0.15）來(lái)判定內(nèi)參基因的最適數(shù)目。

NormFinder程序則是通過(guò)計(jì)算基因的表達(dá)穩(wěn)定值（stability value， SV）來(lái)評(píng)估候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，SV值越小，候選內(nèi)參基因就越穩(wěn)定，反之亦然。最后，對(duì)2個(gè)軟件的評(píng)估結(jié)果進(jìn)行比較分析。

HDA1和HDA2熒光定量表達(dá)數(shù)據(jù)采用one- way ANOVA對(duì)處理及對(duì)照進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.05時(shí)即達(dá)顯著性，用符號(hào)*表示;P<0.01時(shí)即達(dá)極顯著性，用符號(hào)**表示。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 內(nèi)參基因定量引物的特異性檢測(cè)

對(duì)橡膠樹(shù)22個(gè)候選的內(nèi)參基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示候選的內(nèi)參基因擴(kuò)增條帶單一，片段大小與目的片段大小一致（圖1），表明候選的內(nèi)參引物的特異性擴(kuò)增較好，符合qRT-PCR實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，可用于內(nèi)參基因的評(píng)估。

2.2? TSA處理和對(duì)照橡膠樹(shù)萌條內(nèi)層樹(shù)皮候選內(nèi)參基因的轉(zhuǎn)錄豐度

為了鑒定22個(gè)候選內(nèi)參基因的轉(zhuǎn)錄豐度，采用qRT-PCR分析了TSA處理和對(duì)照橡膠樹(shù)內(nèi)層樹(shù)皮中內(nèi)參基因的表達(dá)量，根據(jù)Cq值預(yù)測(cè)內(nèi)參基因的表達(dá)豐度，Cq值越小，表達(dá)豐度越高。根據(jù)候選內(nèi)參基因Cq值的分布情況，不同的內(nèi)參基因在內(nèi)層樹(shù)皮中的表達(dá)豐度存在明顯的差異。22個(gè)候選內(nèi)參基因的Cq值介于11.52～ 28.59，其中18S rRNA Cq值最低，表達(dá)量最高;FP的Cq值最高，表達(dá)量最小。其他內(nèi)參基因的Cq值介于20～30之間（圖2）。

2.3? geNorm分析內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性

geNorm分析結(jié)果顯示，TSA處理和對(duì)照橡膠樹(shù)萌條內(nèi)層樹(shù)皮候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性從高到低的排序?yàn)閁BC3/UBC4、eIF1Aa、RH2b、YLS8、UBC2a、Actin、ADF4、RH8、TCPB、UBC2b、eIF1Ab、RH2a、ADF、eIF3、UBC1、FP、18S、eIF2、CYP2、PTP、ROC3，表明TSA誘導(dǎo)次生

乳管分化的實(shí)驗(yàn)中，前3組最穩(wěn)定的基因分別為UBC3/UBC4、eIF1Aa、RH2b，其中UBC3/UBC4是最合適的內(nèi)參基因。最不穩(wěn)定的3個(gè)內(nèi)參基因分別為ROC3、PTP、CYP2（圖3A）。另外，為了分析內(nèi)參基因的適合個(gè)數(shù)，對(duì)內(nèi)參基因的配對(duì)差異值進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，TSA誘導(dǎo)橡膠樹(shù)萌條次生乳管分化的過(guò)程中，V2/3的配對(duì)的變異值（pairwise variations）為0.061，小于閾值0.15，可以判定適合作為內(nèi)參的基因個(gè)數(shù)為2個(gè)（圖3B）。

2.4? NormFinder分析內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性

NormFinder分析結(jié)果顯示，TSA處理和對(duì)照橡膠樹(shù)萌條內(nèi)層樹(shù)皮候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性從高到低的排序?yàn)閁BC3、UBC4、eIF1Aa、RH2b、UBC2a、RH8、ADF4、YLS8、Actin、TCPB、eIF3、ADF、UBC2b、FP、eIF1Ab、UBC1、RH2a、18S、eIF2、CYP2、PTP、ROC3，前3個(gè)最穩(wěn)定的基因分別為UBC3、UBC4、eIF1Aa，其中UBC3是最合適的內(nèi)參基因，穩(wěn)定性最差的3個(gè)內(nèi)參基因分別為ROC3、PTP、CYP2（圖4）。結(jié)果表明，在穩(wěn)定性前3位和后3位的內(nèi)參基因的評(píng)估中，NormFinder分析結(jié)果與geNorm分析結(jié)果是一致的。因此，在TSA誘導(dǎo)橡膠樹(shù)萌條次生乳管分化的過(guò)程中，UBC3是最佳的內(nèi)參基因。

2.5? 內(nèi)參基因的穩(wěn)定性驗(yàn)證

結(jié)合候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性的評(píng)估結(jié)果，分別選擇穩(wěn)定性最好的基因UBC3、穩(wěn)定性最差的基因ROC3及文獻(xiàn)報(bào)道的內(nèi)參基因Actin對(duì)TSA響應(yīng)的關(guān)鍵基因HDA1和HDA2基因進(jìn)行了相對(duì)表達(dá)量的評(píng)估。結(jié)果顯示，采用UBC3和Actin作為內(nèi)參，TSA處理下樹(shù)皮中HDA1和HDA2基因的表達(dá)量變化趨勢(shì)基本一致（圖5A，圖5B，圖5C和圖5D）。不同的是以UBC3作為內(nèi)參，HDA2在TSA處理8 h后表達(dá)量相比對(duì)照極顯著上調(diào)（P<0.01）（圖5B），而以Actin作為內(nèi)參，HDA2在TSA處理8 h后表達(dá)量相比對(duì)照顯著上調(diào)（P< 0.05）（圖5D）。但是，以ROC3作為內(nèi)參，HDA1

A、C、E分別為以UBC3、Actin、ROC3為內(nèi)參評(píng)估的HDA1基因的相對(duì)表達(dá)量;B、D、F分別為以UBC3、Actin、ROC3為內(nèi)參評(píng)估的HDA2基因的相對(duì)表達(dá)量。熒光定量表達(dá)數(shù)據(jù)采用One-way ANOVA對(duì)TSA處理及對(duì)照進(jìn)行差異顯著性分析，

*表示P<0.05，即達(dá)顯著性水平;**表示P<0.01，即達(dá)極顯著性水平。

和HDA2表達(dá)量及表達(dá)量的趨勢(shì)都發(fā)生了較大的變化（圖5E，圖5F），且HDA2在TSA處理8 h后表達(dá)量相比對(duì)照也無(wú)顯著差異（圖5F）。結(jié)果表明，內(nèi)參基因的正確選擇對(duì)于采用qRT-PCR進(jìn)行基因相對(duì)表達(dá)量的定量至關(guān)重要，UBC3適合作為T(mén)SA處理樹(shù)皮樣品相關(guān)基因定量表達(dá)的內(nèi)參。

2.6? TSA與COR誘導(dǎo)次生乳管分化過(guò)程中內(nèi)參基因的比較分析

因?yàn)橛糜趦?nèi)參評(píng)估COR處理及TSA處理的樣品是同一時(shí)間采集，且2批處理的樣品共用同一批對(duì)照樣品，因此，我們整合2批樣品的數(shù)據(jù)，采用geNorm與NormFinder軟件對(duì)整合的內(nèi)參基因數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)估，geNorm結(jié)果顯示eIF1Aa/ UB C2a、RH2b、UBC3、YLS8和UBC4為前5個(gè)最穩(wěn)定表達(dá)的基因。NormFinder結(jié)果顯示UBC3、RH2b、UBC4、eIF1Aa和UBC2a為前5個(gè)最穩(wěn)定表達(dá)的基因。其中UBC3、RH2b、eIF1Aa和UBC2a在2個(gè)軟件中評(píng)估結(jié)果是重疊的，因此，認(rèn)為這4個(gè)基因在COR和TSA誘導(dǎo)次生乳管分化的過(guò)程中基因表達(dá)量較穩(wěn)定，可進(jìn)一步驗(yàn)證其是否可用于乳管分化基因相對(duì)定量表達(dá)的內(nèi)參基因（圖6）。

3? 討論

橡膠樹(shù)基因組的測(cè)序完成為進(jìn)一步進(jìn)行橡膠樹(shù)發(fā)育及抗逆等功能基因的挖掘提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)[19]。熒光定量PCR技術(shù)是進(jìn)行基因鑒定研究的必備手段之一。為獲得準(zhǔn)確的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，內(nèi)參基因的選擇就顯的尤為重要。只有選擇合適、穩(wěn)定的基因作為內(nèi)參基因，才能客觀、真實(shí)地反映基因的相對(duì)表達(dá)量。理想的內(nèi)參基因應(yīng)在不同的基因型植株、不同組織、不同的發(fā)育階段及不同處理下均能恒定表達(dá)，但現(xiàn)有的研究顯示，并不存在通用性的內(nèi)參基因。比如，18S rRNA由于基因表達(dá)范圍廣、表達(dá)量恒定，常常作為許多植物qRT-PCR分析的內(nèi)參基因，但在小麥、苜蓿、杜鵑和雜交蘭中，18S rRNA并不適合內(nèi)參基因[20-21]。早期橡膠樹(shù)qRT-PCR分析也有采用18S rRNA作為內(nèi)參基因的[22-24]。本研究發(fā)現(xiàn)，18S rRNA在樹(shù)皮中的Cq值較低（Cq=11.52），即表達(dá)豐度最高，且其表達(dá)穩(wěn)定性相對(duì)較差，表明18S rRNA并不適合作為T(mén)SA誘導(dǎo)橡膠樹(shù)乳管分化的內(nèi)參，且多份橡膠樹(shù)內(nèi)參基因評(píng)估的文獻(xiàn)[11-15]也證實(shí)18S rRNA穩(wěn)定性相對(duì)較差并不適合作為橡膠樹(shù)的內(nèi)參基因。

本研究基于TSA誘導(dǎo)橡膠樹(shù)萌條次生乳管分化的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，對(duì)22個(gè)候選的內(nèi)參基因在TSA處理樹(shù)皮樣品中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。除18S rRNA的Cq值較低，其他內(nèi)參基因的Cq值在樹(shù)皮中處于20～30之間，與Li等[11]和Chao等[14]在膠乳中檢測(cè)的Cq值相似，表明22個(gè)候選的內(nèi)參基因表達(dá)量適中，適合進(jìn)行基因表達(dá)穩(wěn)定性的評(píng)估。通過(guò)geNorm與NomFinder軟件的分析，在TSA誘導(dǎo)橡膠樹(shù)萌條次生乳管分化的過(guò)程中，UBC3、UBC4、eIF1Aa、RH2b是前4位穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因。UBC3和RH2b在COR誘導(dǎo)橡膠樹(shù)萌條次生乳管分化的過(guò)程中的表達(dá)穩(wěn)定性也在前4位之中[15]。另外，RH2b還可用于橡膠樹(shù)不同組織、非生物脅迫和收割逆境處理的內(nèi)參基因[11-12]。UBC4在膠乳再生和排膠過(guò)程中的表達(dá)也較穩(wěn)定[13-14]，eIF1Aa可用于割膠處理?xiàng)l件下膠乳中相關(guān)基因表達(dá)的內(nèi)參基因[11-14]。這也說(shuō)明UBC、eIF和RH基因家族在不同組織及不同處理?xiàng)l件下的表達(dá)較穩(wěn)定。但不同的樣品中基因的編號(hào)及表達(dá)穩(wěn)定性的排序也不一樣，表明在不同樣品中進(jìn)行基因的表達(dá)量分析前需要進(jìn)行內(nèi)參基因的評(píng)估以選擇出最佳的內(nèi)參基因。在本研究中，通過(guò)geNorm與NomFinder軟件的評(píng)估以及對(duì)表達(dá)穩(wěn)定內(nèi)參基因的驗(yàn)證，顯示UBC3是TSA誘導(dǎo)橡膠樹(shù)萌條次生乳管分化的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的最佳內(nèi)參基因。

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