輔酶Q10脂質(zhì)體的制備及其抗紫外線損傷的作用

吳海游 吳怡 吳鐵

[摘要]目的 研究輔酶Q10脂質(zhì)體的制備及其抗紫外線損傷的作用。方法 采用乙醇注入法制備輔酶Q10脂質(zhì)體。然后進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，將32只SPF級(jí)小鼠隨機(jī)分成正常（CON）組、模型（MOL）組、輔酶Q10脂質(zhì)體（COQ）組、二氧化鈦（TiO2）組，每組各8只。CON組小鼠脫毛后不作任何處理，其余組小鼠脫毛后每天涂抹相應(yīng)霜?jiǎng)┎⑦M(jìn)行紫外線照射，其中MOL組涂抹空白霜?jiǎng)珻OQ組涂抹輔酶Q10脂質(zhì)體，TiO2組涂抹TiO2霜?jiǎng)丈鋭┝繛樽钚〖t斑量，實(shí)驗(yàn)持續(xù)8周，結(jié)束后進(jìn)行小鼠皮膚病理學(xué)觀察與丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-1）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）含量測(cè)定。結(jié)果 輔酶Q10脂質(zhì)體最優(yōu)處方為溫度60°C、水相pH 7.7、輔酶Q10百分比0.9%、卵磷脂百分比1.6%，其包封率為44.7%，且脂質(zhì)體大小均勻，成球狀。MOL組小鼠皮膚組織的MDA含量與MMP-1相對(duì)表達(dá)量均高于CON組，SOD含量低于CON組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;COQ組小鼠皮膚組織的SOD含量高于MOL組，MMP-1相對(duì)表達(dá)量低于MOL組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;TiO2組小鼠皮膚組織的MDA含量低于MOL組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;COQ組小鼠皮膚組織的GSH-Px含量高于其他各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 制備的輔酶Q10脂質(zhì)體大小均勻，且具有抗小鼠皮膚紫外線損傷的作用。

[關(guān)鍵詞]輔酶Q10;脂質(zhì)體;紫外線損傷

[中圖分類號(hào)] R965? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1674-4721（2020）3（c）-0004-05

Preparation of coenzyme Q10 liposome and its anti-ultraviolet damage effect

WU Hai-you1，2? ?WU Yi2? ?WU Tie2，3

1. Dongguan Food and Drug Inspection Institute， Guangdong Province， Dongguan? ?523808， China; 2. Guangdong Medical University， Guangdong Province， Zhanjiang? ?524023， China; 3. Coenzyme Q10 Joint Research Center， Guangdong Medical University-Guangdong Runhe Biotechnology Co.， Ltd.， Guangdong Province， Dongguan? ?523808， China

[Abstract] Objective To study the preparation of coenzyme Q10 liposome and its anti-ultraviolet damage effect. Methods The coenzyme Q10 liposomes were prepared by injecting ethanol， then animal experiments were performed. A total of 32 SPF mice were randomly divided into normal （CON） group， model （MOL） group， coenzyme Q10 liposome （COQ） group， and titanium dioxide （TiO2） group， 8 mice in each group. The mice in the CON group were not subjected to any treatment after depilation， and the remaining groups of mice were smeared with the corresponding cream and irradiated with ultraviolet rays every day after depilation. Among them， the MOL group was smeared with the blank cream， the COQ group was smeared with the coenzyme Q10 liposome， and the TiO2 group was smeared with the TiO2 cream. The irradiation dose was the minimum amount of erythema， and the experiment lasted 8 weeks. After the end of the experiment， the skin pathology and the contents of malondialdehyde （MDA）， superoxide dismutase （SOD）， and matrix metalloproteinase （MMP-1）， glutathione peroxidase （GSH-Px） in the mice were determined. Results The optimum formulation of coenzyme Q10 liposome showed as the temperature was 60°C， the water phase of pH was 7.7 and other was 0.9% of coenzyme Q10 and 1.6% of lecithin. The encapsulation efficiency of coenzyme Q10 liposome was 44.7%， and the liposome was uniform in size and globular. The MDA content and the relative expression of MMP-1 in skin tissue of the mice in the MOL group were higher than those in the CON group， and the SOD content was lower than that in the CON group， with statistically significant differences （P<0.05）. The SOD content in the skin tissue of the mice in the COQ group was higher than that in the MOL group， and the relative expression of MMP-1 was lower than that in the MOL group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The MDA content in the skin tissue of the mice in the TiO2 group was lower than that in the MOL group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The GSH-Px content in the skin tissue of mice in the COQ group was higher than that in other groups， and the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion The prepared coenzyme Q10 liposome is uniform in size and has anti-ultraviolet damage effect on mice skin.

[Key words] Coenzyme Q10; Liposome; Ultraviolet damage

輔酶Q10俗稱泛醌，是機(jī)體能量ATP供應(yīng)的重要有機(jī)酶[1]。隨著對(duì)輔酶Q10的不斷研究，發(fā)現(xiàn)其在眾多領(lǐng)域中均有藥用價(jià)值，其中在皮膚老化保護(hù)方面，輔酶Q10含量可以作為衡量皮膚健康與否的重要指標(biāo)[2-3]。本研究前期發(fā)現(xiàn)三種含輔酶Q10的防曬霜具有抗小鼠皮膚紫外線損傷的作用，這是由防曬劑與輔酶Q10聯(lián)合作用的結(jié)果[4]。那單獨(dú)使用輔酶Q10能否達(dá)到抗皮膚紫外線效果呢？輔酶Q10作為一種大分子物質(zhì)，分子量為863.36，而皮膚作為人體的第一道防線，輔酶Q10要直接透過表皮層比較困難[5-6]。所以借用脂質(zhì)體載體，將輔酶Q10包裹，根據(jù)脂溶性物質(zhì)相似相容性原理，脂質(zhì)體透過表皮層發(fā)揮輔酶Q10的作用。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道運(yùn)用脂質(zhì)體載體可以將藥物“運(yùn)輸”進(jìn)真皮層發(fā)揮抗皮膚光損傷的作用[7]。本研究旨在研究輔酶Q10脂質(zhì)體的制備及其抗紫外線損傷的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1試劑與儀器

1.1.1試劑? 輔酶Q10（批號(hào)：2017052405）由廣東潤(rùn)和生物科技有限公司提供;60%大豆卵磷脂（PC60，批號(hào)：20160410）購(gòu)于海愛康精細(xì)化工;膽固醇、聚山梨酯80、無(wú)水乙醇、鹽酸、PBS購(gòu)于國(guó)藥試劑;丙二醛（MDA）測(cè)試盒（批號(hào)：201802640）、超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)試盒（批號(hào)：201712880）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）測(cè)試盒（批號(hào)：201812041）、伊紅-蘇木精（HE）染色試劑盒（批號(hào)：201803930）購(gòu)于南京建成公司;RT-qPCR反逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：201705467）與SYBR熒光染料購(gòu)于TaKaRa公司。

1.1.2儀器? PCR擴(kuò)增儀（Thermo公司）;UVB紫外燈及ST-513型紫外線輻照計(jì)（臺(tái)灣先馳光電公司）;電子天平（上海民橋）;雷磁實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)（上海精密儀器公司）;200 kV場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡（Tecani G2 F20 S-TWIN型）;酶標(biāo)儀（中國(guó)普朗公司）;微量移液器（美國(guó)Thermo公司）、冷凍離心機(jī)（德國(guó)eppendorf公司）。

1.2輔酶Q10脂質(zhì)體的制備

首先按一定比例精確稱取輔酶Q10、PC60、膽固醇、聚山梨酯80、無(wú)水乙醇，55°C水浴攪拌20 min至完全溶解得到油相;再配制PBS溶液，作為水相，并于55°C恒溫磁力低速攪拌，待油相攪拌完成后，用注射器將油相快速注射入水相中，并將水相攪拌速度提升至1000 r/mim、溫度不變攪拌20 min，攪拌完成后即用顯微鏡觀察是否有脂質(zhì)體生成，將得到的脂質(zhì)體溶液自然冷卻到室溫，保存在合適條件下[8]。

1.3包封率（encapsulation efficiency，EE）計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取輔酶Q10標(biāo)準(zhǔn)品10.00 g，溶解于無(wú)水乙醇中，并置于50 ml容量瓶中定溶，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品溶液在300 nm波長(zhǎng)處的吸光度值，多次測(cè)量求出平均值;樣品處理：把制得的樣品在4℃ 8000 r/min離心30 min，再取少量上清液用微孔濾膜過濾，這使得濾液中不含脂質(zhì)體，用無(wú)水乙醇稀釋濾液，最后在300 nm波長(zhǎng)處測(cè)量稀釋液的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值計(jì)算EE。

1.4正交處方優(yōu)化

以EE為考察標(biāo)準(zhǔn)，以制備溫度（A）、水相pH值（B）、輔酶Q10百分比（C）、PC60百分比（D）4個(gè)因素作為考察因素進(jìn)行正交處方優(yōu)化，每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)水平，按L9（34）正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（表1）。

1.5實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模

32只SPF級(jí)3月齡雌性KM小鼠，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重（27.41±0.57）g，動(dòng)物合格證：SCXK（粵）2011-0015，各小鼠均自由飲食。實(shí)驗(yàn)開始前，將小鼠背部皮膚進(jìn)行物理脫毛，面積約為2×3 cm2，再隨機(jī)分成四組，即正常（CON）組、模型（MOL）組、輔酶Q10脂質(zhì)體（COQ）組、二氧化鈦（TiO2）組，每組各8只。正常組小鼠脫毛后不作任何處理，其余組小鼠脫毛后每天涂抹相應(yīng)霜?jiǎng)┎⑦M(jìn)行紫外線照射，其中MOL組小鼠涂抹空白霜?jiǎng)?，COQ組小鼠涂抹輔酶Q10脂質(zhì)體，TiO2組小鼠涂抹TiO2霜?jiǎng)丈鋭┝繛樽钚〖t斑量[9]，連持8周[10-11]，每周稱量體重1次，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后小鼠眼球取血處死，剪下皮膚進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

1.6小鼠皮膚組織MDA、SOD、GSH-Px的測(cè)量

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，剪取3 g左右皮膚組織放進(jìn)勻漿管中加入適量生理鹽水進(jìn)行冷凍勻漿，待組織塊充分勻漿后4℃ 12 000 r/min 離心15 min，取離心管上層液，參照試劑盒提供的檢測(cè)方法對(duì)小鼠皮膚MDA、SOD、GSH-Px進(jìn)行檢測(cè)，并計(jì)算其含量。

1.7小鼠皮膚病理學(xué)切片染色

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，剪下小鼠背部脫毛部位皮膚進(jìn)行多聚甲醛固定、石蠟包埋，再進(jìn)行HE染色，染色方法詳細(xì)參照染色試劑盒說明書。

1.8小鼠皮膚組織基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-1）表達(dá)水平的檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，剪取3 g皮膚組織用Trizol進(jìn)行勻漿，提取組織RNA，再參照RT-qPCR反逆轉(zhuǎn)錄試劑盒方法進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)錄，最后在SYBR熒光顏料的作用下PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行基因相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)[12]。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1脂質(zhì)體制備方法的優(yōu)選

初步確定制備工藝為溫度、輔酶Q10投藥量、大豆卵磷脂投入比例、水相pH為制備主干擾因素，設(shè)計(jì)一種四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行處方優(yōu)化，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，在溫度的3個(gè)水平中（50、55、60°C）經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)60°C時(shí)效果較理;在pH的3個(gè)水平中（7.7、7.9、8.1）經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)pH為7.7時(shí)效果較理想;在輔酶Q10百分比的3個(gè)水平中（0.7、0.8、0.9%）經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)0.9%時(shí)效果較理想;在PC60百分比的3個(gè)水平中（1.3、1.6、1.9%）經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)1.6%時(shí)效果較理想。最優(yōu)處方：溫度為60°C、水相pH為7.7、輔酶Q10質(zhì)量百分比為0.9%、PC60質(zhì)量百分比為1.6%。

2.2脂質(zhì)體電鏡觀察圖

輔酶Q10脂質(zhì)體在電鏡下拍攝如圖1所示，在電鏡下脂質(zhì)體清晰可見，大小分布均勻，成球狀。

2.3各組小鼠每周體重的變化

實(shí)驗(yàn)期間各組小鼠體重變化如圖2（封三）所示，CON、MOL組大鼠體重呈現(xiàn)先降低后增高的趨勢(shì)，最后處于穩(wěn)定狀態(tài)，COQ、TiO2組大鼠體重則呈現(xiàn)一直增長(zhǎng)，最后處于穩(wěn)定的趨勢(shì)。

2.4各組小鼠皮膚組織MDA、SOD、GSH-Px含量的比較

MOL組小鼠皮膚組織的MDA含量高于CON組，SOD含量低于CON組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;COQ組小鼠皮膚組織的SOD含量高于MOL組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;TiO2組小鼠皮膚組織MDA的含量低于MOL組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;TiO2組小鼠皮膚組織的SOD含量低于COQ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;MOL組小鼠皮膚組織的GSH-Px含量低于CON組，COQ組小鼠皮膚組織的GSH-Px含量高于其他各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表3）。

2.5各組小鼠皮膚組織病理切片染色的結(jié)果

各組小鼠皮膚組織病理切片染色如圖3（封三）所示，CON組小鼠表皮層完整，厚度均勻;MOL組小鼠表皮層脫落嚴(yán)重，厚度較厚;COQ組小鼠表皮層完整，厚度較薄;TiO2組小鼠表皮層稍微脫落，厚度大小均一。

2.6各組小鼠皮膚組織MMP-1相對(duì)表達(dá)量的比較

MOL組小鼠皮膚組織的MMP-1相對(duì)表達(dá)量高于CON組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;COQ組小鼠皮膚組織的MMP-1相對(duì)表達(dá)量低于MOL組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;TiO2組小鼠皮膚組織的MMP-1相對(duì)表達(dá)量高于CON組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;TiO2組小鼠皮膚組織的MMP-1相對(duì)表達(dá)量高于COQ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖4）。

3討論

輔酶Q10是一種泛醌，其分子量達(dá)到863.36，單獨(dú)穿透皮膚表皮層的難度較大，所以本研究采用脂質(zhì)體作為運(yùn)輸載體。脂質(zhì)體是由卵磷脂和神經(jīng)酰胺等制得的空心體，具有的雙分子層結(jié)構(gòu)與皮膚細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)相同，是一種很好的穿透皮膚運(yùn)輸載體[13-14]。但脂質(zhì)體的制備受到多種因素干擾，其中包括：投藥量百分比、水相pH值、卵磷脂百分比、溫度等[15]，想要選擇一種EE適合的處方需要經(jīng)過一定的摸索探討，本實(shí)驗(yàn)采用了四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)以獲得最佳處方。當(dāng)溫度從低溫往高溫變化時(shí)，輔酶Q10 EE出現(xiàn)波動(dòng)性變化，但考慮投入與效率等方面的因素，這里選擇60°C為最佳溫度。在水相pH三個(gè)因素下，當(dāng)其從低往高變化時(shí)，輔酶Q10平均EE逐漸降低，所以選擇7.7為最佳水相pH。輔酶Q10的投藥量則跟水相pH呈現(xiàn)相反特點(diǎn)，當(dāng)其從低往高變化時(shí)，輔酶Q10平均EE逐漸減升高，所以選擇投藥量百分比為0.9%。最后，PC60投入量百分比在1.6%與1.9%時(shí)，輔酶Q10 EE較理想，但考慮投入與效率等方面的因素，這里選擇投入量百分比1.6%。所以經(jīng)正交實(shí)驗(yàn)表獲得最佳處方：溫度為60°C、水相pH 7.7、輔酶Q10百分比為0.9%、PC60百分比為1.6%。根據(jù)該處方制備的輔酶Q10脂質(zhì)體大小分布均勻，成球狀，是一種較理想的輔酶Q10劑型。

輔酶Q10脂質(zhì)體是一種油相包裹輔酶Q10的制劑，可以快速地將輔酶Q10“運(yùn)輸”進(jìn)皮膚。然而關(guān)于脂質(zhì)體是如何將輔酶Q10“運(yùn)輸”進(jìn)皮膚的作用機(jī)制目前尚未清楚，目前認(rèn)為輔酶Q10脂質(zhì)體可能通過以下幾種機(jī)制進(jìn)入皮膚：水合機(jī)制、融合機(jī)制、穿透機(jī)制。水合機(jī)制認(rèn)為脂質(zhì)體可能通過增加角質(zhì)層濕化和水合作用，改變角質(zhì)細(xì)胞間結(jié)構(gòu)，促使藥物通過擴(kuò)散等作用進(jìn)入細(xì)胞間質(zhì)[16]。融合機(jī)制認(rèn)為脂質(zhì)體的主要成份磷脂科與表皮脂質(zhì)層融合，改變其組成，形成一種扁平的顆粒狀結(jié)構(gòu)，使其屏障作用發(fā)生逆轉(zhuǎn)，載藥脂質(zhì)體則可順利通過表皮[17]。穿透機(jī)制認(rèn)為由于皮膚表面和內(nèi)部存在的水濃度差異能為脂類載體穿透皮膚提供動(dòng)力來(lái)源，這就使得脂質(zhì)體能順利穿脫皮膚。在本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)輔酶Q10脂質(zhì)體能順利透過皮膚，發(fā)會(huì)輔酶Q10的抗紫外線損傷作用。皮膚組織生化指標(biāo)結(jié)果顯示，輔酶Q10脂質(zhì)體小鼠皮膚組織MDA含量明顯降低，SOD與谷胱甘肽活力明顯升高，而TiO2組小鼠皮膚組織的SOD與谷胱甘肽活力均低于COQ組（P<0.05），提示輔酶Q10能有效發(fā)揮抗紫外線作用，其作用效果比TiO2優(yōu)。輔酶Q10作為一種抗氧化劑，其可以清除皮膚組織自由基及抑制其產(chǎn)生的一系列連鎖反應(yīng)。另外從皮膚病理切片與MMP-1表達(dá)量角度來(lái)看，輔酶Q10具有抗紫外線損傷作用。MMP-1及其相關(guān)通路在皮膚光老化中起重要作用，MMP-1能特異性降解幾乎所有細(xì)胞外基質(zhì)成分，造成正常膠原成分和彈性纖維降解，導(dǎo)致皮膚光老化[18]，而有研究報(bào)道人真皮成纖維細(xì)胞在紫外線照射后主要產(chǎn)生MMP-1、MMP-3和MMP-9，并認(rèn)為它們?cè)诠饫匣倪^程中起很大的作用[19-20]。COQ組小鼠MMP-1皮膚組織MMP-1相對(duì)表達(dá)量比MOL、TiO2組低（P<0.05），提示輔酶Q10具有抗紫外線損傷作用，并且其作用比TiO2優(yōu)。

綜上所述，正交實(shí)驗(yàn)篩選出最優(yōu)處方：溫度為60℃、水相pH為7.7、輔酶Q10百分比為0.9%、PC60百分比為1.6%，輔酶Q10脂質(zhì)體能順利通過皮膚角質(zhì)層發(fā)揮抗小鼠皮膚紫外線損傷的作用，且效果比TiO2優(yōu)。

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（收稿日期：2019-08-08? 本文編輯：任秀蘭）