Legumain酶和線粒體雙級靶向去氫駱駝蓬堿脂質(zhì)體的制備及其體外特性評價

伊帕爾古麗·阿皮孜 賀宏吉 王昭志 李喆喆 卡迪熱婭·艾克拉木 白靜雅 王梅

關鍵詞去氫駱駝蓬堿;線粒體;Legumain酶;脂質(zhì)體

肝癌嚴重影響著人類的生活，其中，我國肝癌的發(fā)病例數(shù)占全球的55%[1-3]。在肝癌的藥物治療方面，由于化療藥物的全身毒性或嚴重不良反應，導致患者生存質(zhì)量下降[4]。研究與開發(fā)安全高效的藥物遞送系統(tǒng)，有望降低化療藥物毒性反應的嚴重程度，同時維持或提高治療效果。

去氫駱駝蓬堿（harmine，HM）是從駱駝蓬種子中分離出來的生物堿。研究顯示，HM通過抑制蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）磷酸化誘導膠質(zhì)母細胞瘤細胞凋亡，并通過G2 細胞周期阻滯和線粒體途徑誘導肝母細胞瘤HepG2 細胞凋亡[5-6]。然而，由于HM溶解度低且在大劑量下易引起神經(jīng)毒性，導致其臨床應用受限。線粒體是一種高度活躍的細胞器，通過不斷分裂和融合來維持細胞的正常生理功能[7]。線粒體動力學失調(diào)通常會影響腫瘤細胞的能量供應、氧化還原信號和代謝功能。由于線粒體的功能障礙在腫瘤發(fā)展中起著至關重要的作用，已被確定為治療腫瘤的關鍵靶點[8]。Legumain酶，又稱天冬酰胺內(nèi)肽酶，屬于半胱氨酸蛋白酶家族，最初發(fā)現(xiàn)于豆類植物[9]。研究表明，Legumain 酶在不同類型的實體腫瘤中表達上調(diào)，其水平與腫瘤的惡性潛能呈正相關[10]。KA肽由Legumain 酶響應氨基酸序列和線粒體靶向肽KLA 序列組成，其雙級靶向特點有待進一步考察[11-12]。

為提高HM進入腫瘤細胞及其線粒體的效率，降低HM的毒副作用，本研究以大豆磷脂（soybean phospholipid，SPC）、二棕櫚酰磷脂酰膽堿（dipalmitoyl phosphatidylcholine，DPPC）、膽固醇（cholesterol，Chol），以及KA肽偶聯(lián)的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000-KA）為材料負載HM，得到Legumain 酶和線粒體雙級靶向HM脂質(zhì)體（KA@HM-LPS），并對其制劑學特性、體外抗腫瘤作用及生物相容性進行初步評價，以期為后續(xù)研究提供實驗基礎。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究的主要儀器有UV-2700 型紫外可見分光光度計[島津（上海）實驗器材有限公司]，R-2003 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHZ-95B型循環(huán)水式多用真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司），HWS-24 型電子恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司），KQ5200DE型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），BSA124S型電子分析天平（德國Sartorius 公司），3-18KS 型臺式高速冷凍離心機（美國Sigma 化學公司），VCX500 型超聲波破碎儀（美國Sonics公司），610000 型微型脂質(zhì)體擠出器（美國Avanti 公司，孔徑為100 nm 的聚碳酸酯膜），PHSJ-3F 型pH 計（上海雷磁創(chuàng)益儀器儀表有限公司），Nano ZS 型納米粒徑儀（英國Malvern 公司），Modulyo 型真空冷凍干燥機、371型CO2培養(yǎng)箱、HerasafeTM KS 型Ⅱ級生物安全柜（美國Thermo Fisher Scientific 公司），85-2 型恒溫磁力攪拌器（常州金壇精達儀器制造有限公司），ZWYR-D2402 型恒溫振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司），Victor Nivo型多功能酶標儀（美國PerkinElmer 公司），JEM-1230 型透射電鏡[JEOL 捷歐路（北京）科貿(mào)有限公司]，ECLIPSE Ti 型激光共聚焦顯微鏡[Nikon 儀器（上海）有限公司]，SX-500型全自動高壓滅菌鍋（日本Tomy DigitalBiology公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究的主要藥品與試劑有HM標準品（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號Q041-180308，高效液相色譜法測得含量>98%），SPC[艾偉拓（上海）醫(yī)藥科技有限公司，批號SY-SO-200401]，二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000（DSPE-mPEG2000）、DPPC、Chol（西安瑞禧生物科技有限公司，批號分別為LP-R4-039、CC0657、RA0200624），胎牛血清、青霉素、鏈霉素溶液、胰酶MEM培養(yǎng)基（美國Gibco 公司，批號分別為2173969RP、2129299、2186962、8121247），磷酸鹽緩沖液（PBS，美國Hyclone 公司，批號AG29574691），Dil 細胞膜紅色熒光探針（ 上海碧云天生物技術有限公司，批號010421210629），MitoLite Blue FX490 線粒體藍色熒光染料（美國AAT Bioquest 公司，批號1771462），CCK-8 試劑盒（ 北京博奧森生物技術有限公司，批號BA03175388），基質(zhì)膠[ 康寧（上海）有限公司，批號1060001]，甲醇（天津市化學試劑有限公司，批號20211101410），DSPE-PEG2000-KA（本實驗室自制，批號20210828），其余試劑均為分析純。

1.3 細胞與動物

人正常肝癌細胞SK-Hep-1購自武漢普諾賽生命科技有限公司;Legumain 酶過表達的人肝癌細胞SK-Hep-1（LGMN+-SK-Hep-1）在本實驗室通過慢病毒介導轉(zhuǎn)染的方法獲得[13];人正常肝細胞LO2 由新疆醫(yī)科大學藥學院艾尼娃爾·艾克木教授課題組贈送;雄性BALB/c裸鼠（8周齡，22～24 g，生產(chǎn)許可證SCXK-2016-0006）購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 HM含量測定方法的建立

2.1.1 HM標準曲線的建立精密稱取HM標準品10mg，用甲醇溶解，并定容至10 mL，制成質(zhì)量濃度為1mg/mL的HM標準品貯備液。將其用甲醇稀釋，制得質(zhì)量濃度為10 μg/mL的HM標準品溶液，置于紫外可見分光光度計上進行全波長掃描。結(jié)果顯示，HM在240、300 nm 波長處均有較高的吸收，但是240 nm 波長接近于紫外末端，因此，選擇300 nm作為檢測HM含量的最佳吸收波長。將HM標準品溶液用甲醇稀釋得到質(zhì)量濃度為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 μg/mL 的系列溶液，分別于300 nm波長處測定吸光度（A）值，以A值對質(zhì)量濃度（C）進行線性回歸，得HM的回歸方程為A=0.082 8C+0.005 2（R2=0.999 5），表明HM檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為1～10 μg/mL。

2.1.2 方法學考察（1）精密度試驗：將“2.1.1”項下制備的HM標準品溶液用甲醇稀釋到質(zhì)量濃度分別為4、6、8 μg/mL（低、中、高濃度），在300 nm波長處分別于0、12、24 h 檢測以考察日內(nèi)精密度，于0、24、48、72 h 檢測以考察日間精密度，結(jié)果顯示，低、中、高濃度HM的日內(nèi)精密度RSD 分別為0.26%、0.25%、0.41%，日間精密度RSD 分別為0.48% 、0.17% 、0.87% ，均小于2.00%（n=6），說明方法的精密度良好。（2）穩(wěn)定性試驗：取“2.2.1”項下采用薄膜分散法結(jié)合擠出法制備的KA@HM-LPS 1 mL，分別在室溫條件下放置0、2、4、8、16、24 h 后，用甲醇溶解并定容至50 mL，在300 nm波長處測定A 值。結(jié)果顯示，A 值的RSD 為1.97%，小于2.00%（n=6），說明方法的穩(wěn)定性較好。（3）重復性試驗：取“2.2.1”項下采用薄膜分散法結(jié)合擠出法制備的KA@HM-LPS 100 μL，用甲醇溶解并定容至5 mL，在300 nm 波長處測定A 值。結(jié)果顯示，A 值的RSD 為1.74%，小于2.00%（n=6），說明方法的穩(wěn)定性較好。（4）加樣回收率試驗：從“2.1.1”項下制備的HM標準品貯備液中分別精密量取0.2、0.3、0.4 mL 置于50 mL 容量瓶中，各加0.5 mL 空白脂質(zhì)體（KA@BLPS），用甲醇定容至刻度，得到HM質(zhì)量濃度分別為4、6、8 μg/mL（低、中、高濃度）的供試品溶液。檢測300 nm波長處的A 值，以評價加樣回收率。結(jié)果顯示，低、中、高濃度HM對應的加樣回收率（n=3）分別為（99.30±0.47）%、（101.00±1.40）%和（104.10±0.33）%，表明方法的準確度較好[14]。

2.2 KA@HM-LPS制備方法的選擇

2.2.1 KA@HM-LPS 的制備分別采用逆相蒸發(fā)法、pH梯度法和薄膜分散法制備KA@HM-LPS。（1）逆相蒸發(fā)法：按照質(zhì)量比10 ∶10 ∶5 ∶1 ∶1，精密稱取SPC、DPPC、Chol、DSPE-PEG2000-KA 和HM 標準品，用適量有機相（氯仿-甲醇混合液，體積比2 ∶1，下同）溶解，加入有機相1/3 體積的去離子水，冰浴超聲2 h（100 W），減壓旋蒸（壓力0.05 MPa，轉(zhuǎn)速100 r/min，下同）至有機溶劑除盡[15]，用微型脂質(zhì)體擠出器擠出3 次，得KA@HM-LPS。（2）pH 梯度法：按照質(zhì)量比10 ∶ 10 ∶ 5 ∶ 1 ∶ 1，精密稱取SPC、DPPC、Chol、DSPE-PEG2000-KA和HM標準品，用適量有機相溶解，減壓旋蒸形成干燥的脂膜，加入有機相1/3 體積的檸檬酸緩沖液（濃度為50 mmol/L），此時的pH值為2.0;超聲水合30 min（100 W），形成的混懸液用碳酸鈉緩沖液（濃度為150 mmol/L）調(diào)節(jié)pH值至7.0，磁力攪拌（室溫，轉(zhuǎn)速200 r/min）2 h，微型脂質(zhì)體擠出器擠出3 次，得KA@HM-LPS[16]。（3）薄膜分散法：按照質(zhì)量比10 ∶ 10 ∶ 5 ∶ 1 ∶ 1，精密稱取SPC、DPPC、Chol、DSPEPEG2000-KA和HM標準品，用適量有機相溶解，減壓旋蒸形成干燥的脂膜，加入有機相1/3 體積的去離子水，超聲水合30 min（100 W），用微型脂質(zhì)體擠出器擠出3 次，得KA@HM-LPS[17]。

2.2.2 脂質(zhì)體的表征分別對逆相蒸發(fā)法、pH 梯度法和薄膜分散法制備的KA@HM-LPS進行表征。（1）分離效率的測定：精密稱取HM標準品5 mg，加入KA@BLPS5 mL，超聲5 min，使之混勻，得到質(zhì)量濃度為1 mg/mL的HM物理混合液。取HM物理混合液1 mL，置于超濾離心管（截留分子量為10 kDa）中，離心2 次（轉(zhuǎn)速6 000r/min，每次20 min），每次離心前加入去離子水1 mL，混勻3 次。離心結(jié)束后，將外管中的游離藥物用甲醇定容至5 mL，測定HM的濃度，采用分離效率評價方法的可行性。根據(jù)公式① 計算得到分離效率為（97.00 ±1.67）%，說明超濾法適用于游離HM 與脂質(zhì)體的分離[18]。因此，采用超濾法測定包封率。（2）包封率的測定：精密量取KA@HM-LPS 1 mL，與上述同法測定其游離藥物的量（W游離）;另取1 mL KA@HM-LPS，用甲醇破乳并定容至50 mL，測定總藥物的量（W總），根據(jù)公式②計算包封率。（3）載藥量的測定：精密量取KA@HM-LPS1 mL，冷凍干燥24 h，通過減重法測定KA@HM-LPS的量（WKA@HM-LPS），根據(jù)公式③計算載藥量。（4）取0.5 mLKA@HM-LPS，加0.5 mL 去離子水混勻，分別測定粒徑、多分散系數(shù)（polydispersity index，PDI）和Zeta電位。

數(shù)據(jù)分析應用SPSS 26.0 軟件，計量資料以x±s 表示;組間對比時，數(shù)據(jù)首先采用單因素方差分析，而后采用Tukey HSD事后檢驗，并采用Bonferroni 法校正顯著性水平的Tukey HSD事后檢驗結(jié)果，檢驗水準α=0.05。結(jié)果顯示，逆相蒸發(fā)法、pH梯度法和薄膜分散法制備的KA@HM-LPS包封率及載藥量差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001），而粒徑差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。其中，薄膜分散法制備的KA@HM-LPS包封率和載藥量最高（表1），因此，選擇薄膜分散法制備KA@HM-LPS用于后續(xù)實驗。根據(jù)薄膜分散法制備的KA@HM-LPS呈負電荷，說明其在體內(nèi)的毒性可能較低。KA@HM-LPS原液（未經(jīng)過稀釋的脂質(zhì)體）借助透射電鏡觀察其形態(tài)，如圖1 所示。由圖1 可見，KA@HM-LPS呈類圓形，粒徑大小跟粒徑儀測定的平均粒徑相差不大[19]。另外，將KA@HM-LPS材料中的DSPE-PEG2000-KA 替換成DSPE-mPEG2000，按KA@HM-LPS 相同的制備方法制備未修飾脂質(zhì)體（HM-LPS）。

2.3 KA@HM-LPS均質(zhì)化方法的選擇

分別采用探針超聲法和擠出法進行KA@HM-LPS均質(zhì)化。（1）探針超聲法：將KA@HM-LPS置于冰浴中，探針超聲10 min（150 W，工作3 s、停止2 s），共3 次。（2）擠出法：將KA@HM-LPS在37 ℃保溫條件下用微型脂質(zhì)體擠出3 次。分別比較2 種方法所得KA@HM-LPS的粒徑和包封率。數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計方法同“2.2.2”項下。結(jié)果顯示，與探針超聲法相比，擠出法處理的KA@HMLPS包封率較低、粒徑較小（P<0.01），因此，本研究選擇擠出法作為均質(zhì)化方法用于后續(xù)實驗。結(jié)果見圖2。

2.4 KA@HM-LPS的血清穩(wěn)定性評價

首先，取KA@HM-LPS 5 mL，依次在- 20 ℃ 和- 80 ℃ 冰箱中各預凍12 h;放入冷凍干燥機中，于- 55 ℃減壓條件下干燥24 h，得KA@HM-LPS 凍干粉。精密稱取1 mg KA@HM-LPS凍干粉，混懸在3 mL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫孵育24 h，模擬生理環(huán)境。分別在第0、1、2、4、6、8、10、12、24 h 時測定KA@HM-LPS 的粒徑，觀察血清對KA@HM-LPS 穩(wěn)定性的影響[20]。結(jié)果顯示，KA@HM-LPS的粒徑在12 h后幾乎未再變大，說明穩(wěn)定性良好。結(jié)果見圖3。

2.5 KA@HM-LPS的血漿穩(wěn)定性評價

為評價KA@HM-LPS 的血漿穩(wěn)定性，測定其在20%血漿中的體外釋放率。通過眼眶取血法從BALB/c裸鼠采集全血，將1 mL 裸鼠全血（加抗凝劑）以2 500r/min 離心10 min，吸取最上層的血漿部分，并用生理鹽水按照1 ∶ 5 稀釋，得到20%的血漿樣本。將“2.4”項下KA@HM-LPS 凍干粉和游離HM 分別混懸在20%的BALB/c裸鼠血漿中，調(diào)節(jié)HM的質(zhì)量濃度為100 μg/mL，體積為2 mL，放入透析袋內(nèi)（截留分子量為14 kDa），兩端系好，置于含40 mL 等滲PBS（pH=7.4）的50 mL EP管中，在37 ℃恒溫條件下以150 r/min 振搖。分別在第1、2、4、6、8、10、12、24、48、72 h 取樣1 mL（每次取樣后補充同溫、等體積、等滲PBS），加甲醇1 mL混勻，采用紫外分光光度法測定HM的含量，計算體外釋放率[14]。結(jié)果顯示，KA@HM-LPS的體外釋放率在72 h 時為（90.80±1.28）%，而HM在24 h 時已達到（91.00±1.18）%，詳見圖4。此外，將KA@HM-LPS的體外釋放曲線分別與零級、一級、Higuchi 和Weibull 函數(shù)方程擬合，其擬合優(yōu)度分別為0.767 1、0.988 9、0.921 3 和0.996 3，體外釋放曲線更符合Weibull 分布，說明KA@HM-LPS 具有緩釋效果。

2.6 KA@HM-LPS的毒性評價

2.6.1 血液相容性為預測KA@HM-LPS在體內(nèi)的血液相容性，測定其在2%紅細胞懸液中的溶血百分數(shù)。通過眼眶取血法從BALB/c 裸鼠采集抗凝全血1 mL，離心數(shù)次（轉(zhuǎn)速2 500 r/min，時間10 min），每次離心前均去掉上清液，加生理鹽水混勻。當上清液變得無色透明時，加入生理鹽水定容至50 mL，得到2%紅細胞懸液。將“2.4”項下KA@HM-LPS凍干粉用生理鹽水制成質(zhì)量濃度為40、80、120、160、200 μg/mL 的混懸液，加入等體積的2%紅細胞懸液，于37 ℃保溫孵育2 h。陽性對照為去離子水，陰性對照為生理鹽水。以200 r/min 離心5min，取上清液，采用紫外可見分光光度計在416 nm 波長處測定A值，根據(jù)公式④計算溶血百分數(shù)[21-22]。各質(zhì)量濃度（以HM計算）KA@HM-LPS 的溶血百分數(shù)分別與游離HM（質(zhì)量濃度為40 μg/mL）對比。

2.6.2 KA@BLPS 對正常肝細胞存活率的影響為考察KA@BLPS 對正常肝細胞的毒性，將人正常肝細胞LO2 按照5 000 個/孔接種至96 孔板中，并在5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。按照不同質(zhì)量濃度[0（空白）、25、50、100、200、400 μg/mL]加入KA@BLPS，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。另設空白調(diào)零組，不加細胞和藥物，只加培養(yǎng)基。每個孔中加入10 μL CCK-8 孵育2 h，采用酶標儀在450nm波長處測定A值，并根據(jù)公式⑤計算細胞存活率。結(jié)果顯示，當KA@BLPS 的質(zhì)量濃度達到400 μg/mL 時，LO2 細胞的存活率為（94.40±6.12）%，說明載體的毒性很小，生物相容性較好。結(jié)果見圖5A。

本課題組前期研究顯示，Legumain 酶在肝癌細胞中的表達量低于在肝癌組織中的表達量[13]。為進行KA@HM-LPS 的體外特性評價，本研究采用Legumain酶過表達人肝癌細胞系。取人正常肝癌細胞SK-Hep-1和LGMN+-SK- Hep-1，分別按照5 000 個/孔接種至96 孔板中，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。按照不同質(zhì)量濃度[0（ 空白）、20、40、60、80、100 μ g/mL] 加入KA@HM-LPS，孵育48 h。每個孔中加入10 μL CCK-8孵育2 h，采用酶標儀在450 nm波長處測定A值，并根據(jù)公式⑤計算細胞存活率[24]。

數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計方法同“2.2.2”項下。結(jié)果顯示，LGMN+-SK-Hep-1 的細胞存活率要顯著低于SK-Hep-1（P<0.001），表明KA@HM-LPS 對LGMN+-SK-Hep-1細胞的抑制作用顯著大于SK-Hep-1 細胞，初步說明KA@HM-LPS 具有顯著的Legumain 酶響應性。結(jié)果見圖5B。

2.8 Legumain 酶過表達對KA@HM-LPS線粒體靶向性的影響

由于HM無自發(fā)熒光特性，為觀察KA@HM-LPS被KA肽介導細胞的攝取和定位情況，將HM替換成Dil 細胞膜紅色熒光探針，采用與KA@HM-LPS相同的制備方法得到Dil 負載的KA 肽修飾脂質(zhì)體（KA@Dil-LPS）。取SK-Hep-1 和LGMN+-SK-Hep-1 細胞，分別接種到Confocal 皿中，每皿1×104個細胞，在5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)12 h。加入KA@Dil-LPS 孵育6 h，其中Dil 的終濃度為2 μmol/L[25]。將細胞用預熱的無血清胰酶MEM培養(yǎng)基清洗3 次，根據(jù)MitoLite Blue FX490 線粒體藍色熒光染料試劑盒檢測結(jié)果標記各組細胞的線粒體，置于共聚焦顯微鏡下觀察KA@HM-LPS 在2 種細胞中的攝取情況與線粒體靶向性[26]。結(jié)果顯示，在Legumain 酶過表達的LGMN+-SK-Hep-1 細胞中，KA@Dil-LPS 更多地被細胞攝取，且特異性地聚集在線粒體膜上和線粒體內(nèi)，這說明KA@HM-LPS 具有Legumain 酶響應性線粒體靶向特點，其可以被Legumain酶過表達的癌細胞特異性攝取，并靶向至癌細胞的線粒體。結(jié)果見圖6。

2.9 KA@HM-LPS對肝癌細胞遷移和侵襲的影響

腫瘤細胞的遷移和侵襲是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復發(fā)的重要原因[27]。本研究通過Transwell 實驗分別測定KA@HM-LPS對LGMN+-SK-Hep-1 細胞遷移和侵襲的影響。

2.9.1 細胞遷移實驗將LGMN+-SK-Hep-1 細胞重懸于無血清胰酶MEM培養(yǎng)基中，按照1×104個/孔接種至Transwell 小室。將細胞分為空白對照組（加入無血清胰酶MEM培養(yǎng)基）、HM組、未修飾脂質(zhì)體（HM-LPS）組和KA@HM-LPS組，其中涉及HM的終濃度均為20 μmol/L（劑量依據(jù)來源于前期預實驗）。下室加入20%胎牛血清600 μL，在5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)48 h。上室用PBS 洗3 次，4%多聚甲醛固定20 min，結(jié)晶紫染色20min，PBS洗3 次，晾干，拍照[28]。Transwell 實驗圖片分析應用Image J 1.53 軟件，實驗數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計同“2.2.2”項下。結(jié)果顯示，KA@HM-LPS對LGMN+-SK-Hep-1 細胞遷移的抑制作用顯著高于HM-LPS（P<0.001）。結(jié)果見圖7、圖8A。這說明KA@HM-LPS 可以更好地抑制Legumain酶過表達癌細胞的遷移。

2.9.2 細胞侵襲實驗Transwell 上室先用50 μL 基質(zhì)膠（V 基質(zhì)膠∶VPBS=1 ∶8）鋪膠，4 ℃過夜，再水化。后續(xù)實驗步驟同“細胞遷移實驗”。結(jié)果顯示，KA@HM-LPS對LGMN+-SK-Hep-1 細胞侵襲的抑制作用顯著高于HM-LPS（P<0.001），結(jié)果見圖8B、圖9。這說明KA@HM-LPS 可以更好地抑制Legumain 酶過表達癌細胞的侵襲。

3 討論

引起肝癌的主要危險因素有乙型肝炎、丙型肝炎、非酒精性脂肪肝、肝硬化等各種慢性肝損傷[29]。由于肝癌早期癥狀不明顯，確診時通常已擴散到肝實質(zhì)外[26]。生物堿作為一類天然中藥成分，具有抑制腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移、血管生成，改變細胞形態(tài)，促進細胞凋亡和自噬，觸發(fā)細胞周期阻滯，調(diào)節(jié)多種癌相關基因和通路等抗腫瘤作用[30]。HM雖然也具有很好的抗腫瘤作用，但存在毒性問題，故本研究制備了KA@HM-LPS。

本研究首先篩選KA@HM-LPS的制備方法和均質(zhì)化方法。結(jié)果顯示，薄膜分散法結(jié)合擠出法得到的KA@HM-LPS 呈負電荷，粒徑較小，其PDI 在0.3 左右，包封率為（90.50±0.62）%。體外釋放率是評價緩控釋制劑的重要參數(shù)之一，本研究中20%血漿中的體外釋放率結(jié)果顯示，KA@HM-LPS與HM溶液相比具有明顯的緩釋效果，體外釋放曲線更符合Weibull 分布。KA@HM-LPS 在37 ℃、10%胎牛血清中12 h 后的粒徑幾乎未再變大，表明KA@HM-LPS的血清穩(wěn)定性良好。

KA@HM-LPS在HM質(zhì)量濃度為160 μg/mL時的溶血百分數(shù)低于游離HM在質(zhì)量濃度為40 μg/mL 時的溶血百分數(shù)，說明KA@HM-LPS在體內(nèi)具有良好的血液相容性。而且，KA@BLPS 對正常肝細胞LO2 的毒性低，說明載體的生物相容性較好。但是，KA@BLPS具體對機體的安全性還需要在體內(nèi)模型中分別從血液學和組織學方面進一步評價。另外，本研究還比較了KA@HM-LPS 對LGMN+-SK-Hep-1 和SK-Hep-1 細胞的增殖抑制活性和線粒體靶向性。結(jié)果顯示，在LGMN+-SK-Hep-1 細胞中，KA@HM-LPS的抑制作用更大，且可以特異性聚集在其線粒體上。Transwell 實驗結(jié)果顯示，KA@HM-LPS對LGMN+-SK-Hep-1 細胞遷移和侵襲的抑制作用均高于HM-LPS。

綜上所述，將HM制備成KA@HM-LPS可以有效抑制Legumain酶過表達的肝癌細胞的遷移和侵襲，并提高HM的血液相容性。本研究后續(xù)將通過動物實驗進一步驗證KA@HM-LPS在體內(nèi)的安全性和靶向性，以探究該載體設計的有效性。