白及二氫菲類化合物對臨床常見病原菌作用的研究

李華，彭音，陳芳，張琴，儲士潤,2

白及［Bletilla striata（Thunb.）Rchb.f.，B.striata］屬蘭科植物，其假鱗莖是一種常用的中藥材，具有抗菌、止血、生肌等功效［1-2］。二氫菲類化合物（Dihydrophenanthropyrans）是目前研究的從白及塊莖中分離得到的含量較多的藥用成分［3］。俞杭蘇等［4］和劉珈羽等［5］的研究表明，白及主要提取物對革蘭陽性菌的抑菌活性明顯比對革蘭陰性菌的強。近年來也有研究發(fā)現(xiàn)，從白及塊莖中分離的二氫菲類化合物對白假絲酵母菌等真菌也有抑制作用，而且白及化合物的抗菌活性與其結構有關，對甲氧基化合物的抗菌作用減弱而對羥基芐化合物的抗菌活性增強［6］。但他們均未對白及二氫菲類化合物對臨床常見病原菌的抗菌性開展系統(tǒng)研究。

2017年全國細菌耐藥監(jiān)測報告給出了2017年主要臨床分離菌種分布的前20位，其中大腸埃希菌、克雷伯菌屬、不動桿菌屬、金葡菌、銅綠假單胞菌位于前五的位置，而且白假絲酵母菌也是臨床最常見的致病真菌。因此，對于這6種臨床常見病原菌的研究，以及開發(fā)針對這些病原菌的臨床新型抗生素的研究，具有重要意義。近年來，由于廣譜抗生素的不合理使用，包括醫(yī)學、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)及工業(yè)中抗生素的濫用使得臨床常見致病菌獲得性耐藥［7-9］，加上基因遷移促進細菌群體的耐藥性傳播而導致的細菌耐藥迅速蔓延［10］以及人們對耐藥菌檢測不力，導致多重耐藥菌快速增加［11］。目前，對多重耐藥菌和逆轉細菌多重耐藥性的研究已成為亟待解決的重要課題。

在前期研究中，本課題組已成功建立白及的植物組培快繁技術體系、愈傷組織誘導、原生質體誘導和培養(yǎng)基礎體系和細胞懸浮技術體系。本研究擬從優(yōu)良江油產(chǎn)白及品系的愈傷組織、懸浮培養(yǎng)細胞和三年生塊莖共3種材料中進行二氫菲類化合物成分的分離提取，進一步開展3種材料中二氫菲類成分對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌和白假絲酵母菌6種臨床菌株的抑菌作用研究，試闡釋白及二氫菲類化合物對臨床常見致病菌的藥理作用特征，為其臨床應用奠定實驗基礎，也為江油白及的藥用產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

本研究的臨床菌株，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，P.aeruginosa）、大腸埃希菌（Escherichia coli，E.coli）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia，K.pneumonia）、鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii，A.baumannii）、白假絲酵母菌（Candida albicans，C.albicans），均是在江油市第二人民醫(yī)院重癥監(jiān)護室臨床病人的痰標本中分離出來的臨床菌株，實驗時間從2017年5月至2018年5月。實驗用標準菌株：金黃色葡萄球菌（ATCC29213）、銅綠假單胞菌（ATCC27853）、大腸埃希氏菌（ATCC35218）、肺炎克雷伯菌（ATCC700603）、鮑曼不動桿菌（ATCC19606）、白假絲酵母菌（ATCC90028）由四川省臨床檢驗中心提供。實驗用抗生素藥敏紙片頭孢呋辛（Cefuroxim，CXM，30 ug/L）、頭孢曲松（Ceftriaxone，CTR，30 ug/L）、美羅培南（Meropenem，MEM，10 ug/L）、伏立康唑（Voriconazole，VOR，1 ug/L）、伊曲康唑（Itraconazole，IRC，10 ug/L），這5種抗生素為本院臨床常用抗生素。實驗用平板培養(yǎng)基為L-B培養(yǎng)基。白及蒴果和三年生塊莖采集于江油市義新鄉(xiāng)茅庵村中藥材種植地。

1.1 白及實驗材料的制備 取成熟未開裂的白及蒴果，利用白及組培快繁技術體系，誘導出白及原球莖，取一部分原球莖放入細胞懸浮培養(yǎng)技術體系，培養(yǎng)出懸浮培養(yǎng)細胞組織；另一部分原球莖繼續(xù)誘導成愈傷組織，取懸浮培養(yǎng)細胞和愈傷組織備用。將以上細胞組織和采集的三年生白及塊莖鮮品稱重，放入60℃鼓風干燥箱中烘干至恒重。然后，分別取適量干品研磨，過60目篩，得白及懸浮培養(yǎng)細胞干粉、愈傷組織干粉和塊莖干粉備用。最后，將上述各白及干粉中的二氫菲類化合物參照靳冉等的方法進行分離和測定，實驗用二氫菲類標準品為2.7-二羥基-4-甲氧基-9.10-二氫菲。

1.2 二氫菲類化合物的抗菌性鑒定和抗菌濃度篩選 按CLSI2017推薦的瓊脂稀釋法測定實驗臨床6種菌株和標準菌株的MIC值，取不同白及材料中分離獲取的二氫菲類化合物按倍比稀釋法制備瓊脂平板，使終濃度分別在0.1～10.0 mg/mL之間［5］形成11個不同的濃度梯度，菌株生長受到抑制時的濃度為最低抑菌濃度（MIC值）。試驗設三次重復，取平均值。

1.3 藥敏驗證實驗 將復蘇的菌株配置成濃度為0.5麥氏單位的菌懸液，用無菌棉簽將其均勻涂布于M-H瓊脂培養(yǎng)基上。然后在L-B平板上分別貼上頭孢呋辛，頭孢曲松，美羅培南，伏立康唑，伊曲康唑的藥敏紙片，各紙片中心相距＞24 mm，紙片距平板內(nèi)緣＞15 mm，貼上后輕輕按壓紙片表面且不可移動藥敏紙片。接著將平板置于35℃恒溫箱中培養(yǎng)，取出觀察，在24 h時用游標卡尺測量抑菌圈的直徑。試驗設三次重復，每次測量三次，取平均值。

將上述較易獲得的白及塊莖二氫菲類化合物干粉用超純水溶解，倒入M-H瓊脂培養(yǎng)基中使二氫菲類化合物的濃度為MIC值，并混勻制成含藥平板。接著采用連續(xù)劃線接種法，將已配置好的0.5麥氏單位的菌懸液涂布于加入上述培養(yǎng)基中。然后在培養(yǎng)細菌的每個平板上分別貼上頭孢呋辛，頭孢曲松，美羅培南3種抗生素藥敏紙片；在培養(yǎng)真菌的每個平板上分別貼上伏立康唑，伊曲康唑2種抗生素藥敏紙片。最后將其置于35℃恒溫箱中培養(yǎng)，取出觀察，在24 h時用游標卡尺測量抑菌圈的直徑。試驗設三次重復，每次測量三次，取平均值。實驗對比以上兩次實驗抑菌圈直徑的變化，判斷白及二氫菲類化合物是否具有逆轉臨床菌株耐藥性等作用。

1.4 統(tǒng)計學方法 所有實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件分析，實驗結果以±s表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，計算P值，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三種材料白及二氫菲類化合物含量的測定實驗稱取3種白及材料的干粉各100 g，采用高效液相色譜純化檢測后的二氫菲類化合物含量和9，10-二氫菲含量如表1所示。通過表1可以看出，每100 g白及干粉中，二氫菲類化合物含量和9，10-二氫菲含量從高到低的順序依次為：白及懸浮細胞組織＞白及塊莖＞白及愈傷組織，其中二氫菲類化合物和9，10-二氫菲含量最大的均是白及懸浮細胞組織，分別為401μg和58μg，同時3種白及材料中二氫菲類化合物含量均差異有統(tǒng)計學意義，而9，10-二氫菲含量只有愈傷組織與其他材料差異有統(tǒng)計學意義。

表1 100 g白及組織中二氫菲類化合物和9，10-二氫菲含量的檢測結果/（μg，±s）

表1 100 g白及組織中二氫菲類化合物和9，10-二氫菲含量的檢測結果/（μg，±s）

注：愈傷組織Dihs含量與懸浮細胞比較，t＝0.002，P＝0.000。9，10-Dih含量與懸浮細胞比較，t＝0.012，P＝0.001。塊莖Dihs含量與懸浮細胞比較，t＝0.004，P＝0.002。9，10-Dih含量與懸浮細胞比較，t＝0.636，P＝0.078

9，10-Dih含量58±7 29±4 51±6白及材料懸浮細胞愈傷組織塊莖Dihs含量401±14 329±11 353±13

2.2 白及二氫菲類化合物對6種菌株的最低抑菌濃度 用含不同白及材料提取的二氫菲類化合物的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)實驗用6種菌，菌株菌落的數(shù)目、大小隨著二氫菲類化合物濃度的增加而減小，當二氫菲類化合物濃度達到臨界值時，由于二氫菲類化合物對菌株的抑制作用太大而導致菌株不能生長甚至死亡。當二氫菲類化合物濃度達到抑菌濃度臨界值時，菌株大部分生長受到抑制而只有少數(shù)能夠維持基礎生長，因此培養(yǎng)皿中只有稀疏的少量菌落出現(xiàn)。白及二氫菲類化合物的最低抑菌濃度平均值如表2所示，菌落生長情況如圖1所示。

表2 三種白及組織的二氫菲類化合物對6種菌株的最低抑菌濃度（MIC）

當懸浮細胞二氫菲類化合物濃度為0.58 mg/mL時，培養(yǎng)金黃色葡萄球菌菌株的培養(yǎng)基中生長出稀疏的單菌落，甚至再培養(yǎng)基上無菌落生長，因此懸浮細胞二氫菲類化合物對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度平均值為0.58 mg/mL。同理，懸浮細胞二氫菲類化合物對銅綠假單胞菌、大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、白假絲酵母菌，最低抑菌濃度平均值依此為1.65 mg/mL、1.23 mg/mL、1.39 mg/mL、1.73 mg/mL、3.10 mg/mL。通過表2還可以看出，不同種材料的二氫菲類化合物對菌株的MIC平均值最小值和最大值也不盡相同，例如金黃色葡萄球菌MIC最小值為懸浮細胞是0.58 mg/mL、最大值為塊莖二氫菲類化合物是0.62 mg/mL，而白假絲酵母菌MIC平均值最小值為愈傷組織是3.07 mg/mL、最大值為懸浮細胞二氫菲類化合物是3.10 mg/mL，同時，同種白及材料的二氫菲類化合物對不同種菌株的最低抑菌濃度差異有統(tǒng)計學意義，而3種白及材料的二氫菲類化合物對每種菌株的最低抑菌濃度差異無統(tǒng)計學意義。

通過表2還可以看出，白及二氫菲類化合物對金黃色葡萄球菌的MIC值最小，即對金黃色葡萄球菌抑菌作用最強，而對白假絲酵母菌的MIC值最大，即對白假絲酵母菌抑菌作用最弱。同時，二氫菲類化合物對銅綠假單胞菌等臨床常見的革蘭陰性桿菌均具有一定的抑制作用，其中對大腸埃希氏菌的抑菌作用最強（圖1）。

從實驗結果還可以看出，二氫菲類化合物對臨床菌株的抑制作用較強，而對標準菌株抑制作用較弱。

表3 二氫菲類化合物作用前6種菌株對抗生素敏感性結果分析/（mm，±s）

表3 二氫菲類化合物作用前6種菌株對抗生素敏感性結果分析/（mm，±s）

注：表中“—”表示未檢測此項數(shù)據(jù)

菌株 藥敏圈直徑VOR IRC金黃色葡萄球菌ATCC29213銅綠假單胞菌ATCC27853大腸埃希氏菌ATCC35218肺炎克雷伯菌ATCC700603鮑曼不動桿菌ATCC19606白假絲酵母菌ATCC90028 CXM 33.6±2.0 34.1±2.5— —21.3±0.1 25.7±0.7 16.8±6.2 23.2±1.3 15.6±0.2 19.5±2.1 CTR 32.0±1.6 32.0±2.5 19.2±0.8 26.6±0.8 31.7±2.1 37.9±1.1 28.0±2.0 32.0±2.1 16.0±0.4 22.5±1.0 MEM 19.2±0.1 32.8±0.8 12.1±0.4 20.3±0.8 28.9±1.0 25.3±0.2 25.0±0.8 25.8±0.8 18.4±0.6 20.5±2.5————17.8±0.4 18.9±0.2— —— ———14.7±0.5 16.1±0.4

表4 二氫菲類化合物作用后6種菌株對抗生素敏感性結果分析/（mm，±s）

表4 二氫菲類化合物作用后6種菌株對抗生素敏感性結果分析/（mm，±s）

注：表中“—”表示未檢測此項數(shù)據(jù)

菌株 藥敏圈直徑IRC CTR 34.4±1.1 36.4±0.1 20.8±2.3 27.2±0.6 34.3±1.1 39.2±1.4 28.1±1.9 33.1±1.1 16.6±1.1 27.6±1.6 CXM 34.7±0.7 35.7±0.6 MEM 20.6±0.1 36.1±3.2 16.3±4.1 19.3±0.8 28.3±0.2 25.3±0.2 30.5±1.1 27.7±0.8 18.3±0.7 18.0±1.1 VOR金黃色葡萄球菌ATCC29213銅綠假單胞菌ATCC27853大腸埃希氏菌ATCC35218肺炎克雷伯菌ATCC700603鮑曼不動桿菌ATCC19606白假絲酵母菌ATCC90028— —25.6±1.6 27.6±1.4 22.6±2.0 24.9±0.6 17.1±0.7 23.1±1.4————21.3±0.7 19.4±0.1— —— —— —19.1±0.8 18.2±0.1

2.3 菌株藥物敏感性實驗結果分析 白及塊莖的二氫菲類化合物對菌株作用前后，6種菌株對抗生素藥物的敏感性變化情況如表3和表4所示。從兩個表中可以看出，二氫菲類化合物作用金黃色葡萄球菌后使其頭孢呋辛、頭孢曲松、美羅培南的抑菌圈直徑分別從33.6 mm、32.0 mm、19.2 mm增加到34.7 mm、34.4 mm、20.6 mm，肺炎克雷伯菌、白假絲酵母菌和金黃色葡萄球菌表現(xiàn)相似，其中對白假絲酵母菌作用最為顯著，抑菌圈直徑平均增加了4.4±0.3 mm；而當二氫菲類化合物作用于大腸埃希氏菌、鮑曼不動桿菌的美羅培南后，其抑菌圈直徑分別從28.9 mm、18.4 mm降低到28.3 mm、18.3 mm。

在本研究中，我們可以推測二氫菲類化合物可以增強金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌對頭孢呋辛，頭孢曲松，美羅培南3種抗生素的敏感性，也可以增強白假絲酵母菌對伏立康唑，伊曲康唑的敏感性，但影響白假絲酵母菌對抗生素敏感性的增強作用沒有對金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌等細菌的作用強。同時，對作用于大腸埃希氏菌、鮑曼不動桿菌的抗生素美羅培南，二氫菲類化合物表現(xiàn)出的是降低了細菌對美羅培南敏感性的作用。還可以發(fā)現(xiàn)白及二氫菲類化合物可以使一些抗生素對金黃色葡萄球菌（2A）、銅綠假單胞菌（2B）、大腸埃希氏菌（2C）、肺炎克雷伯菌（2D）的抑菌圈由耐藥狀態(tài)變?yōu)槊舾谢蛑薪闋顟B(tài)。見圖2。

綜上所述，二氫菲類化合物有增強臨床常見病原菌對抗生素敏感性的作用，但是對某些抗生素，二氫菲類化合物也有降低常見病原菌對抗生素的敏感性的作用，同時也具有逆轉常見病原菌耐藥性的作用。

3 討論

在白及二氫菲類化合物含量測定的實驗中，發(fā)現(xiàn)二氫菲類化合物含量和9，10-二氫菲含量最高的均是白及懸浮細胞組織，而且實驗中從白及懸浮細胞組織材料中提取出的二氫菲類化合物對臨床常見病原菌的作用與其他材料無差異。實驗用白及懸浮細胞組織是通過前期構建的植物細胞懸浮培養(yǎng)技術體系的培養(yǎng)，經(jīng)過分離、提純得到的細胞組織，具有分散性好、細胞形態(tài)均一、生長迅速、重復性好、易于控制等特點［12-13］。因此，白及懸浮細胞組織可用于白及藥理作用成分的大規(guī)模工廠化生產(chǎn)及作為轉變白及藥用活性成分生產(chǎn)方式的物質基礎，也可作為胚性材料用于植物遺傳育種和植物生長發(fā)育等研究［14］。因此，將白及懸浮細胞組織作為白及植株的替代品，從中獲得藥用活性成分含量高的實驗研究性材料和應用于醫(yī)藥領域的藥源性材料，具有重大應用價值和廣闊的市場前景，同時對于白及的資源保護、開發(fā)利用及可持續(xù)發(fā)展有著重要的促進意義。

在白及二氫菲類化合物抑菌作用的研究中，發(fā)現(xiàn)二氫菲類化合物具有較強的抑制臨床常見病原菌生長的作用，并且二氫菲類化合物對革蘭陽性菌的抑菌活性比對革蘭陰性菌的強，對真菌的抑制作用較弱，這與俞杭蘇等［4］、劉珈羽等［5］的研究結果類似。但在本研究中，實驗系統(tǒng)具體的研究了江油地區(qū)白及3種材料中二氫菲類有關成分對臨床常見病原菌金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、白假絲酵母菌的抑菌特點和MIC值，這為江油地區(qū)白及藥用活性成分的臨床應用研究提供了數(shù)據(jù)支撐和理論依據(jù)。同時，我們還發(fā)現(xiàn)江油地區(qū)白及二氫菲類化合物對金黃色葡萄球菌、鮑曼不動桿菌的抑制作用比對銅綠假單胞菌、大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、白假絲酵母菌的抑制作用強，而且還發(fā)現(xiàn)白及二氫菲類化合物對臨床菌株的抑制作用較強，而對標準菌株抑制作用較弱（表2，圖1），這與前人的研究結果有不同的地方，這可能與中草藥白及種質、有效成分提取方法、菌種及病原菌的臨床菌株耐藥性等因素有關［15-16］。

本研究還發(fā)現(xiàn)，白及二氫菲類化合物具有增強某些抗生素對臨床病原菌的作用，同時也具有逆轉常見病原菌對某些抗生素耐藥性的作用。近年來，臨床病原菌的多重耐藥問題，已經(jīng)成為現(xiàn)在微生物專業(yè)研究的熱點問題［17-19］。二氫菲類化合物是白及天然活性成分，具有綠色、安全、高效、毒副作用小等優(yōu)點［20］，同時本研究證實了白及二氫菲類化合物具有逆轉金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯菌等病原菌耐藥性的作用，這無疑為解決臨床病原菌多重耐藥的問題提供了新的解決問題的思路。但是白及二氫菲類化合物是否具有逆轉細菌多重耐藥性以及其逆轉多重耐藥性機制和抑制細菌生長機制，還有待進一步實驗探索。

本實驗通過白及二氫菲類化合物同病原菌共培養(yǎng)來驗證二氫菲類化合物的抑菌作用，實驗中二氫菲類化合物需經(jīng)過高溫高壓滅菌的過程，這可能導致其藥理活性的改變，加之實驗中采用的提取方法會導致白及有效成分提取不充分，一定程度上會影響實驗的結果。但由于本實驗重復次數(shù)較多，實驗數(shù)據(jù)龐大，經(jīng)統(tǒng)計學分析，排除95%CI之外的數(shù)據(jù)，因此，實驗結果準確可靠。本研究結果為具有抑菌作用中草藥應用于臨床病原菌研究以及中草藥有效成分作為新型抗生素原材料的研究奠定了理論和實驗基礎。

（本文圖1，2見插圖4-4）

圖1 含白及二氫菲類化合物的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)實驗用6種菌株的平板圖：1A為金黃色葡萄球菌，1B為銅綠假單胞菌，1C為大腸埃希菌，1D為肺炎克雷伯菌，1E為鮑曼不動桿菌，1F為白假絲酵母菌

圖2 白及二氫菲類化合物對金黃色葡萄球菌（2A）、銅綠假單胞菌（2B）、大腸埃希菌（2C）、肺炎克雷伯菌（2D）逆轉耐藥性對比圖