山慈菇通過PI3K/Akt信號通路影響乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖和凋亡①

興 偉 劉 遠 徐 曌 徐志峰 宋易華

(河北省中醫(yī)院外一科,石家莊 050000)

乳腺癌是女性較為常見的惡性腫瘤之一，對女性患者的生命健康造成嚴(yán)重危害。中醫(yī)在我國治療惡性腫瘤方面積累了豐富的臨床經(jīng)驗，多種中藥成分具有抗腫瘤作用。山慈菇藥性甘、微辛，具有解毒消腫、化痰散結(jié)的功效，在抑制新生血管生成和抗腫瘤方面也具有重要作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)山慈菇在胃癌、大腸癌、食管癌、肺癌等多種惡性腫瘤的治療中具有抗腫瘤作用，對乳腺癌細(xì)胞的生長也有抑制作用[2]。但山慈菇抑制乳腺癌細(xì)胞生長的機制尚不清楚。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路在多種惡性腫瘤的生長、耐藥、轉(zhuǎn)移等方面具有重要作用，在乳腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲方面也發(fā)揮重要作用[3,4]。本文對山慈菇對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖、凋亡及PI3K/Akt信號通路的影響進行研究，探討山慈菇是否通過PI3K/Akt信號通路影響乳腺癌細(xì)胞的增殖和凋亡，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1材料 藥物：山慈菇(北京同仁堂藥店)，乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞(中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫)，胰島素生長因子1(IGF-1)、二甲基亞砜、噻唑藍(MTT)、膜聯(lián)蛋白-異硫氰酸熒光素(Aneexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡試劑盒、二奎啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒(美國Sigma公司)，RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、RIPA裂解液、化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色液(美國Gibco公司)，兔抗人活化的半胱天冬3(Cleaved-Caspase-3)多克隆抗體、兔抗人Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)多克隆抗體、兔抗人B-細(xì)胞淋巴瘤因子(Bcl-2)多克隆抗體、兔抗人PI3K多克隆抗體、兔抗人磷酸化-PI3K(p-PI3K)多克隆抗體、兔抗人Akt多克隆抗體、兔抗人p-Akt多克隆抗體、β-actin、羊抗兔二抗(美國Abclonal公司)等。

1.2方法

1.2.1山慈菇提取液制備 將山慈菇粉碎，用去離子水浸泡2 h，水煎法制備山慈菇提取液，提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮，制備山慈菇提取液濃度為1 g/ml，高壓滅菌后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2MTT法測定MDA-MB-231細(xì)胞增殖 將山慈菇提取液用培養(yǎng)基分別稀釋為0 mg/ml(只含培養(yǎng)基，不加山慈菇提取液)、5 mg/ml、10 mg/ml、 20 mg/ml、40 mg/ml、80 mg/ml。將MDA-MB-231細(xì)胞接種到6孔板上(濃度為1×105ml-1)，每孔接種100 μl，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加入上述各濃度的山慈菇提取液，每種濃度設(shè)7個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后加入MTT(5 mg/ml)15 μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，加入二甲基亞砜孵育10 min，酶標(biāo)儀測定波長490 nm處吸光度值(OD)，計算細(xì)胞抑制率，細(xì)胞抑制率=(1-觀察組OD值/空白對照組OD值)×100%。計算山慈菇提取液的半數(shù)抑制濃度(IC50)為10.32 mg/ml，故取山慈菇提取液濃度為10 mg/ml進行后續(xù)實驗。按上述實驗方法測定加入10 mg/ml山慈菇培養(yǎng)0 h、24 h、72 h時MDA-MB-231細(xì)胞的增殖抑制率。

1.2.3細(xì)胞分組和處理 將生長良好的MDA-MB-231細(xì)胞分為對照組(C組)、山慈菇組(CAM組)、胰島素生長因子1組(IGF-1組)、山慈菇+胰島素生長因子1組(CAM+IGF-1組)。C組不加藥物處理，CAM組加入10 mg/ml山慈菇處理，IGF-1組加入100 μg/L IGF-1處理，CAM+IGF-1組加入10 mg/ml山慈菇和100 μg/L IGF-1共處理。

1.2.4MTT法測定各組細(xì)胞增殖 取上述各組生長良好的MDA-MB-231細(xì)胞，采用MTT法測定細(xì)胞OD值(方法同上)，每組設(shè)7個復(fù)孔。

1.2.5流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡 取各組生長良好的MDA-MB-231細(xì)胞接種到6孔板中(濃度為1×105ml-1)培養(yǎng)，每孔2 ml，第2天細(xì)胞貼壁生長后加入各組相應(yīng)的藥物處理，每組設(shè)7個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后收集各組細(xì)胞，移至離心管中，加入胰蛋白酶消化，顯微鏡下見細(xì)胞間隙變大、胞質(zhì)回縮、胞體變圓時快速吸除胰蛋白酶，加入培養(yǎng)液，離心(1 000 r/min)5 min，加入PBS液重懸細(xì)胞，離心(1 000 r/min)5 min，加入Annexin V-FITC液重懸細(xì)胞。對照組3管依次不加染料、單加Annexin V-FITC、單加碘化丙啶染色液；藥物組一次加入Annexin V-FITC，再加入PI染色液孵育20 min，采用流式細(xì)胞儀檢測各組MDA-MB-231細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6Hoechst 33258染色 在6孔板中加入細(xì)胞爬片蓋玻片，用RPMI1640培養(yǎng)基浸潤孔底，取各組對數(shù)生長的MDA-MB-231細(xì)胞接種到6孔板中(濃度為1×105ml-1)，每孔2 ml，每組設(shè)7個復(fù)孔，待細(xì)胞下沉到孔底后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁后吸除培養(yǎng)液，每組加入對應(yīng)的藥物處理，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后吸除培養(yǎng)液，加入固定液固定30 min，加入Hoechst 333258染色液孵育5 min，去除染色液，滴加抗熒光猝滅封片液，熒光顯微鏡下拍照并觀察細(xì)胞染色情況。細(xì)胞核飽滿，被染成均勻藍色為正常細(xì)胞；細(xì)胞核透亮固縮為凋亡細(xì)胞。

1.2.7Western blot法測定細(xì)胞Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白及PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白水平 將各組MDA-MB-231細(xì)胞加入相應(yīng)藥物處理48 h 后，移至EP管中離心13 000 r/min離心1 min，將細(xì)胞沉淀中加入RIPA蛋白裂解液裂解30 min，提取總蛋白，采用BCA法測定各組MDA-MB-231細(xì)胞蛋白濃度。取25 μg蛋白進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，分別加入一抗：兔抗人Cleaved-Caspase-3多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗人Bax多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗人Bcl-2多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗人PI3K多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗人p-PI3K多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗人Akt多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗人p-Akt多克隆抗體(1∶1 000)，以β-actin(1∶1 000)為內(nèi)參照，過夜孵育，加入羊抗兔二抗(1∶2 000)孵育2 h，加入ECL顯影，用ImageQuant LAS 4000曝光成像，采用BandScan圖像分析軟件分析條帶灰度值，目標(biāo)蛋白水平以目標(biāo)蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值表示。

2 結(jié)果

2.1山慈菇提取液對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響 MTT結(jié)果顯示，作用24 h時，山慈菇提取液濃度為0 mg/ml、5 mg/ml、10 mg/ml、 20 mg/ml、40 mg/ml、80 mg/ml時MDA-MB-231細(xì)胞的增殖抑制率先上升后下降，山慈菇提取液濃度在0～20 mg/ml 時細(xì)胞增殖抑制率隨濃度增加而增加，濃度在20～80 mg/ml時細(xì)胞增殖抑制率隨濃度增加而降低；濃度為20 mg/ml時細(xì)胞增殖抑制率最高，見圖1。經(jīng)計算山慈菇提取液的半數(shù)抑制濃度(IC50)為10.32 mg/ml，故取山慈菇提取液濃度為10 mg/ml進行后續(xù)實驗。

濃度為10 mg/ml時，山慈菇提取液對MDA-MB-231細(xì)胞增殖抑制率的影響隨時間增加而增加，見圖2。

2.2各組MDA-MB-231細(xì)胞增殖比較 各組MDA-MB-231細(xì)胞增殖比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=4.254，P=0.015)，與C組(0.38±0.12)比較，CAM組MDA-MB-231細(xì)胞OD值(0.21±0.09)降低(P<0.05)，與CAM組比較，CAM+IGF-1組MDA-MB-231細(xì)胞OD值(0.35±0.11)升高(P<0.05)，IGF-1組MDA-MB-231細(xì)胞OD值(0.41±0.13)與C組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

2.3各組MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率比較 各組MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=190.965，P=0.000)， 與C組[(7.26±1.42)%]比較，CAM組MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率[(21.54±2.31)%]升高(P<0.05)，與CAM組比較，CAM+IGF-1組MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率[(8.32±0.21)%]降低(P<0.05)，IGF-1組MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率[(6.57±0.16)%]與C組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖4和圖5。

圖1 不同濃度山慈菇提取液對MDA-MB-231細(xì)胞增殖抑制率的影響Fig.1 Effect of different concentrations of cremastra appendiculata makino on MDA-MB-231 cell proliferation inhibition rate

圖2 不同時間山慈菇提取液對MDA-MB-231細(xì)胞增殖抑制率的影響Fig.2 Effect of cremastra appendiculata makino on MDA-MB-231 cell proliferation inhibition rate at different times

圖3 各組MDA-MB-231細(xì)胞OD值Fig.3 OD values of each group of MDA-MB-231 cells

2.4各組MDA-MB-231細(xì)胞Hoechst染色比較 C組細(xì)胞核飽滿，被染成均勻的藍色；CAM組細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞核透亮固縮； IGF-1組和CAM+IGF-1組細(xì)胞核染色和對照組差別不大。各組MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=66.201，P=0.000)，與C組[(12.51±4.47)%]比較，CAM組MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率[(43.23±5.14)%]升高(P<0.05)，與CAM組比較，CAM+IGF-1組MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率[(14.43±5.48)%]降低(P<0.05)，IGF-1組MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率[(10.26±5.03)%]與C組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖6、7。

圖4 流式細(xì)胞儀測定各組MDA-MB-231細(xì)胞凋亡Fig.4 Flow cytometry for determination of apoptosis in each group of MDA-MB-231 cells

圖5 流式細(xì)胞儀測定各組MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率Fig.5 Flow cytometry to determine apoptosis rate of each group of MDA-MB-231 cells

圖6 各組MDA-MB-231細(xì)胞Hoechst染色(×400)Fig.6 Hoechst staining of each group of MDA-MB-231 cells (×400)

2.5各組細(xì)胞Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白水平比較 與C組比較，CAM組MDA-MB-231細(xì)胞Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白水平升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)；與CAM組比較，CAM+IGF-1組MDA-MB-231細(xì)胞Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白水平降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)，見表1和圖8。

圖7 Hoechst染色測定各組MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率Fig.7 Hoechst staining for determination of apoptotic rate in each group of MDA-MB-231 cells

GroupsCleaved-Caspase-3BaxBcl-2C group0.32±0.070.26±0.050.51±0.08CAM group0.45±0.061)0.42±0.071)0.09±0.041)IGF-1 group0.33±0.080.24±0.050.50±0.09CAM+IGF-1 group0.31±0.072)0.27±0.062)0.47±0.112)F6.06914.15640.668P0.0030.0000.000

Note：Compared with the C group,1)P<0.05;compared with the CAM group,2)P<0.05.

圖8 各組細(xì)胞Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白Western blot電泳圖Fig.8 Western blot analysis of Cleaved-Caspase-3,Bax and Bcl-2 proteins in each group of cellsNote: 1.C group;2.CAM group;3.IGF-1 group;4.CAM+IGF-1 group.

GroupsPI3Kp-PI3KAktp-AktC group0.54±0.120.52±0.130.39±0.160.26±0.08CAM group0.56±0.130.14±0.091)0.43±0.170.11±0.051)IGF-1 group0.51±0.110.73±0.150.42±0.150.37±0.06CAM+IGF-1 group0.53±0.140.47±0.142)0.40±0.160.23±0.092)F0.19324.8840.09115.529P0.9000.0000.9640.000

Note：Compared with the C group,1)P<0.05；compared with the CAM group,2)P<0.05.

圖9 各組細(xì)胞PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白Western blot電泳圖Fig.9 Western blot analysis of PI3K,p-PI3K,Akt and p-Akt proteins in each group of cellsNote: 1.C group;2.CAM group;3.IGF-1 group;4.CAM+IGF-1 group.

2.6各組細(xì)胞PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白水平比較 各組MDA-MB-231細(xì)胞PI3K、Akt蛋白水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，各組MDA-MB-231細(xì)胞p-PI3K、p-Akt蛋白水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中與C組比較，CAM組p-PI3K、p-Akt蛋白水平降低(P<0.05)；與CAM組比較，CAM+IGF-1組p-PI3K、p-Akt蛋白水平升高(P<0.05)，見表2和圖9。

3 討論

山慈菇是蘭科植物杜鵑蘭、獨蒜蘭、云南獨蒜蘭的干燥假鱗莖，杜鵑蘭是山慈菇的主流品種，在臨床抗腫瘤方面具有良好效果[5]。山慈菇抗腫瘤的機制包括：山慈菇的某些化學(xué)成分可直接殺傷腫瘤細(xì)胞，具有細(xì)胞毒作用；山慈菇中含有的多糖成分可改變惡性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜生長特性、抑制惡性腫瘤細(xì)胞的生長周期，從而抑制惡性腫瘤細(xì)胞的增殖，發(fā)揮抗腫瘤作用；山慈菇可通過誘導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用；山慈菇可通過降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜抑制惡性腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移；山慈菇可通過抑制腫瘤新生血管生成抑制腫瘤生長[6，7]。近年來研究發(fā)現(xiàn)山慈菇對乳腺癌細(xì)胞的生長具有抑制作用，如牛曉雨等[8]研究發(fā)現(xiàn)山慈菇水煎劑可抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖，將細(xì)胞周期阻滯在G2期，并可促進乳腺癌細(xì)胞凋亡，有效抑制乳腺癌細(xì)胞遷移。本文研究發(fā)現(xiàn)山慈菇提取液可抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖，其對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖的抑制作用隨劑量的增加先升高后下降，分析可能為：山慈菇提取液的過量應(yīng)用，對乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用反而減弱，其具體機制有待進一步研究；而在安全劑量范圍內(nèi)，山慈菇提取液對乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用隨劑量增加而增加，具有一定劑量依賴性。根據(jù)山慈菇提取液的IC50為10.32 mg/ml，取山慈菇提取液濃度為10 mg/ml 進行研究，發(fā)現(xiàn)山慈菇提取液可抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡是一種主動發(fā)生的程序性死亡，由基因介導(dǎo)產(chǎn)生；細(xì)胞凋亡除了在正常生理過程中發(fā)生外，在惡性腫瘤等多種疾病中也存在細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡減少而細(xì)胞增殖過度則引起惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[9]。惡性腫瘤的發(fā)生和惡性腫瘤細(xì)胞的增殖失控和凋亡減少關(guān)系密切，多種抗凋亡細(xì)胞因子和促凋亡細(xì)胞因子在細(xì)胞增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用；凋亡是由多種基因嚴(yán)格控制的，主要包括癌基因C-myc、抑癌基因P53以及Caspase家族和Bcl-2家族[10]。Caspase家族的凋亡途徑包括線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑和死亡受體介導(dǎo)的外源性凋亡途徑[11]。Bcl-2家族和線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑關(guān)系密切；在DNA損傷等內(nèi)部信號刺激下，細(xì)胞漿Bcl-2家族成員聚集到線粒體，在抗凋亡因子和促凋亡因子的作用下，調(diào)節(jié)釋放細(xì)胞色素C，細(xì)胞色素C在胞漿中和凋亡因子結(jié)合形成多聚體，引起Caspase-9活化，激活的Caspase激活其下游的Caspase-3，引起細(xì)胞凋亡的發(fā)生；作為抑制凋亡基因的Bcl-2在生長因子受體的介導(dǎo)中發(fā)揮作用，通過抑制細(xì)胞凋亡參與惡性腫瘤的發(fā)病[12]。Bax則與Bcl-2相反，可促進細(xì)胞凋亡；Bcl-2過表達和Bax形成二聚體，抑制細(xì)胞凋亡，Bax過表達可形成同源二聚體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。山慈菇可通過影響Caspase-3、Bax、Bcl-2表達發(fā)揮抗腫瘤作用，如于林楠等[14]研究發(fā)現(xiàn)山慈菇提取物可通過提高Caspase-3、Bax表達以及降低Bcl-2表達抑制結(jié)腸癌HT29細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗結(jié)腸癌的作用。

PI3K/Akt信號通路在多種生命發(fā)揮中發(fā)揮關(guān)鍵性作用，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮關(guān)鍵信號通路的作用[15，16]；研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號通路在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、化療耐藥、侵襲、轉(zhuǎn)移中具有重要作用[17，18]。多種因素可調(diào)控PI3K/Akt信號通路的激活，活化的PI3K(即磷酸化的PI3K)可激活其下游的AKT，激活的AKT通過磷酸化可促進其下游的抗凋亡基因Bcl-2的表達，抑制Caspase-3、Bax的表達，從而發(fā)揮抗凋亡的作用[19，20]。

多種中藥成分可通過PI3K/Akt信號通路影響乳腺癌細(xì)胞的生長，如韋立群等[21]研究發(fā)現(xiàn)金雀異黃酮可通過抑制PI3K/Akt信號通路下調(diào)Bcl-2的表達，促進Caspase-3和Bax的表達抑制三陰乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞生長并誘導(dǎo)其凋亡；劉楠等[22]研究發(fā)現(xiàn)紅花多糖通過阻斷PI3K/Akt通路誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435的凋亡。介于上述研究，推測山慈菇可能通過抑制PI3K/Akt信號通路抑制乳腺癌細(xì)胞生長，本文對該推測進行研究，發(fā)現(xiàn)山慈菇可升高乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白水平，降低Bcl-2、p-PI3K、p-Akt蛋白水平。IGF-1可以通過PI3K磷酸化而被激活，激活的PI3K引起其下游的AKT磷酸化而被活化，因此IGF-1為常用的PI3K/Akt信號通路激動劑。本文采用IGF-1和山慈菇共同作用于乳腺癌MDA-MB-435細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)IGF-1可抵消山慈菇對乳腺癌MDA-MB-435細(xì)胞增殖、凋亡及Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2、p-PI3K、p-Akt蛋白水平的影響。由此表明山慈菇可能通過抑制PI3K/Akt信號通路影響其下游抑癌基因Bax和促癌基因Bcl-2、Caspase-3的表達，從而促進乳腺癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡。

綜上所述，山慈菇可能通過PI3K/Akt信號通路影響其下游的促凋亡及抗凋亡基因的表達促進乳腺癌細(xì)胞增殖、抑制乳腺癌細(xì)胞凋亡。