表面活性蛋白A單核苷酸基因多態(tài)性與過敏性鼻炎皮下特異性免疫治療療效相關(guān)性分析①

何 勇 徐博懷 湯繼元 余璐潔 張 彬

(寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,寧波 315020)

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis,AR)也稱過敏性鼻炎，是特應(yīng)性個體接觸過敏原后，由IgE介導(dǎo)的鼻黏膜非感染性慢性炎性疾病。遺傳和環(huán)境因素在AR的發(fā)生過程中共同發(fā)揮重要作用，DNA序列的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)與AR的易感性存在關(guān)聯(lián)[1]。在AR的治療方法中變應(yīng)原特異性免疫治療是《2015版過敏性鼻炎診斷與治療天津指南》推薦的一線治療方案，其中皮下特異性免疫治療(subcutaneous immunotherapy，SCIT)可以通過免疫調(diào)節(jié)機制改變AR自然進程[2]。而不同個體接受SCIT治療的效果有差異，很可能與宿主遺傳背景的SNPs相關(guān)。研究表明,表面活性蛋白A(surfactant protein A， SP-A)及其SNPs與過敏性哮喘嚴重程度有關(guān)[3]，并且影響個體對變應(yīng)性疾病的易感性[4,5]，但SP-A基因多態(tài)性是否影響AR免疫治療效果并不十分清楚，本研究通過前瞻性研究的方法，對接受皮下免疫治療的AR患者進一步探討SP-A基因的多態(tài)性與SCIT治療效果的關(guān)聯(lián)，以期加深對SCIT治療機制的了解，并且可以根據(jù)個體對免疫治療的敏感度，制定個體化治療方式，從而提高治療效果。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1臨床資料 選取2015年8月至2018年1月間就診于寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院的AR患者160例，采用丹麥ALK公司的“安刺”標(biāo)準化皮膚點刺試劑，屋塵螨和/或粉塵螨過敏++以上判定為陽性，愿意接受SCIT治療。

1.1.2納入標(biāo)準 年齡5～55歲(性別不限)；符合2015年過敏性鼻炎指南中重度過敏性鼻炎診斷標(biāo)準[2]，可合并輕、中度過敏性哮喘患者；血清sIgE檢測或皮膚點刺試驗提示變應(yīng)原以塵螨陽性為主；愿意接受SCIT治療AR；以上標(biāo)準中若有任一項屬于“否”的患者不能入選。

1.1.3排除標(biāo)準 伴有嚴重的或未控制的哮喘以及不能逆轉(zhuǎn)的呼吸道阻塞疾??；正在使用β受體阻滯劑，或血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)進行治療；嚴重心血管、代謝、免疫、神經(jīng)、血液、消化系統(tǒng)疾??；患者無法理解治療的風(fēng)險性和局限性；目前正在參加其他研究或30 d內(nèi)參加過其他臨床研究者，或直接參與此研究的工作人員；具有精神病史、對抗性格、不良動機、多疑或其他情感與智力障礙，可能影響研究的知情有效性。本研究經(jīng)寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會備案通過，所有納入對象本人或其監(jiān)護人均已簽署研究知情同意書。

1.2方法

1.2.1治療方案 采用丹麥ALK公司的“安脫達SQ”標(biāo)準化屋塵螨變應(yīng)原制劑，采用皮下注射方法，起始盒規(guī)格4 ml×5 ml，濃度分別為102SQ/ml、103SQ/ml、104SQ/ml和105SQ/ml，起始療程21周，然后使用維持盒，1 ml×5 ml，105SQ/ml，每4～6周注射1次。

免疫治療早期同時配合藥物使用，后期在鼻部癥狀控制不佳或不能忍受的情況下，允許使用對癥藥物進行控制，用藥方法參考AR診斷和治療指南[2]。

1.2.2觀察指標(biāo)與療效評定 患者開始SCIT治療前、治療后5個月、治療后1年分別進行臨床癥狀評分，使用視覺模擬量表(visual analog scale，VAS)對AR常見癥狀及和AR有關(guān)的變應(yīng)性結(jié)膜炎癥狀進行評價。鼻腔癥狀療效評定(VAS)：患者在0～10 cm 標(biāo)尺上劃線標(biāo)出各種癥狀相應(yīng)的分值，按“0～10分”進行評價，“0”代表沒有此癥狀，“10”代表此種癥狀最重。療效評定根據(jù)2004 年蘭州的變應(yīng)性鼻炎的診治原則和推薦方案[6]:療效評分(%)=(治療前VAS評分-治療后6個月VAS評分)/治療前VAS評分×100%，劃為兩個標(biāo)準，好轉(zhuǎn)：>25%，未好轉(zhuǎn)：≤25%。

1.2.3實驗材料、試劑 血液基因組DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，分子核酸染料、正反向引物購自上海生工生物科技有限公司，Marker、Loading buffer購自TaKaRa公司，Agarose購自賽默飛，PCR試劑盒購自上海生工/TaKaRa公司，離心機購自德國Eppdendorf公司，渦旋振蕩器購自上海汗諾儀器，電泳儀購自北京六一公司，凝膠成像儀購自上海天能公司，Nano-drop購自杭州奧盛儀器有限公司，測序儀購自ABI。

1.2.4DNA擴增、多態(tài)性位點的檢測與基因分型 白細胞分離：每位研究對象均用真空EDTA抗凝管采集靜脈血5 ml，按標(biāo)準離心方法在4 h內(nèi)離心，分離出的血漿(含白細胞層)保存于1.5 ml Eppendorf管(每個樣本保存2份)，-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩NPs分型：根據(jù)文獻報道選擇SFTPA1和SFTPA2的編碼區(qū)中造成錯義突變的SNPs進行研究[5]，根據(jù)hapmap數(shù)據(jù)庫(http://www.hapmap.org)提供的SNP序列信息，制備Taqman-MGB探針，進行基因分型，SNPs位點有rs1059047、rs1136450、rs1136451、rs1059057、rs4253527、rs1059046、rs17886 395、rs1965407、rs1965708。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用EpiData 3.10、SPSS20.0、STATA11.0對數(shù)據(jù)進行管理和分析，分析方法包括實驗結(jié)果重復(fù)性的Kappa檢驗，計數(shù)資料的單因素χ2檢驗(包括基因型在對照人群中的Hardy-Weinberg平衡檢驗)，計量資料的t檢驗，單因素和多因素方差分析，單因素和多因素回歸分析、單倍型分析、兩因素和三因素交互作用的相加或相乘模型分析等。

2 結(jié)果

2.1患者一般臨床特征與SCIT有效率的關(guān)系 160例AR患者有119例完成1年隨訪，41例患者因各種原因放棄SCIT或者拒絕隨訪。81例患者好轉(zhuǎn)，38例患者未好轉(zhuǎn)，好轉(zhuǎn)率68%。非條件Logistic回歸分析結(jié)果顯示患者性別、年齡、是否合并哮喘、病程、加重季節(jié)、超過4周、治療史、手術(shù)史、順產(chǎn)、家族史、家中環(huán)境，屋塵螨及粉塵螨皮膚指數(shù)與免疫治療有效率無顯著相關(guān)性。結(jié)果如表1。

表1 患者一般臨床特征與治療有效率的關(guān)系

Tab.1 Relationship of clinical manifestation and effective rate of SCIT

Note：AR is the abbreviation of allergic rhinitis；AS is the abbreviation of allergic asthma.

表2 兩組患者SNP位點分布的差異

Tab.2 Difference of SNP loci distribution between two groups of patients

SNPClassificationGroupingImprovedUnimprovedOR95%CIPSP-A1 -50C>G (rs1136450)CC54(66.67)21(55.26)11CG25(30.86)12(31.58)0.8100.324-1.9020.629GG2(2.47)5(13.16)0.1560.028-0.8650.0341)-133A>G(rs1059057)AA7(8.64)3(7.89)11AG71(87.65)34(89.47)0.8950.218-3.6760.878GG3(3.70)1(2.63)1.2860.092-17.9510.852-219C>T(rs4253527)CC7(8.64)2(5.26)11CT72(88.89)34(89.47)0.6050.119-3.0690.545TT2(2.47)2(5.26)0.2860.023-3.5250.329SP-A2-9A>C(rs1059046)AA5(6.17)1(2.63)11AC76(93.83)37(97.37)0.4110.046-3.6440.424CC0(0.00)0(0.00)----91C>G(rs1059047)CC45(55.56)20(52.63)11CG25(30.86)11(28.95)1.0100.418-2.4430.982GG11(13.58)7(18.42)0.6980.236-2.0650.516-223A>C(rs1965708)AA12(14.81)11(28.95)11-AC58(71.60)20(52.63)2.6581.105-6.9640.046aCC11(13.58)7(18.42)1.4410.412-5.0380.568

Note：1)P≤0.05.

2.2SNPs與免疫治療有效率的關(guān)系 119例患者各位點均擴增成功，統(tǒng)計分析使用SAS9.4版本進行分析。-19C>T位點三種基因型分布為CC (37例，頻率 31.09%)、CT(80例，頻率 67.23%)和TT(2例，1.68%)。-50C>G位點三種基因型分布為CC (75例，頻率63.03%)、CG(37例，頻率 31.09%)和GG(7例，5.88%)。-62A>G位點三種基因型分布為AA(28例，頻率 23.53%)、AG(90例，頻率 75.63%)和GG(1例，0.84%)。-133A>G位點三種基因型分布為AA (10例，頻率 8.4%)、AG(105例，頻率 88.24%)和GG(4例，3.36%)。-219C>T位點三種基因型分布為CC (9例，頻率 7.56%)、CT(106例，頻率 89.08%)和TT(4例，3.36%)。-9A>C位點三種基因型分布為AA (6例，頻率 5.04%)、AC(113例，頻率 94.96%)和CC(0例，0%)。-91C>G位點三種基因型分布為CC (65例，頻率 54.62%)、CG(36例，頻率 30.25%)和GG(118例，15.13%)。-140C>T位點三種基因型分布為CC (1例，頻率 0.84%)、CT(106例，頻率 89.08%)和TT(12例，10.08%)。-223A>C位點三種基因型分布為AA (23例，頻率 19.33%)、AC(78例，頻率 65.55%)和CC(18例，15.13%)。

非條件Logistic回歸分析結(jié)果顯示：-50C>G位點CC基因型患者免疫治療有效率明顯高于GG基因型患者(P=0.034；OR=0.156)；-223A>C位點AC基因型患者免疫治療有效率顯著高于AA型患者(P=0.046,OR=2.658)。-133A>G位點、-219C>T位點、9A>C位點、-91C>G位點基因型與免疫治療有效率無顯著相關(guān)性。具體見表2。-19C>T(rs1059047)，-62A>G(rs1136451)，-140C>T(rs1965407)位點信息不平衡，無法給出合理的統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)。

2.3SNPs與屋塵螨、粉塵螨皮膚點刺強度的關(guān)系 由表3可見-62A>G GG基因型與-140C>T CC基因型只有1例，故沒有納入統(tǒng)計分析。使用非參數(shù)分析對SP-A基因不同基因型屋塵螨、粉塵螨皮膚指數(shù)比較，發(fā)現(xiàn)-50C>G位點CC基因型和GG基因型患者屋塵螨皮膚指數(shù)大于CG基因型患者， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P≤0.05)；-140C>T位點TT基因型患者屋塵螨皮膚指數(shù)大于CG基因型患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P≤0.05)；-62A>G位點AG基因型患者粉塵螨皮膚指數(shù)大于AA基因型患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P≤0.05)。

表3 SP-A基因不同基因型屋塵螨、粉塵螨皮膚指數(shù)的比較

Tab.3 Comparison of skin index of dermatophagoides pteronyssinus(Der p)and dermatophagoides farinae(Der f)with gene types of SP-A gene

SNPGenotypesnSkin Index of Der pPSkin Index of Der fPSP-A1-19C>T (rs1059047)CC37(31.1)3.22±0.1110.7872.97±0.1370.669CT80(67.2)3.26±0.0792.98±0.104TT2(1.7)3.50±0.5003.50±0.500-50C>G (rs1136450)CC75(63.0)3.35±0.0820.0252)3.07±0.960.153CG37(31.1)3.03±0.1062.76±0.166GG7(5.9)3.43±0.2023.29±0.286-62A>G1)(rs1136451)AA28(23.5)3.14±0.1760.7062.68±0.1630.0172)AG90(75.6)3.29±0.0643.07±0.093-133A>G (rs1059057)AA10(8.4)3.20±0.1330.8493.00±0.2110.683AG105(88.2)3.26±0.0692.99±0.090GG4(3.4)3.25±0.4792.75±0.250-219C>T (rs4253527)CC9(7.6)2.89±0.3090.3252.56±0.1760.063CT106(89.1)3.28±0.0653.00±0.089TT4(3.4)3.25±0.2503.50±0.289SP-A2-9A>C (rs1059046)AA6(5.0)3.50±0.3420.2723.00±0.3650.916AC113(95.0)3.24±0.0642.98±0.084-91C>G (rs17886395)CC65(54.6)3.18±0.0790.0772.92±0.1060.517CG36(30.3)3.47±0.0933.06±0.164GG18(15.1)3.06±0.2353.06±0.206-140C>T1)(rs1965707)CT106(89.1)3.19±0.670.0042)2.93±0.8800.063TT12(10.1)3.75±0.1313.42±0.193-223A>C(rs1965708)AA23(19.3)3.39±0.1220.5903.00±0.1660.069AC78(65.5)3.21±0.0823.09±0.095CC18(15.1)3.28±0.1582.50±0.259

Note：1)Because -62A>G GG and -140C>T CC only have one case separately,they are not included in statistics，2)P≤0.05.

3 討論

特異性免疫治療是一種針對過敏性疾病病因的治療方式，是唯一可能改變AR自然進程的治療方式。2010版的ARIA(Allergic Rhinitis and its Impact on Asthma)指南從循證醫(yī)學(xué)的角度，對季節(jié)性和持續(xù)性AR(伴或不伴哮喘)進行特異性免疫治療的評價均為“推薦”[7]，也是我國指南推薦的一線治療方案[2]。常見的特異性免疫治療方式有SCIT和舌下特異性免疫治療，本研究均使用SCIT治療AR。目前已知SCIT治療后可以恢復(fù)受損的天然免疫功能，調(diào)節(jié)體內(nèi)Th1/Th2免疫平衡[8]。

目前普遍認為AR受多種因素的作用，是一種由遺傳因素和環(huán)境因素共同導(dǎo)致的多基因、免疫性疾病，SNPs是常見的影響個體對疾病易感性的遺傳因素。目前已發(fā)現(xiàn)AR易感性與藥物治療的有效性與多種基因的SNPs有關(guān)[9]，但尚無報道發(fā)現(xiàn)與AR免疫治療療效相關(guān)的SNPs。已有證據(jù)表明SP-A及其SNPs在呼吸道變應(yīng)性疾病中也起著重要作用。SP-A是在肺泡表面表達最豐富的蛋白質(zhì)，其主要生物學(xué)功能是維持磷脂單分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，以降低肺泡表面張力[10]。SP-A在先天免疫反應(yīng)過程中起著重要作用，如細菌清除、宿主防御及抑制炎癥等等。人類SP-A基因定位于10號染色體的q21～q24上，包括兩個高度同源的功能基因SFTPA1和SFTPA2，分別編碼SP-A的兩個同源亞基SP-A1和SP-A2。目前已鑒定的人類SFTPA1的編碼區(qū)存在5個SNP位點，即19、50、62、133和219，SFTPA2的編碼區(qū)存在4個SNP位點，即9、91、140和233[11-13]。SP-A也被檢測到在人鼻黏膜上有表達[14]。人SP-A還可以與塵螨提取物及純化的塵螨變應(yīng)原結(jié)合，通過空間位阻或競爭性抑制的方式抑制變應(yīng)原特異性IgE與塵螨提取物結(jié)合，抑制特異性IgE和嗜堿性粒細胞中組胺的釋放[15]。研究報道發(fā)現(xiàn)肺泡表面SP-A濃度預(yù)示著過敏性哮喘的嚴重程度[3]，還發(fā)現(xiàn)SP-A的 SNPs與漢族人過敏性鼻炎易感性有關(guān)[5]。以上證據(jù)都表明，SP-A蛋白及SP-A的SNPs影響個體對變應(yīng)性疾病的易感性，而SP-A的SNPs對SCIT的治療效果是否也有影響還不清楚。

本研究將接受SCIT治療的患者根據(jù)療效分為好轉(zhuǎn)組和未好轉(zhuǎn)組兩組，比較兩組之間SFTPA1和SFTPA2編碼區(qū)各位點SNPs差異，發(fā)現(xiàn)SFTPA1編碼區(qū)-50C>G位點CC基因型患者免疫治療有效率明顯高于GG基因型患者；SFTPA2編碼區(qū)-223A >C位點AC基因型患者免疫治療有效率顯著高于AA型患者。其余位點基因型與免疫治療有效率無顯著相關(guān)性。已有證據(jù)表明SP-A2蛋白在固有免疫中的作用要明顯大于SP-A1蛋白[16]，并且發(fā)現(xiàn)SFTPA2編碼區(qū)-223A>C位點的突變與AR易感性有關(guān)[16,17]。本研究進一步發(fā)現(xiàn)該SNP與AR免疫治療療效有關(guān)。-223A>C位點編碼的氨基酸是糖類識別結(jié)構(gòu)域蛋白的一部分，該蛋白功能是結(jié)合吸入性過敏物質(zhì)[18]，我們猜想該位點突變可能影響糖類識別結(jié)構(gòu)域蛋白功能，而影響過敏性疾病易感性和免疫治療療效。與既往研究不同的是，以往研究不認為SFTPA1編碼區(qū)與AR易感性之間有關(guān)聯(lián)[5]，本研究發(fā)現(xiàn)2個與過敏性鼻炎SCIT療效有關(guān)的SNPs，分別來自于SFTPA1和SFTPA2編碼區(qū)，說明SP-A2，SP-A1可能均與過敏性鼻炎SCIT療效有關(guān)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)-50C>G位點、-140C>T位點、-62A>G位點不同基因型間屋塵螨、粉塵滿皮膚指數(shù)不同。其中-50C>G位點既提示與過敏性鼻炎SCIT免疫治療療效有關(guān)又提示與皮膚屋塵螨點刺強度有關(guān)，兩者之間是否存在因果關(guān)聯(lián)尚需進一步研究。既往同類研究并未發(fā)現(xiàn)這兩者之間的相關(guān)性，這可能與所使用的皮膚點刺液試劑不同有關(guān)[5]。已有研究結(jié)果指出血清特異性IgE水平和外周血嗜酸細胞計數(shù)不能正確反映AR患者的臨床癥狀和生活質(zhì)量狀況[19]，因此本研究并未對SNPs與IgE水平和外周血嗜酸細胞計數(shù)進行相關(guān)分析。

綜上，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)SP-A1與SP-A2基因的SNPs可能影響AR免疫治療有效率，這個結(jié)果有利于加深對SCIT治療機制的了解，可提供在基因水平上對疾病進行分型的可能，為預(yù)測AR的SCIT療效提供理論依據(jù)，并且可以從基因角度根據(jù)個體對治療的敏感度，制定個體化治療方式，從而提高治療效果。

本研究并未發(fā)現(xiàn)性別、年齡、是否合并哮喘、病程、加重季節(jié)、超過4周、治療史、手術(shù)史、順產(chǎn)、家族史、家中環(huán)境，屋螨指數(shù)及粉螨指數(shù)與SCIT療效的相關(guān)性?？紤]到樣本量小，尚無法得出準確結(jié)論。本研究團隊將繼續(xù)增大樣本量延長隨訪時間，以期得到更加準確的結(jié)論。