H9和H10亞型禽流感病毒二重RT-PCR檢測方法的建立

李丹 謝芝勛 李孟

摘要 [目的]建立可同時鑒別檢測H9和H10亞型禽流感病毒（AIV）的二重RT-PCR檢測方法。[方法]根據(jù)GenBank中H9和H10亞型AIV的HA基因保守序列，分別設(shè)計2對特異性引物，優(yōu)化引物之間的濃度與退火溫度等條件，建立了可同時鑒別檢測H9和H10亞型AIV的二重RT-PCR檢測方法。[結(jié)果]特異性試驗結(jié)果表明，該方法可以特異性擴(kuò)增出H9和H10亞型AIV對應(yīng)大小的目的條帶，而對其余亞型禽流感病毒及其他禽病病原體均未擴(kuò)增出特異性條帶。同時，該檢測方法對H9和H10亞型AIV的擴(kuò)增下限均為5×104拷貝/μL。臨床樣品的檢測結(jié)果表明其與病毒分離結(jié)果相一致（100%）。[結(jié)論]該研究建立的二重RT-PCR檢測方法特異性強、敏感性高，可在一管內(nèi)同時鑒別檢測H9與H10兩種亞型AIV，為H9與H10亞型AIV的監(jiān)測提供了技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞 禽流感病毒;H9亞型;H10亞型;二重RT-PCR

中圖分類號 S852.65 ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）05-0096-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.05.026

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract [Objective]To establish a duplex RTPCR assay method for simultaneous detection of H9 and H10 subtype of avian influenza virus.[Method]According to the HA genes conserved sequences of H9 and H10 subtypes of avian influenza virus in GenBank database，2 pairs of specific primers were designed，the primers density and annealing template of the reaction conditions were optimized，and the duplex RTPCR assay for detection of AIV H9 subtype and H10 subtype was established.[Result]The results of the specificity test showed that this method could specifically amplify the target bands corresponding to H9 and H10 subtypes AIV，but no specific band was amplified from other subtypes of AIV or other avian pathogenic virus.The limit of detection for H9 and H10 subtype avian influenza virus was 5×104 copies/μL.The detection results of duplex RTPCR assay for clinical samples were the same as that of viral isolation（100%）.[Conclusion]This duplex RTPCR assay was a specific and sensitive method for the detection of H9 and H10 subtypes of AIV，which could provide technical support for the monitoring of H9 and H10 subtypes of AIV.

Key words Avian influenza virus;H9 subtype;H10 subtype;Duplex RTPCR

禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）是正黏病毒科中A型流感病毒屬成員。根據(jù)其表面抗原血凝素蛋白（hemagglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶蛋白（neuraminidase，NA）的差異可以將AIV劃分為16種不同的HA亞型（H1～H16）和9種不同的NA亞型（N1～N9）[1-3]。H9亞型AIV自1966年在美國首次被發(fā)現(xiàn)，目前已經(jīng)給全球養(yǎng)禽業(yè)造成了十分嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4]。自1998年廣東首次發(fā)現(xiàn)人感染H9N2亞型AIV病例以來，H9N2型AIV感染人事件也在不斷發(fā)生[5]。H10亞型AIV主要在北美地區(qū)的雞、火雞、野鳥及南非地區(qū)的鴨中分離到病毒[6]，近年來在我國華南地區(qū)的環(huán)境及家禽拭子樣品中也有分離到H10亞型禽流感毒株的報道[7-8]。在2004年和2010年，埃及和澳大利亞分別出現(xiàn)H10亞型AIV感染人事件[9]。自2013年12月以來，我國先后發(fā)生3例人感染H10N8亞型禽流感病毒的病例并造成其中2人死亡，這是世界上首次報道H10亞型流感病毒感染人并致死的病例[10]。近年來低致病性禽流感的流行病學(xué)監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)H9和H10亞型禽流感病毒混合感染普遍存在，研究還表明感染人的H10N8亞型流感病毒的部分內(nèi)部基因來源于H9N2亞型AIV[11]。因此，H9與H10亞型AIV對家禽養(yǎng)殖及人類健康衛(wèi)生具有重要意義。

由于經(jīng)典的病毒分離鑒定方法存在檢測鑒定周期較長且需要進(jìn)一步的血清學(xué)及分子生物學(xué)方法鑒定，而常用的血清學(xué)方法則需要較多標(biāo)準(zhǔn)陽性血清且不同亞型血清之間存在不同程度的交叉反應(yīng)，具有一定的局限性，所以目前檢測禽流感病毒主要采用分子生物學(xué)方法[12]。分子生物學(xué)方法特別是PCR檢測方法具有操作簡便、特異性好、敏感性高等優(yōu)點，在禽流感病毒的監(jiān)測和診斷過程中得到了廣泛應(yīng)用[13]。由于AIV混合感染普遍存在且具有相似的臨床癥狀，難以及時準(zhǔn)確地對其進(jìn)行鑒別區(qū)分。近年來，多重PCR技術(shù)在禽流感診斷中的應(yīng)用越來越多，但關(guān)于H9與H10亞型AIV混合感染的多重PCR檢測方法還未見報道。筆者建立了一種可同時檢測H9與H10亞型AIV的二重RT-PCR檢測方法，不僅可以快速準(zhǔn)確的鑒別2種不同亞型AIV，而且可為感染人的AIV病原學(xué)監(jiān)測提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株。AIV毒株（H1N2、H3N2、H6N2、H9N2、H9N6、NDV、IBV、MG、ARV、MG及ILTV均由廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室保存;AIV（H7N2、H14N5、H15N9和H16N3）的cDNA 模板由美國賓夕法尼亞州立大學(xué)惠贈;AIV毒株（H5N1、H5N2、H5N7和H5N9）cDNA 模板均由美國康涅狄格州立大學(xué)惠贈;其他AIV毒株（H2N3、H4N5、H5N1、H7N9、H8N4、H10N3、H11N3、H12N5和H13N5）毒株或cDNA 模板均由香港大學(xué)惠贈。

1.1.2 試劑。增殖病毒所用SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司，DNA/RNA抽提試劑盒、PCR Mix、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DNA Marker DL 1 000、快速連接載體及質(zhì)粒抽提試劑盒均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、10 mmol dNTP、感受態(tài)細(xì)胞及RNA抑制劑均購自寶生物（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計及合成。從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載H9和H10亞型AIV的HA基因序列，使用DNAStar軟件對上述序列進(jìn)行比對分析，找出特異性的保守區(qū)域，然后使用Primer Premier 5.0軟件結(jié)合Oligo7分析軟件，設(shè)計并通過驗證篩選出2對針對H9和H10亞型AIV HA基因進(jìn)行擴(kuò)增的特異性引物。引物由寶生物（大連）有限公司進(jìn)行合成。引物序列及目的片段大小見表1。

1.2.2 病原RNA/DNA的提取與cDNA合成。參照核酸抽提試劑盒使用說明書對該研究中所用到的AIV、IBV、NDV和ARV的RNA及ILTV和MG的DNA進(jìn)行抽提，抽提后的核酸模板用33 μL RNAfree水溶解。RNA模板參照寶生物反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書進(jìn)行cDNA的合成，所有核酸模板均置于-30 ℃下低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 二重RT-PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化。該方法運用20 μL反應(yīng)體系：2×PCR Mix 10 ?μL，H9與H10亞型AIV cDNA模板各1 μL，引物H9-F、H9-R、H10-F和H10-R （25 pmol/μL）分別加入0.1～1.0 μL，共10個梯度，每個梯度遞增0.1 μL，進(jìn)行2個引物組合濃度的優(yōu)化，最后用RNAfree補足至20 μL。同時，根據(jù)引物各濃度梯度的試驗效果，再對退火溫度及反應(yīng)時間進(jìn)行組合優(yōu)化，最終確定該方法的最佳反應(yīng)體系及條件。

1.2.4 特異性試驗。運用上述所建立的二重RT-PCR檢測方法按照對H1N2、H2N3、H3N2、H4N5、H5N1、H6N2、H7N9、H8N4、H11N3、H12N5、H13N5、H14N1、H15N5、NDV、ARV、IBV、ILTV和MG的cDNA/DNA進(jìn)行檢測，驗證所建方法的特異性。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)品的制備。參考文獻(xiàn)[14]中HA全長基因的引物，分別以H9N2與H10N3毒株cDNA為模板進(jìn)行HA基因RT-PCR的擴(kuò)增，得到其全長目的片段，并將目的片段分別連接到載體上并送交華大基因公司進(jìn)行測序。將插入有H9與H10亞型AIV的HA基因全長片段并測序正確的重組質(zhì)粒分別命名為H9-T和H10-T。用商品化的質(zhì)粒抽提試劑盒分別提取含有H9-T和H10-T的質(zhì)粒，并使用微量核酸檢測儀對其濃度進(jìn)行測定，按照相關(guān)公式計算樣品相對應(yīng)的拷貝數(shù)，同時將H9-T與H10-T質(zhì)粒等拷貝數(shù)混合，并將混合好的樣品進(jìn)行10倍倍比稀釋，以便獲得H9-T與H10-T 質(zhì)粒DNA濃度為5×101～5×109拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.6 敏感性試驗。運用上述優(yōu)化好的二重RT-PCR檢測方法對制備的質(zhì)粒DNA濃度5×101～5×109拷貝/μL的H9-T與H10-T質(zhì)粒樣品進(jìn)行擴(kuò)增，驗證該檢測方法的敏感性。

1.2.7 臨床樣品檢測。運用試驗所建立的二重PCR檢測方法對近期從活禽市場采集的120份雞和鴨咽喉及泄殖腔棉拭子樣品一部分進(jìn)行PCR檢測鑒定，同時將相同編號剩余樣品經(jīng)過處理后接種SPF雞胚進(jìn)行流感病毒的分離與鑒定，并將H9與H10亞型AIV鑒定為陽性的樣品進(jìn)行HA基因測定。然后，將上述2種方法的結(jié)果進(jìn)行比較，進(jìn)而驗證二重RT-PCR檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 二重RT-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 對H9與H10亞型AIV HA基因2對特異性引物濃度比例及擴(kuò)增溫度時間等的優(yōu)化，確定二重RT-PCR反應(yīng)的最佳體系：2×PCR Mix 12.5 μL，H9與H10亞型AIV 2 μL作為模板，特異性引物H9-F和H9-R（20 pmol/μL）的加入量為0.75 μL，特異性引物H10-F及H10-R（20 pmol/μL）的添加量為1 μL，用RNA-free水補足，使終體積至20 μL。通過對退火溫度進(jìn)行梯度優(yōu)化篩選，確定該反應(yīng)體系的最佳退火溫度為53 ℃。

2.2 特異性試驗

用所建立的二重RT-PCR法從H9及H10亞型AIV混合樣品分別檢測出2條特異性的條帶，分別為490 bp（H9亞型）及272 bp（H10亞型）;對H9N2和H9N6亞型AIV PCR檢測的結(jié)果僅出現(xiàn)1條特異性條帶，片段大小為490 bp;對H10N3亞型AIV進(jìn)行擴(kuò)增只檢測出1條特異性條帶，片段大小為272 bp;對其他亞型AIV和常見的禽病病原體均未擴(kuò)增出任何條帶，結(jié)果表明該方法具有良好的特異性。特異性結(jié)果見圖1。

2.3 敏感性試驗

運用該方法針對5×109～5×101拷貝/μL的H9與H10亞型的AIV 質(zhì)粒模板進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示對濃度為5×109～5×104拷貝/μL的H9與H10亞型的AIV均有2條明顯的特異性擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，片段大小分別為490和272 bp;對濃度等于或小于5×103拷貝/μL的H9與H10亞型AIV均無擴(kuò)增條帶（圖2）。由此可見，該方法最低能檢測到質(zhì)粒模板量為5×104拷貝/μL的H9與H10亞型AIV。

2.4 臨床樣品檢測

運用建立的方法對分別從南寧地區(qū)不同活禽市場采集到的120份雞和鴨咽喉及泄殖腔拭子樣品進(jìn)行PCR檢測，樣品檢測的結(jié)果顯示有6份樣品為H9與H10亞型AIV混合感染陽性，陽性率為5%;21份樣品能擴(kuò)增出490 bp大小的目的條帶，為H9Nx AIV;2份樣品能擴(kuò)增出272 bp大小的目的條帶，為H10Nx AIV;部分臨床樣品PCR檢測的結(jié)果見圖3。上述檢測結(jié)果與樣品的病毒分離鑒定及其HA基因測序結(jié)果完全相符。

3 討論

H9與H10亞型禽流感病毒均屬于LPAIV。H9亞型AIV已成為我國家禽養(yǎng)殖場內(nèi)流行的禽流感病毒的主要亞型，不僅給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，而且自20世紀(jì)90年代以來H9N2亞型AIV直接感染人的事件也不斷發(fā)生。H10亞型AIV對家禽雖然呈現(xiàn)低致病性，但已有報道國外出現(xiàn)過感染人的病例，2013年12月江西報道了首例人感染H10N8亞型AIV并出現(xiàn)致人死亡的病例。近年來，還有研究證實H9亞型LPAIV還可以為HPAIV的重組提供內(nèi)部基因（包括H10N8亞型AIV）[15-16]，這些“新毒株”已經(jīng)對人類公共衛(wèi)生的安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，從而引發(fā)了科學(xué)家對H9與H10亞型AIV的廣泛關(guān)注和深入研究。

近年來，筆者所在實驗室對廣西地區(qū)家禽中LPAIV流行情況進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)家禽中感染H9亞型LPAIV的比例較高，H10亞型AIV也時常被檢測到，這與趙坤坤等[14]、Luo等[17]和Peng等[18]對華東地區(qū)不同亞型LPAIV的監(jiān)測結(jié)果基本一致。由于很多亞型的LPAIV在家禽體內(nèi)經(jīng)常是以混合感染的形式存在，它們對家禽不產(chǎn)生明顯的臨床癥狀，難以靠肉眼和常規(guī)的方法進(jìn)行快速的鑒別診斷。H9與H10亞型AIV不僅在家禽中普遍流行，而且嚴(yán)重威脅人類健康，其在家禽中混合感染的情況也比較常見。目前，對于H9與H10亞型AIV的混合感染迫切需要建立一種能夠在較短時間內(nèi)快速檢測及鑒別H9與H10亞型AIV的方法，為2種亞型AIV的鑒別及LPAIV流行病學(xué)的監(jiān)測提供可靠的技術(shù)支撐。

該研究通過設(shè)計針對H9與H10亞型AIV HA基因的特異性引物，經(jīng)過對不同引物組合的篩選得到擴(kuò)增效果的一個引物組合，然后繼續(xù)對其引物濃度、退火溫度和擴(kuò)增時間進(jìn)行優(yōu)化，最終建立可同時檢測H9與H10亞型AIV的方法。特異性和敏感性試驗結(jié)果表明，該方法只能擴(kuò)增出H9與H10亞型AIV HA基因，不能檢測出其他亞型AIV及常見家禽病原的核酸，最低能檢測到量為5×104拷貝/μL質(zhì)粒模板，另外臨床樣品的檢測結(jié)果也表明其與病毒分離結(jié)果完全相符。綜上所述，該研究成功建立了能同時檢測H9與H10亞型AIV二重RT-PCR方法，該方法具有特異性強及靈敏度高、方便和快速等優(yōu)點，一次PCR反應(yīng)便可確定H9與H10 亞型AIV的混合感染及單一感染情況，方便基層單位應(yīng)用，為H9與H10亞型AIV的快速鑒別診斷提供有效的技術(shù)支撐。

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