枯茗酸藥效分析及對辣椒疫霉病菌的抑制

張娟 王博

摘 ?????要：為探究植物性提取物枯茗酸活體對辣椒疫霉病菌、番茄灰霉病菌、黃瓜白粉病菌和小麥白粉病菌的生物性抑制作用，以及對辣椒疫霉病菌的藥效，選取了常規(guī)農(nóng)藥藥劑速克靈、甲霜靈和三唑酮進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn)，采用組織法和盆栽藥效實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，枯茗酸對辣椒疫霉病菌、番茄灰霉病菌和黃瓜白粉病菌具有良好的生物活性抑制作用，對接種的辣椒疫霉病菌果實(shí)無明顯效果防治和治療效果。通過光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察表明，枯茗酸對辣椒疫霉病菌生物活性及形態(tài)具有較大的影響。同時(shí)能有效改變辣椒疫霉病菌細(xì)胞膜通透性，且枯茗酸濃度越高，短時(shí)間內(nèi)改變效果越明顯，最終趨于穩(wěn)定。

關(guān) ?鍵 ?詞：枯茗酸;藥效分析;抑菌作用;辣椒疫霉病菌

中圖分類號：TQ 455??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：?A ?????文章編號： 1671-0460（2020）03-0521-05

Pharmacodynamic Analysis of Cumin Acid and

Its Inhibition on Phytophthora Capsici

ZHANG Juan， WANG Bo

（Xianyang Vocational Technical College， Shaanxi Xianyang 712000， China）

Abstract： ?In order to explore the biological inhibition of plant extract cumin acid on phytophthora capsici， botrytis cinerea， powdery mildew of cucumber and powdery mildew of wheat in vivo， as well as the efficacy on phytophthora capsici， the conventional pesticides sukeling， metalaxyl and triadimefon were selected for the comparative experiment， and the tissue method and pot experiment were used to investigate?the efficacy. The results showed that cumin acid had good biological activity for the inhibition on phytophthora capsici， botrytis cinerea and powdery mildew of cucumber， but had no significant effect on the control and treatment of phytophthora capsici. The results of light and electron microscopy showed that cumin had great effect on the biological activity and morphology of phytophthora capsici. At the same time， it effectively changed?the cell membrane permeability of phytophthora capsici， and the higher the concentration of cumin acid， the more obvious the change effect in a short time， and finally tended?to be stable.

Key words： cumin acid; ?pharmacodynamic analysis; ?bacteriostasis; ?phytophthora capsici

植物次生代謝產(chǎn)物較多，其中代謝的部分生物活性化合物具有一定的殺蟲及殺菌作用，通過多年以來的研究，將此類生物活性化合物進(jìn)行提取合成，已被當(dāng)作植物性農(nóng)藥來利用。隨著化學(xué)合成技術(shù)的不斷提高，每年都有類似植物性化學(xué)合成抗菌藥物研制成果誕生，天然植物性抗菌化合物種類及數(shù)量不斷變多。但總體來看，能夠大規(guī)模應(yīng)用于農(nóng)作物種植及病蟲害防治上的仍然較少，研究成果的實(shí)際應(yīng)用性仍然需要進(jìn)一步加深。

目前研究成果側(cè)重于對植物提取生物性化合物的合成以及對細(xì)菌的抑制、對病毒毒株鈍化效果等方面。例如胡林峰等（2008）利用離體于活體相結(jié)合的方法，通過實(shí)驗(yàn)分析了枯茗醛和枯茗酸對各類農(nóng)作物病菌的抑菌活性^[1];高艷清等（2011）利用堿性高錳酸鉀作為氧化劑合成了諾蒎酸，再通過酸性脫水過程并重排開環(huán)合成了二氫枯茗酸，最后與各類醇反應(yīng)生成了7種酯衍生物^[2];熊李波等（2018）利用水蒸餾法提取出了從孜然、花椒和芥子精油，并分析了提取物的化學(xué)成分，通過實(shí)驗(yàn)對3種提取物進(jìn)行不同比例混合，測定對真菌的抑制效果，選擇了最佳合成比例^[3];高艷清等（2012）利用抑菌環(huán)法分析了二氫枯茗酸對大腸桿菌的抑制作用及抑制效果^[4];胡林峰等（2007）分析了枯茗酸和枯茗醛對油菜菌核病菌和辣椒疫霉的抑制效果^[5];馮俊濤等（2012）提取了孜然種子中的枯茗酸，通過室內(nèi)盆栽和滴定方法，分析了對辣椒疫霉病菌的抑制作用^[6]。

孜然種子作為燒烤食品重要的調(diào)味品被人們廣泛喜愛，其提取物具有殺菌、殺蟲和抗氧化等生物活性^[7]。提取物中的枯茗酸和枯茗醛能對小麥紋枯病菌、油菜菌核病菌和辣椒疫霉病菌產(chǎn)生較好的抑制作用，其中枯茗酸的效果更好^[8-10]。針對枯茗酸具有較好的抑菌作用，通過枯茗酸于其他病害藥品進(jìn)行藥效分析對比，更進(jìn)一步明確枯茗酸的抑菌效果，并詳細(xì)地研究了枯茗酸對辣椒疫霉病菌抑菌作用方式及機(jī)理，為枯茗酸作為生物活性殺菌劑的推廣應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 ?枯茗酸藥效分析

1.1 ?實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 ?實(shí)驗(yàn)藥品

從孜然種子中提取的枯茗酸，純度93%;50%速克靈可濕性粉劑，廠家為日本住友化學(xué)株式會(huì)社;20%精品三唑酮，廠家為北美農(nóng)大集團(tuán);25%甲霜靈可濕性粉劑，廠家為湖北遠(yuǎn)成賽創(chuàng)科技有限公司，均為市場農(nóng)藥店購買。

1.1.2??實(shí)驗(yàn)植物供體

辣椒（線辣椒），黃瓜（農(nóng)城8號），小麥（西農(nóng)979），番茄（鄭粉四號），市場購買。

1.1.3??實(shí)驗(yàn)設(shè)備

室內(nèi)實(shí)驗(yàn)臺(tái)，DWRH-300生化培養(yǎng)箱，TOLEDO/梅特勒-托利多電子天平，JSM-IT500HR 掃描電子顯微鏡，JEM-2000FX分析型透射電子顯微鏡，thermo multiskan fc 酶標(biāo)儀，冰箱（5、-20、-70?℃），SJIA-18N-50A低溫冷凍干燥機(jī)，TG20G高速離心機(jī)，DDS-307型電導(dǎo)率儀等（圖1）。

1.2 ?藥效測定方法

1.2.1 ?組織法

利用組織法測定藥劑對植物供體的藥效時(shí)，先取新鮮健康形狀大小接近帶蒂的果實(shí)，用95%酒精進(jìn)行浸泡、擦洗消毒，晾干后備用。施藥過程向果實(shí)表面進(jìn)行全覆蓋式噴灑，接種時(shí)用針輕微劃破果實(shí)表面將病菌接種，每個(gè)果實(shí)接種在三個(gè)不同位置。等發(fā)病后測量果實(shí)上病斑直徑，藥效為（對照組病斑直徑-釋藥組病斑直徑）除以對照組病斑直徑。

對照組為噴灑清水，藥劑對照組為甲霜靈和速克靈。接種過程為分析藥劑的保護(hù)及治療作用，噴灑藥劑后24 h后接種為分析藥劑保護(hù)作用，接種48?h后噴灑為分析藥劑治療作用。培養(yǎng)環(huán)境溫度25～30?℃、枯茗酸藥劑濃度均為0.5和1 g/L兩組。

1.2.2 ?盆栽藥效實(shí)驗(yàn)

培育植物供體幼苗，待其成株后移植營養(yǎng)缽中，為避免植株之間的相互影響，每盆內(nèi)培養(yǎng)4株。制備辣椒疫霉、小麥白粉、黃瓜白粉濃度為8 000、

3?000、4 000個(gè)/mL的病菌培養(yǎng)液。利用孢子抖落法接種病源菌，接種后放置于人工氣候箱中培養(yǎng)，設(shè)置度晝25?℃、夜20?℃，相對濕度位65%。

枯茗酸藥劑濃度均為0.5和1 g/L兩組，設(shè)置清水對照組，藥劑對照組甲霜靈和三唑酮。噴灑藥劑后24 h后接種為分析藥劑保護(hù)作用，接種72 h后噴灑為分析藥劑治療作用。藥效分析方法參考楊婷等（2017）、徐丹等（2018）為（對照組病情-釋藥組病情）除以對照組病情^[11，12]。

1.2.3 ?形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)觀察方法

利用光學(xué)顯微鏡將培養(yǎng)4?d左右的病菌放置于載玻片上放大400倍進(jìn)行觀察。

掃描電鏡觀察過程首先需要將病菌樣品利用磷酸緩沖液進(jìn)行沖洗，然后通過丙酮脫水、純醋酸異戊酯置換，干燥、粘樣、鍍膜后再進(jìn)行觀察分析。

透射電鏡固定采用戊二醛-鋨酸雙重固定法，固定后通過丙酮脫水，包埋劑滲透、包埋后在25?℃溫度下聚合2?h，之后用刀片切成薄片，然后利用醋酸雙氧鈾檸檬酸鉛染色后進(jìn)行觀察分析。

1.2.4??細(xì)胞膜通透性測定

分析枯茗酸對辣椒疫霉病菌細(xì)胞膜透性造成的影響，利用DDS-307型電導(dǎo)率儀測的空白組（蒸餾水+菌線）、對照組（溶劑+菌絲）、枯茗酸（0.01、0.04、0.1?g/L三組不同濃度），分別測定在0、0.5、1、2、3、5、10、20、30、40、50h后的電導(dǎo)率，分析電導(dǎo)率與時(shí)間的關(guān)系。

1.3??實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

1.3.1 ?組織法測定結(jié)果

測定結(jié)果反映出枯茗酸對辣椒疫霉病菌侵染辣椒果實(shí)幾乎無明顯治療效果，對番茄灰霉病具有一定的效果，測定結(jié)果見表1所示。

1.3.2??盆栽藥效測定結(jié)果

盆栽實(shí)驗(yàn)結(jié)果反映出了枯茗酸對辣椒苗期疫病、黃瓜白粉病具有一定的保護(hù)和治療效果，測定結(jié)果見表2所示。

2 ?枯茗酸對辣椒疫霉病菌的抑制

2.1 ?對辣椒疫霉病菌形態(tài)結(jié)構(gòu)影響

2.1.1 ?病菌菌絲形態(tài)觀察

利用光學(xué)顯微鏡觀察表明，空白對照組實(shí)驗(yàn)即未經(jīng)過枯茗酸處理的培養(yǎng)液中辣椒疫霉病菌菌絲纖細(xì)，未正常細(xì)菌形態(tài)特征。通過枯茗酸處理后培養(yǎng)液中辣椒疫霉病菌菌絲出現(xiàn)了大量的分枝，病呈現(xiàn)出膨大的特征。

掃描電子顯微鏡觀察表明，未經(jīng)過枯茗酸處理病菌菌絲纖細(xì)光滑，菌絲粗細(xì)較為均勻， 伸展情況良好，延伸生長點(diǎn)呈現(xiàn)尖錐狀態(tài)（圖2）。0.5?g/L枯茗酸處理后觀察發(fā)現(xiàn)病菌菌絲表面粗糙、分枝增多，菌絲粗細(xì)變化較大。1 g/L枯茗酸處理后觀察發(fā)現(xiàn)病菌菌絲表面異常，出現(xiàn)異常膨大，分枝分布雜亂且顯著變多（圖3）。觀察結(jié)果與光學(xué)顯微鏡基本一致。

2.1.2 ?病菌菌絲細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)變化

利用透射電子顯微鏡觀察表明，未經(jīng)過枯茗酸處理菌絲細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞壁外壁均勻，原生質(zhì)稠密，可清晰地觀察到細(xì)胞核，菌絲延伸生長點(diǎn)尖端的線粒體含量較多，整體結(jié)構(gòu)完善，細(xì)胞呈現(xiàn)正常生長發(fā)育形態(tài)（圖4）。

經(jīng)過0.5?g/L濃度枯茗酸處理后菌絲細(xì)胞呈現(xiàn)出液泡化，脂肪顆粒有一定的增多，菌絲延伸生長點(diǎn)尖端的線粒體內(nèi)嵴不明顯（圖5）。經(jīng)過1?g/L濃度枯茗酸處理后菌絲細(xì)胞總脂肪顆粒大量增加，幾乎占據(jù)了細(xì)胞內(nèi)60%的空間，細(xì)胞壁出現(xiàn)大量不規(guī)則增厚情況，液泡化更為明顯（圖6）。

2.2??對辣椒疫霉病菌菌絲細(xì)胞膜透性影響

利用DDS-307型電導(dǎo)率儀測定辣椒疫霉病菌在不同時(shí)間下的電導(dǎo)率見圖7所示，枯茗酸0.04?g/L、0.1?g/L作用3 h后電導(dǎo)率變化趨于緩和，增長幅度不大?？瞻捉M（蒸餾水+菌線）和對照組（溶劑+菌絲）測定結(jié)果隨時(shí)間的變化相差不大，幾乎無明顯差異?？蒈?.01?g/L作用過程在0～20?h內(nèi)整體趨于急劇上升，20?h后趨于平穩(wěn)。

3 ?實(shí)驗(yàn)結(jié)果探討

3.1 ?枯茗酸抑菌特性

實(shí)驗(yàn)測定了枯茗酸對辣椒疫霉病、番茄灰霉病、黃瓜白粉病的保護(hù)及治療效果，其中反映出枯茗酸對椒疫霉病接種的辣椒果實(shí)幾乎無抑制效果。對番茄灰霉病具有較好的抑制效果，其中0.5、1 g/L濃度枯茗酸保護(hù)效果分別為46.08%、48.15%，治療效果分別為19.45%、33.3%，總體效果低于常用藥劑速克靈（濃度0.2?g/L）的保護(hù)及治療效果70.67%、68.38%。

室內(nèi)盆栽實(shí)驗(yàn)效果反應(yīng)出枯茗酸對辣椒疫霉病、小麥白粉病和黃瓜白粉病三種病害都具有一定的保護(hù)和治療效果。其中0.5、1 g/L濃度枯茗酸對辣椒疫霉病保護(hù)效果分別為39.48%、62.19%，治療效果分別為43.38%、59.56%。對小麥白粉病保護(hù)效果分別為58.67%、69.62%，治療效果分別為55.74%、66.54%。對黃瓜白粉病保護(hù)效果分別為42.70%、63.17%，治療效果分別為39.40%、49.40%。

枯茗酸作為多類植物中可以提取出的抑菌成分，提取原材料來源較為豐富，有望在未來成為植物性成分直接在農(nóng)耕地中應(yīng)用，且枯茗酸化學(xué)組分結(jié)構(gòu)簡單，幾乎無污染，也是制藥工藝中重要的合成化合物，將來具有重要的研究前景。

3.2??對辣椒疫霉病菌細(xì)胞膜透性影響

辣椒疫霉病菌細(xì)胞膜通透性主要由細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)決定，外來物質(zhì)在穿透細(xì)胞膜的過程受到多種因素影響，包括溫度、pH值、輻射等。不同濃度枯茗酸對細(xì)胞膜的影響過程初期差異較大，在50 h后總體趨于一致，反映出了高濃度的枯茗酸在早期對辣椒疫霉病菌細(xì)胞膜的影響較為劇烈，短時(shí)間內(nèi)能快速的影響細(xì)胞膜的通透性。

枯茗酸中含有大量的羧酸根離子，能極大的改變細(xì)胞環(huán)境中的pH值，枯茗酸濃度越大，羧酸根離子含量越多，導(dǎo)致環(huán)境溶液酸性越強(qiáng)，促使細(xì)胞膜通透性更強(qiáng)。但最終由于反應(yīng)時(shí)間的持續(xù)，整個(gè)溶液內(nèi)部中細(xì)胞膜內(nèi)外滲透性逐漸趨于平衡，造成了最終對細(xì)胞膜的通透性影響能力減弱。

參考文獻(xiàn)：

[1]胡林峰， 陳從珍， 易曉華， 等. 孜然種子提取物枯茗醛和枯茗酸抑菌作用研究[J]. 西北植物學(xué)報(bào)， 2008， 28 （11）： 2349-2354.

[2]高艷清，商士斌，李健.二氫枯茗酸酯衍生物的合成[J].化學(xué)試劑，2011，33（6）：493-496.

[3]熊李波，秦強(qiáng)，胡培芳，等.混料設(shè)計(jì)優(yōu)化孜然、花椒、芥子混合精油對4種果蔬采后真菌的抑菌效果[J].食品科學(xué)，2019，40（3）：208-216.

[4]高艷清，王丹，商士斌，等.二氫枯茗?；螂宓暮铣杉耙志钚匝芯縖J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2012，32（3）：23-27.

[5]胡林峰，馮俊濤，張興，等.孜然種子中殺菌活性成分分離及結(jié)構(gòu)鑒定[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2007，9（4）：330-334.

[6]馮俊濤，韓立榮，范瑞娟，等.枯茗酸對辣椒疫霉病菌生長發(fā)育的影響[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45（13）：2628-2635.

[7]黃璐， 劉艷麗，李笑然， 等. 孜然芹籽的化學(xué)成分研究[J]. 中草藥， 2017， 48（17）：3480-3485.

[8]王勇，孫揚(yáng)，周明霞，等. 14種小分子有機(jī)酸的抑菌活性篩選[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，41（4）：22-28.

[9]劉文妮，燕璐，沈科萍，等.枯茗醛、孜然精油及其微膠囊對兩種儲(chǔ)糧害蟲的熏蒸效果比較[J].食品工業(yè)科技，2015，36（15）：330-333，337.

[10]趙昊昱.枯茗醛的合成[J].江蘇化工，2008，36（1）：33-35.

[11]楊婷，史紅安，李聰麗，等.13種萜類化合物對膠孢炭疽菌和鏈格孢的抑制活性[J].植物保護(hù)，2017，43（2）：192-195.

[12]徐丹，衛(wèi)夢綺，李亞俊，等.孜然精油對產(chǎn)毒黃曲霉的抑制活性研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2018，30（9）：1601-1607.

[13]聶瑩，李淑英，齊小雨，等.孜然油對幾種果蔬貯藏致病菌抑制作用分析[J].生物技術(shù)通報(bào)，2013（4）：167-171.

[14]朱羽堯，王美珍，陳楠，等.不同提取預(yù)處理方法對孜然精油提取成分組成的影響[J].中國野生植物資源，2018，37（3）：19-23.

[15]任國瑜，任旭，李健，等.烯效唑Fe（Ⅱ）配合物的合成、結(jié)構(gòu)及生物活性研究[J].當(dāng)代化工，2019，48（08）：1682-1685.