絞股藍(lán)提取物制備工藝研究

鐘娜娜 吳思平 吳凌鳳

【摘 要】 目的：研究出絞股藍(lán)提取物，為絞股藍(lán)產(chǎn)品研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。方法：建立絞股藍(lán)提取物的化學(xué)評(píng)價(jià)方法;優(yōu)化絞股藍(lán)提取物的提取工藝，用化學(xué)評(píng)價(jià)方法分別對(duì)絞股藍(lán)的乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)4個(gè)單因素進(jìn)行考察，以L9（34）正交表設(shè)計(jì)優(yōu)化工藝，篩選出最佳提取工藝。結(jié)果：經(jīng)單因素考察和正交優(yōu)化得到絞股藍(lán)提取物制備工藝為料液比為1∶[KG-*3/5]8的70%乙醇，加熱回流提取3次，每次45min，絞股藍(lán)總皂苷含量為0.1025mg/mL，提取率為10.25%。結(jié)論：建立的化學(xué)評(píng)價(jià)方法可評(píng)價(jià)絞股藍(lán)提取物;制備工藝能為絞股藍(lán)產(chǎn)品研發(fā)提供依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 絞股藍(lán);提取物;制備;工藝優(yōu)化

【中圖分類號(hào)】R284.2 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2020）3-0047-05

Abstract：Objective Study the preparation process conditions of Gynostemma pentaphyllum total saponins to obtain the optimal preparation scheme， which provides the research and development of Gynostemma pentaphyllum products.Method Firstly， to establish a chemical evaluation method for the extract of Gynostemma pentaphyllum.Secondly，to study the extraction technology of Gynostemma pentaphyllum extract was optimized by chemical evaluation method， four single factors of ethanol concentration， material liquid ratio， extraction time and extraction times of Gynostemma pentaphyllum were investigated， and the optimum extraction technology was selected by L9（34）Orthogonal table design optimization process.Results By single factor investigation and orthogonal optimization， the preparation process of Gynostemma pentaphyllum extract was obtained by 70% ethanol with a material liquid ratio of 1∶[KG-*3/5]8， three times by heating reflux， and the content of total saponins of Gynostemma pentaphyllum was 0.1025mg/ml， and the extraction rate was 10.25%.Conclusion Firstly， the established chemical evaluation method can evaluate the blue extract of Gynostemma pentaphyllum. Secondly， the developed preparation technology can provide the basis for the research and development of Gynostemma pentaphyllum products.

Keywords：Gynostemma Pentaphyllum;Extracting Products;Preparation;Process Optimization

絞股藍(lán)為葫蘆科絞股藍(lán)屬藤本植物，號(hào)稱“南方人參”[1-2]，是2002年衛(wèi)生部公布的可用于保健食品的中藥[3]。絞股藍(lán)主要有效成分是絞股藍(lán)皂苷、絞股藍(lán)糖苷、水溶性氨基酸、黃酮類[4]、多種維生素[5]、微量元素、礦物質(zhì)等，有益氣健脾、化痰止咳、清熱解毒之功效[6]。臨床上發(fā)現(xiàn)，絞股藍(lán)具有降血脂、調(diào)血壓、防治血栓、調(diào)節(jié)血糖、促睡眠、緩衰老、防抗癌[7]、提高免疫力、調(diào)節(jié)人體生理機(jī)能等多種作用[8]。目前對(duì)絞股藍(lán)皂苷提取方法[9]主要有甲醇、正丁醇提取法、生物提取法、超聲提取法、硅膠吸附法、大孔樹脂吸附法[10]等。這些提取方法[11-16]易造成有機(jī)試劑殘留，致使人們服用時(shí)存在較大安全隱患。如用甲醇提取時(shí)溶劑處理不當(dāng)易引起失明、肝病[17]。正丁醇雖然有非常出色的萃取效果，但同樣有著不容忽視的危害，使用不當(dāng)易引起肝皮膚功能異常、嗅覺減退等毒性反應(yīng)[18-19]。不同廠家提取的絞股藍(lán)皂苷質(zhì)量存在較大差異。目前，對(duì)絞股藍(lán)皂苷系統(tǒng)的制備工藝的研究甚少，有關(guān)文獻(xiàn)僅是簡(jiǎn)單的提取方法的介紹。

基于以上研究背景，本課題采用單因素考察和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)相結(jié)合的方式系統(tǒng)研究絞股藍(lán)皂苷提取物的制備工藝，并進(jìn)行三批樣品的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明該工藝穩(wěn)定可靠，重現(xiàn)性高，提供的工藝技術(shù)能為后期絞股藍(lán)產(chǎn)品轉(zhuǎn)化提供參考。

1 儀器與材料

1.1 藥材來(lái)源 絞股藍(lán)（批號(hào)：18050801）藥材來(lái)源于廣東大森林連鎖藥店有限公司，經(jīng)嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院天然藥物教研室聶華博士鑒定為葫蘆科絞股藍(lán)屬植物絞股藍(lán) Gynostemma pentaphyllum（Thunb.） Makino干燥全草。

1.2 儀器 HH恒溫水浴鍋（金壇市中大儀器廠）;DW調(diào)溫電熱器（上海平環(huán)燃燒設(shè)備工程技術(shù)有限公司）;YF3-1型流水式粉碎機(jī)（瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）;JP-100S型超聲波清洗器（深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司）;FA2004型電子分析天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）;N-1100V型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）;DHG-9246電熱鼓風(fēng)干燥箱（常州普天儀器制造有限公司）;UV-1800型紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司）。

1.3 材料 無(wú)水乙醇（分析純，廣州化學(xué)試劑廠），硫酸（化學(xué)純，廣州化學(xué)試劑二廠），香草醛（化學(xué)純，汕頭市光華化學(xué)廠），人參皂苷Rb1對(duì)照品（批號(hào)：110704-200420，中國(guó)藥品生物制品檢定所）。

2 方法與結(jié)果

2.1 建立絞股藍(lán)總皂苷化學(xué)評(píng)價(jià)方法

2.1.1 溶液制備

2.1.1.1 供試品制備 將絞股藍(lán)干燥全草粉碎，過50目篩，稱取50g，加60%乙醇500mL，回流提取60min，傾出提取液;藥渣加60%乙醇400mL，回流提取45min，傾出提取液，反復(fù)提取六次，合并提取液，濾過兩次，濾液減壓濃縮，得總浸膏。取0.1g總浸膏，用乙醇溶解定容至500mL容量瓶，取1mL溶液至10mL容量瓶，置80℃水浴中揮干溶劑備用。

2.1.1.2 對(duì)照品制備 精密稱取人參皂苷Rb1 4mg，用乙醇制成每1mL含有2mg的溶液，備用。

2.1.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 取對(duì)照品溶液與供試品溶液，分別加入8%香草醛乙醇溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用）0.5mL，77%硫酸溶液5mL，搖勻，密塞，置60℃水浴加熱顯色15 min，取出，立即用冰水冷卻10min，在200～700nm波長(zhǎng)處掃描，結(jié)果顯示對(duì)照品溶液和供試品溶液在538nm處有最大吸收，無(wú)干擾，故選擇測(cè)定波長(zhǎng)為538nm。

2.1.3 方法學(xué)考察

2.1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別精密吸取對(duì)照品溶液60μL、80μL、100μL、120μL、140μL、160μL于10mL容量瓶，置80℃水浴中揮干溶劑。分別加入8%香草醛乙醇溶液（800mg香草醛溶于10mL無(wú)水乙醇溶解中，現(xiàn)配現(xiàn)用）0.5mL，77%硫酸溶液5mL，搖勻，密塞，置60℃水浴加熱顯色15min，取出，立即用冰水冷卻10min，以隨行試劑為空白，按照《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版一部紫外-可見分光光度法（附錄VA），于538nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，濃度（mg·mL-1）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程為y=2.9571x+0.0394， 相關(guān)系數(shù)為0.9952，人參皂苷Rb1含量在0.12～0.32mg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。結(jié)果如圖1所示。

2.1.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液60μL，置10mL容量瓶，按2.1.3.1項(xiàng)下方法測(cè)定，重復(fù)6次，RSD值為1.14%，表明儀器精密度良好。

2.1.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取供試品溶液5份，照紫外分光光度法測(cè)定，重復(fù)5次，RSD值為1.36%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.1.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，分別在0h、2h、4h、6h、8h、24h時(shí)測(cè)定，RSD值為1.87%，表明該樣品液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.3.5 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 精密吸取1mL已知濃度的樣品溶液置10mL容量瓶，精密加入樣品量的80%、100%、120%的對(duì)照品，分別加入8%香草醛乙醇溶液0.5mL，77%硫酸溶液5mL，搖勻，密塞，置60℃水浴加熱顯色15min，取出，立即用冰水冷卻10min，按2.1.3.1項(xiàng)下測(cè)定，試驗(yàn)回收率為99.3%，RSD為1.01%，表明此方法加樣回收率良好。

2.1.3.6 樣品的測(cè)定 精密量取2.1.1.1項(xiàng)下供試品，加入8%香草醛乙醇溶液0.5mL，77%硫酸溶液5mL，搖勻，密塞，置60℃水浴加熱顯色15min，取出，立即用冰水冷卻10min，照紫外分光光度法測(cè)定。

2.2 絞股藍(lán)總皂苷制備工藝研究

2.2.1 單因素考察 以乙醇作為提取溶媒，提取工藝選擇乙醇濃度、乙醇用量、提取時(shí)間和提取次數(shù)進(jìn)行單因素考察。

2.2.1.1 乙醇濃度考察 取15g絞股藍(lán)粉末樣品，置圓底燒瓶中，分別加入40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇150mL，回流提取15min，過濾，收集提取液，置蒸發(fā)皿中蒸干得浸膏，平行操作，通過絞股藍(lán)皂苷含量測(cè)定結(jié)果分析不同乙醇濃度對(duì)絞股藍(lán)皂苷提取物提取工藝的影響，結(jié)果見表1。

由表1、圖2可知，以70%乙醇提取的絞股藍(lán)皂苷含量最高，提取率達(dá)9.023%，與80%乙醇和90%乙醇提取率和70%乙醇的提取率接近，但卻降低了乙醇濃度，節(jié)約了成本，故選擇70%乙醇作為絞股藍(lán)皂苷的溶媒濃度。

2.2.1.2 料液比考察 取15g絞股藍(lán)粉末樣品，置圓底燒瓶中，分別以料液比1∶[KG-*3/5]4、1∶[KG-*3/5]6、1∶[KG-*3/5]8、1∶[KG-3/5]10、1∶[KG-*3/5]12、1∶[KG-*3/5]14加入70%乙醇，回流提取15min，過濾，收集提取液，置蒸發(fā)皿中蒸干得浸膏，平行操作，通過絞股藍(lán)皂苷含量測(cè)定結(jié)果分析不同料液比對(duì)絞股藍(lán)皂苷提取物提取工藝的影響，結(jié)果見表2。

由表2、圖2可知，以料液比1：8提取的絞股藍(lán)皂苷含量最高，提取率達(dá)8.493%，故選擇料液比為1∶[KG-*3/5]8的70%乙醇作為絞股藍(lán)皂苷的溶劑用量。

2.2.1.3 提取時(shí)間考察 取15g絞股藍(lán)粉末樣品，置圓底燒瓶中，以料液比1∶[KG-*3/5]8的70%乙醇，分別回流提取15min、30min、45min、60min、90 min、120min，過濾，收集提取液，置蒸發(fā)皿中蒸干得浸膏，平行操作，通過絞股藍(lán)皂苷含量測(cè)定結(jié)果分析不同提取時(shí)間對(duì)絞股藍(lán)皂苷提取物提取工藝的影響，結(jié)果見表3。

由表3、圖2可知，提取時(shí)間為45min時(shí)提取率最高，可達(dá)8.442%，超過45min后，皂苷提取率隨提取時(shí)間的增加而下降，故選擇提取時(shí)間為45min。

2.2.1.4 提取次數(shù)考察 取15g絞股藍(lán)粉末樣品，置圓底燒瓶中，以料液比1∶[KG-*3/5]8的70%乙醇，回流提取45min，分別提取1次、2次、3次，過濾，收集提取液，置蒸發(fā)皿中蒸干得浸膏，平行操作，通過絞股藍(lán)皂苷含量測(cè)定結(jié)果分析不同提取次數(shù)對(duì)絞股藍(lán)皂苷提取物提取工藝的影響，結(jié)果見表4。

由表4、圖2可知，不同提取次數(shù)下提取絞股藍(lán)，以料液比為1∶[KG-*3/5]8的70%乙醇回流提取4次，每次45min，絞股藍(lán)皂苷提取率最高，可達(dá)8.892%，與料液比為1∶[KG-*3/5]8的70%乙醇回流提取3次，每次45min的絞股藍(lán)皂苷提取率相當(dāng)接近，但卻減少了提取次數(shù)，節(jié)約了成本，故選擇提取次數(shù)為3次。

2.2.2 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn) 用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化絞股藍(lán)皂苷的提取工藝，根據(jù)相關(guān)資料與預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取影響絞股藍(lán)皂苷的3個(gè)因素，即乙醇濃度、提取時(shí)間、提取次數(shù)。每個(gè)因素下各選取3個(gè)水平，采用L9（34）正交表設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表5。

由表6、表7分析結(jié)果可知，提取次數(shù)對(duì)絞股藍(lán)總皂苷的提取率影響較顯著，影響大小為C>B>A，即提取次數(shù)>提取時(shí)間>乙醇濃度。絞股藍(lán)總皂苷最佳制備工藝條件為A2B2C3，即料液比為1∶[KG-*3/5]8的70%乙醇，加熱回流提取3次，每次45min。

2.2.3 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn) 按2.2.2項(xiàng)下最佳提取工藝，制備三批絞股藍(lán)皂苷提取物，照紫外分光光度法測(cè)定。由表8可知，采用最佳提取工藝，即料液比為1∶[KG-*3/5]8的70%乙醇，加熱回流提取3次，每次45min，得到的提取物中絞股藍(lán)皂苷提取率為10.25%，表明該工藝重現(xiàn)性好。

3 討論

該實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)研究絞股藍(lán)皂苷的提取工藝，建立了絞股藍(lán)提取物的化學(xué)評(píng)價(jià)方法，分別對(duì)絞股藍(lán)的乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)4個(gè)單因素進(jìn)行考察，以L9（34）正交表設(shè)計(jì)優(yōu)化工藝，篩選出最佳提取工藝為料液比為1∶[KG-*3/5]8的70%乙醇，加熱回流提取3次，每次45min;連續(xù)進(jìn)行三批樣品制備，證明該工藝的重現(xiàn)性好;制備了絞股藍(lán)皂苷提取物，為絞股藍(lán)產(chǎn)品化發(fā)展提供數(shù)據(jù)支撐。

通過對(duì)絞股藍(lán)指標(biāo)成分含量研究，實(shí)驗(yàn)得出了絞股藍(lán)皂苷提取物，但是研究中仍存在不足。絞股藍(lán)總皂苷約有140余種[20]，其成分的含量測(cè)定和成品標(biāo)準(zhǔn)，都以人參皂苷Rb1的多少作為標(biāo)準(zhǔn)。故本文以人參皂苷Rb1為檢測(cè)目標(biāo)建立了絞股藍(lán)皂苷的化學(xué)評(píng)價(jià)方法和提取工藝，但現(xiàn)有技術(shù)不能指證絞股藍(lán)發(fā)揮神奇療效僅因?yàn)楹腥藚⒃碥誖b1成分。在今后的進(jìn)一步研究中，還需綜合考慮絞股藍(lán)皂苷中的其他成分對(duì)人參皂苷Rb1的相互影響，以期找到更完善的絞股藍(lán)皂苷制備工藝。

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